產(chǎn)氣莢膜梭菌群體感應(yīng)系統(tǒng)研究進(jìn)展

賀 曦，冶貴生

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens，Cp)是一種可產(chǎn)芽孢、形成生物被膜的革蘭氏陽性條件致病菌，普遍存在于自然環(huán)境中，尤其是在人和動物腸道內(nèi)、土壤中。Cp通過產(chǎn)生20多種毒素及胞外酶，引起牛、羊、雞等畜禽的腸道和組織感染，導(dǎo)致胃腸道綜合征、腸毒素血癥[1-2]、氣性壞疽[3]、組織毒性感染[4-5]，另一方面Cp可引起人類食物中毒[6]。先前研究表明，Cp不僅能單獨(dú)引起感染，且不同源Cp之間可聯(lián)合感染，還能與其他常見致病菌混合感染，致病后發(fā)病快、病程短、發(fā)病率和死亡率都極高[7]。Cp感染對畜牧業(yè)發(fā)展危害嚴(yán)重，更是引起人類患?xì)庑詨木业闹饕≡?，引起各界廣泛關(guān)注。不少學(xué)者通過對其致病性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Cp存在調(diào)控毒素分泌和生物膜形成等致病相關(guān)基因的群體感應(yīng)系統(tǒng)。

群體感應(yīng)(Quorum Sensing，QS)是細(xì)菌進(jìn)行不同細(xì)胞間通信的過程，細(xì)菌通過感應(yīng)周圍環(huán)境中信號分子的濃度，來感知周圍細(xì)菌密度，當(dāng)濃度達(dá)到一定閾值時，進(jìn)一步來調(diào)節(jié)自身生理行為，在細(xì)菌濃度低時不具備該特征。QS系統(tǒng)這一概念于1994年被Fuqua等[8]首次提出，后續(xù)研究證明在革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌中均存在該系統(tǒng)，如金黃色葡萄球菌中的Agr系統(tǒng)[9]、銅綠假單胞菌中的las系統(tǒng)[10]、白色念珠菌中以金合歡醇(Farnesol)為信號分子的QS系統(tǒng)等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，QS系統(tǒng)與細(xì)菌的生長繁殖、生物膜形成、毒素分泌和生物發(fā)光等生理活動密切相關(guān)，也是細(xì)菌致病必不可少的系統(tǒng)之一。本文將主要介紹Cp中已發(fā)現(xiàn)的QS系統(tǒng)類型、不同QS系統(tǒng)對該菌毒素分泌和生物膜形成等致病相關(guān)因子的調(diào)控作用。以期為Cp QS系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制提供系統(tǒng)性認(rèn)識，同時可進(jìn)一步為制定該致病菌感染所引發(fā)的相關(guān)疾病預(yù)防措施提供研究方向。

1 產(chǎn)氣莢膜梭菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)

Cp作為革蘭氏陽性條件致病菌，至少存在兩種QS系統(tǒng)，目前發(fā)現(xiàn)的有Agr系統(tǒng)和LuxS/AI-2型QS系統(tǒng)。Agr系統(tǒng)通常是一個包含4個基因的操縱子，主要參與調(diào)控細(xì)菌毒素的表達(dá)[10]、毒力因子的產(chǎn)生以及生物膜的形成等[12]。Cp的Agr(CpAL)系統(tǒng)同樣包含4個基因[13-14]，其中研究較多的為編碼AgrB膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和編碼AgrD肽(信號肽前體物質(zhì))的基因[15]，該系統(tǒng)操縱子中的另外兩個上游基因功能尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。CpAL系統(tǒng)的agrB、agrD基因與其他革蘭氏陽性菌同源[16]，且在不同型Cp分離株也已證實(shí)了這兩個基因的存在[17]。CpAL系統(tǒng)以自誘導(dǎo)肽(Autoinducing peptides，AIP)作為信號分子，首先由agrD基因編碼合成AIP前體肽，該肽轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜經(jīng)agrB基因編碼的跨膜蛋白加工、修飾成具有活性的AIP信號分子[18]，然后分泌到胞外，在胞外累積達(dá)到一定閾值激活下游通路，進(jìn)而調(diào)控下游基因表達(dá)。Ma等[19]通過對比不同細(xì)菌產(chǎn)生的AIP分子結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)菌產(chǎn)生的AIP分子間存在結(jié)構(gòu)差異，CpAL系統(tǒng)產(chǎn)生的AIP分子是一個無尾的五元硫代內(nèi)酯環(huán)[20]，與金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的AIP分子有所不同，但目前對不同型Cp所產(chǎn)生的AIP分子詳細(xì)結(jié)構(gòu)描述較少，各菌株間AIP分子的比較目前尚未見報道，推測不同型Cp產(chǎn)生的AIP分子也可能存在種內(nèi)差異。

Cp的另一個QS系統(tǒng)是以自誘導(dǎo)物-2(Autoinducer 2，AI-2)為信號分子的LuxS/AI-2系統(tǒng)，該系統(tǒng)首次發(fā)現(xiàn)于哈維氏弧菌中[21]，是革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌共有的，被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)細(xì)菌跨物種交流的媒介。AI-2信號分子是甲基循環(huán)中的副產(chǎn)物，其生物合成途徑高度保守，由LuxS蛋白催化合成前體物4,5-二羥基-2,3-戊二酮[(4S)-4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD]，DPD通過化學(xué)鍵的重新排列形成不同構(gòu)象的AI-2分子[22]，因此AI-2是指幾種不同構(gòu)象的小分子混合物。另外，不同細(xì)菌中AI-2的受體不同，一種細(xì)菌所產(chǎn)生的AI-2分子能自發(fā)環(huán)化成可被其他細(xì)菌識別的活化形式，這證實(shí)了LuxS/AI-2系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的種間交流。該系統(tǒng)在細(xì)菌中廣泛存在，參與細(xì)胞代謝，對致病菌的許多重要毒性因子表達(dá)都存在調(diào)控作用，對Cp也具有重要調(diào)控作用。

2 產(chǎn)氣莢膜梭菌QS系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制

Cp的QS系統(tǒng)并不是單獨(dú)作用的，常與其他系統(tǒng)聯(lián)合調(diào)控多種外毒素的分泌、生物被膜的形成、芽孢的產(chǎn)生、菌毛的活動及滑動運(yùn)動等生物學(xué)性狀。研究表明，CpAL系統(tǒng)通常與雙組份系統(tǒng)協(xié)同發(fā)揮作用，LuxS/AI-2系統(tǒng)則可通過影響代謝相關(guān)基因表達(dá)而影響毒力因子的表達(dá)。Cp的兩個QS系統(tǒng)對毒力相關(guān)因子的調(diào)控機(jī)制錯綜復(fù)雜，并且存在相互交叉的影響，目前具體的機(jī)制尚未明確，仍需大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)各系統(tǒng)間的級聯(lián)關(guān)系。最近的研究強(qiáng)調(diào)了CpAL系統(tǒng)與LuxS/AI-2系統(tǒng)在調(diào)節(jié)毒素產(chǎn)生和毒力方面的重要性。本文重點(diǎn)對這兩個系統(tǒng)調(diào)節(jié)毒力相關(guān)表達(dá)的調(diào)控進(jìn)行討論。

2.1 Cp QS系統(tǒng)對毒素因子的調(diào)控 CpAL系統(tǒng)與LuxS/AI-2系統(tǒng)均對其毒力相關(guān)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用，其中CpAL系統(tǒng)是該菌毒力產(chǎn)生最重要的調(diào)控系統(tǒng)[23]，與VirS/VirR雙組份系統(tǒng)協(xié)同作用，參與調(diào)節(jié)Cp菌大多數(shù)外毒素的產(chǎn)生[24]，包括CPA、PFO、CPB、CPB2、CPE、ETX、NetB毒素的生成[25-26]，此外，該系統(tǒng)還可通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的CPB毒素水平，在兔回腸袢中引起壞死性腸炎[27]。另有資料顯示，不同型菌株的CpAL系統(tǒng)對毒力因子的調(diào)控有所不同，早期的研究證明CpAL系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)A型、C型及D型Cp所有毒素的產(chǎn)生，近年來發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)在B型和G型Cp中也存在調(diào)控作用。不同的是，B型Cp的ETX產(chǎn)量不受CpAL系統(tǒng)的影響，而D型菌株的ETX產(chǎn)量受CpAL系統(tǒng)的影響[28]。事實(shí)上，CpAL系統(tǒng)對不同型菌株毒素表達(dá)的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，盡管這些菌株具有相同的調(diào)節(jié)基因和毒素基因，但它們之間的調(diào)控也存在一些差異，推測這種差異可能是由于不同型Cp中各類毒素的含量不同所引起的，具體因素還需更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行論證。

LuxS/AI-2系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)Cp部分毒素的產(chǎn)生。其中AI-2分子作為種間通信重要的信號分子，luxS基因通過產(chǎn)生AI-2分子，調(diào)節(jié)Cp中毒素基因的表達(dá)。因此，luxS基因被認(rèn)為是致病菌的治療靶點(diǎn)[29]。Ohtani等[30]通過構(gòu)建CpluxS缺失株，發(fā)現(xiàn)plc和colA基因的轉(zhuǎn)錄水平在對數(shù)早期被降低，而pfoA基因的轉(zhuǎn)錄水平在對數(shù)的早期至晚期均被降低，CPA等毒素的產(chǎn)生水平降低；并且luxS缺失株通過添加野生型上清液或大腸桿菌上清液，luxS突變體的pfoA轉(zhuǎn)錄水平恢復(fù)至野生狀態(tài)。以上結(jié)果顯示AI-2在Cp毒素產(chǎn)生中的重要作用，同時luxS基因可單獨(dú)負(fù)責(zé)群體感應(yīng)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在A型Cp感染機(jī)體引起氣性壞疽的過程中，LuxS/AI-2系統(tǒng)可正向調(diào)節(jié)CPA和PFO毒素的產(chǎn)生[31]，但該系統(tǒng)并不參與調(diào)節(jié)C型Cp引起的壞死性腸炎中CPB的產(chǎn)生[32]。針對不同Cp的LuxS/AI-2系統(tǒng)對不同毒素的調(diào)控不同，這將提示LuxS/AI-2系統(tǒng)在Cp感染中具有重要意義。

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌QS系統(tǒng)對生物膜形成的調(diào)控 生物膜(Biofilm，BF)指細(xì)菌通過分泌多糖基質(zhì)和脂質(zhì)蛋白等混合物黏附于接觸表面，形成一個有機(jī)械穩(wěn)定性的三維聚合網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)細(xì)菌在不利壓力環(huán)境中的抵抗力，如有毒化合物的傷害、低營養(yǎng)環(huán)境[33]、致死劑量的抗生素[34]及其他不利條件[35]，是細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境的一種生命現(xiàn)象。Cp生物膜形成的調(diào)節(jié)是一種復(fù)雜的機(jī)制，生物膜形成后極大地提高了該菌對抗生素和環(huán)境壓力的耐受性，同時在生物膜結(jié)構(gòu)中毒素基因的轉(zhuǎn)錄水平有所增加，從而增加了致病的可能性[36]。Aguayo-Acosta等[37]在對CpAL系統(tǒng)和LuxS/AI-2系統(tǒng)以及QS調(diào)節(jié)因子在控制生物膜形成的作用中發(fā)現(xiàn)，ΔagrB突變株中Agr系統(tǒng)相關(guān)基因在隨后的幾小時內(nèi)表達(dá)下調(diào)，并且不能產(chǎn)生生物膜，但ΔluxS突變株生物膜的產(chǎn)生達(dá)到野生株水平，說明CpAL系統(tǒng)在生物膜形成過程中是非常重要的。在其他的研究發(fā)現(xiàn)，A型(S13)或C型(CN3685)Cp中，Δcpa和ΔpfoA突變體無法產(chǎn)生生物膜，基因回補(bǔ)后菌株恢復(fù)了生物膜形成的能力；而CN3685Δcpb對生物膜形成沒有影響。因此，已經(jīng)明確CPA和PFOA與Cp生物膜的形成具有相關(guān)性，CpAL系統(tǒng)可能通過調(diào)節(jié)毒素的分泌量，來影響生物膜的形成，推測其他毒素與生物膜形成也存在相關(guān)性。但目前對于Cp生物膜的結(jié)構(gòu)尚未完全明確，未來還需要深入研究。

2.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌QS系統(tǒng)對其他表型的調(diào)控 QS系統(tǒng)還對Cp的一些毒力因子具有調(diào)控功能，如孢子形成、滑行運(yùn)動等。孢子的形成在Cp的致病性中具有重要作用，它使致病菌在極端條件下能夠存活。目前普遍認(rèn)為孢子對Cp引起的氣性壞疽、壞死性腸炎和食物中毒等疾病的傳播具有重要性，同時對調(diào)節(jié)毒素的產(chǎn)生也很重要，其中CPE的合成發(fā)生在孢子形成期間。Cp孢子的形成是個復(fù)雜的過程，受多種機(jī)制的調(diào)控，CpAL系統(tǒng)能通過感應(yīng)周圍環(huán)境中的種群密度調(diào)控孢子形成[38]。在CpF5603中，agrB基因缺失后孢子形成減少約1 500倍，基因互補(bǔ)后孢子形成增加[39]。在F型菌株中，CpAL系統(tǒng)可誘導(dǎo)激活CPE進(jìn)一步調(diào)控孢子形成[40]。但目前對于這方面的研究報道較少，可作為未來研究方向。

QS系統(tǒng)還參與調(diào)控Cp的運(yùn)動，目前已明確由CpAL系統(tǒng)參與調(diào)控Cp滑動相關(guān)的分子機(jī)制?；瑒舆\(yùn)動是指細(xì)菌在感染組織上的快速發(fā)展，類似于滑動的運(yùn)動[41]，是一種協(xié)調(diào)良好的主動運(yùn)動機(jī)制，過程需消耗能量[42]。絕大多數(shù)梭菌具有鞭毛，并通過鞭毛產(chǎn)生運(yùn)動，Cp由于缺乏鞭毛，僅依靠細(xì)菌細(xì)胞膜上的Ⅳ型菌毛在半固體介質(zhì)表面滑動[43]，目前在可引起壞死性腸炎、氣性壞疽及食物中毒的Cp中均發(fā)現(xiàn)了滑動運(yùn)動[44-45]?；瑒舆\(yùn)動需要完整的CpAL系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)ΔagrB缺失株的滑動功能受損，基因回補(bǔ)后滑動能力恢復(fù)至野生水平[46]。另一方面，CpAL系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)溶血素PFO和CPA的產(chǎn)生，并控制Cp的滑動運(yùn)動，具有Agr系統(tǒng)缺陷的菌株不能滑動，也不能進(jìn)行溶血[47]。以上證明PFO的產(chǎn)生與滑動運(yùn)動之間存在直接相關(guān)性，CpAL系統(tǒng)作為中央調(diào)控網(wǎng)絡(luò)將滑動運(yùn)動與PFO的產(chǎn)生聯(lián)系起來，這一結(jié)論也在金黃色葡萄球菌中得到驗(yàn)證[48]。目前Cp中各表型間調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，關(guān)于滑動運(yùn)動是否對其他毒素的轉(zhuǎn)錄具有影響還需深入研究。

3 小結(jié)與展望

Cp能引起多種病癥，盡管一些Cp引起的胃腸炎可自行好轉(zhuǎn)，但另一些菌株能引起嚴(yán)重疾病，甚至造成死亡，是造成臨床上氣性壞疽最多的病原菌。目前Cp在腸道、土壤、污水中均能被檢測到，并且無有效治療方案，給畜牧業(yè)發(fā)展及人類安全造成了潛在威脅。Cp能通過產(chǎn)生孢子抵御惡劣環(huán)境，形成生物膜增強(qiáng)粘附性和致病性，直接產(chǎn)生毒素引發(fā)疾病，QS系統(tǒng)作為Cp重要的調(diào)控系統(tǒng)之一，參與調(diào)控絕大部分致病相關(guān)生物學(xué)性狀，為此研究該菌的QS系統(tǒng)具有重要意義。

鑒于上述的QS系統(tǒng)在Cp運(yùn)動及毒力因子表達(dá)中的關(guān)鍵作用，抑制Cp的QS系統(tǒng)的功能，將有極大可能干擾該菌的運(yùn)動性、黏附定植、以及致病性，從而達(dá)到抑制Cp感染的目的。因此，以QS系統(tǒng)為靶標(biāo)，通過抑制其信號分子合成、系統(tǒng)中關(guān)鍵基因的表達(dá)都可能是抗Cp感染的一種潛在的治療策略。但到目前為止，有關(guān)Cp的QS系統(tǒng)的研究還不夠深入，尤其不同菌株產(chǎn)生的AIP分子的區(qū)別尚未明確，CpAL系統(tǒng)對其他毒素與生物膜形成的相關(guān)性也還未清楚，同時Cp的QS系統(tǒng)抑制劑相關(guān)的研究報道也較少，因此未來應(yīng)致力于全面深入研究Cp的QS系統(tǒng)的調(diào)控，繪制完整的QS系統(tǒng)，為今后尋找安全有效的QS系統(tǒng)抑制劑，開發(fā)Cp新的抗感染療法提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無