超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)人血清5種甾體激素方法學(xué)及生物參考區(qū)間的建立

陸優(yōu)麗，楊雙雙，張美微，歐美賢，董春霞，沈薇薇，姜鳳麗，李水軍

（上海藥物Ⅰ期臨床暨藥物一致性評(píng)價(jià)工程技術(shù)研究中心 上海市臨床質(zhì)譜研究所上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐匯醫(yī)院，上海 200031）

甾體激素又稱類固醇激素，是一類親脂性、低相對(duì)分子質(zhì)量的化合物，其結(jié)構(gòu)以環(huán)戊烷多氫菲母核為基礎(chǔ)。甾體激素在人體內(nèi)可通過酶的作用相互轉(zhuǎn)化，在調(diào)節(jié)免疫、維持機(jī)體發(fā)展及生長(zhǎng)發(fā)育等人體正常的生理生化活動(dòng)中起著重要作用[1-2]。甾體激素根據(jù)功能的不同主要分為腎上腺皮質(zhì)激素和性激素兩大類，其中性激素又分為雄激素、雌激素和孕激素。睪酮（testosterone，T）、雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）、雄烯二酮（androstenedione，AD）、脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是人體內(nèi)主要的雄激素，雄激素濃度的異常變化與疾病的發(fā)生密切相關(guān)：前列腺癌的形成最初依賴于T、DHT、AD、DHEA，并由雄激素受體信號(hào)軸介導(dǎo)，因此雄激素剝奪療法是局限性晚期或轉(zhuǎn)移性前列腺癌的主要臨床治療方法，雄激素水平的準(zhǔn)確測(cè)定也是判斷雄激素是否缺乏的重要依據(jù)；性激素與肥胖有關(guān)，雄激素缺乏會(huì)導(dǎo)致肌肉質(zhì)量、體積和力量的下降，是身體脂肪增加的主要原因，可導(dǎo)致性功能的下降[3-5]。《腎上腺皮質(zhì)癌診治專家共識(shí)》[6]指出，雄激素的水平（如高濃度的DHEA）或分泌方式（如同時(shí)分泌雄激素和皮質(zhì)醇）可能提示惡性病變，可用于臨床相關(guān)疾病的輔助診斷。有研究結(jié)果表明，多囊卵巢綜合征的發(fā)病與雄激素過多有關(guān)[7]，同時(shí)檢測(cè)多種雄激素水平較檢測(cè)單項(xiàng)激素水平具有更高的診斷特異性[8]。17α羥孕酮（17alphahydroxyprogesterone，17OHP）可用于排除非典型腎上腺增生引起的雄激素升高，亦是鑒別診斷多囊卵巢綜合征的必要檢測(cè)指標(biāo)之一[5]，同時(shí)檢測(cè)T、DHT、AD、DHEA和17OHP是輔助和鑒別診斷多囊卵巢綜合征快速而有效的方法。

目前，仍有較多實(shí)驗(yàn)室采用免疫學(xué)方法進(jìn)行甾體激素的檢測(cè)[9-10]，而免疫學(xué)方法因特異性差，容易受到人體內(nèi)多種激素的交叉干擾，易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果[11]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）因檢測(cè)靈敏度高、特異性好，在小分子生物標(biāo)志物的檢測(cè)中具有突出優(yōu)勢(shì)，更被認(rèn)為是甾體激素檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[12-13]?！抖嗄衣殉簿C合征中國(guó)診療指南》[14]建議聯(lián)合檢測(cè)多種甾體激素，以達(dá)到較好的特異性和準(zhǔn)確性。然而，我國(guó)同時(shí)檢測(cè)T、DHT、AD、DHEA、17OHP這5種甾體激素的研究報(bào)道較少。劉琪等[15]運(yùn)用液液萃取法建立了一種可同時(shí)檢測(cè)18種類固醇激素的LC-MS/MS方法，但未對(duì)干擾物進(jìn)行驗(yàn)證；曹正等[7]建立了同時(shí)檢測(cè)T、DHT、AD、DHEA和17OHP的方法，但未進(jìn)行干擾物和基質(zhì)效應(yīng)的性能驗(yàn)證；且這2項(xiàng)研究均未進(jìn)行基于中國(guó)人群的生物參考區(qū)間的研究[7，15]。本研究旨在建立可同時(shí)檢測(cè)人血清中T、DHT、AD、DHEA和17OHP的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）方法，并進(jìn)行全面的性能驗(yàn)證；同時(shí)，通過檢測(cè)上海地區(qū)表觀健康成年人血清中5種甾體激素的水平，建立適用于上海地區(qū)的血清T、DHT、AD、DHEA和17OHP的參考區(qū)間。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）C28-A3C文件[16]要求，從體檢人群中篩選符合要求的研究對(duì)象，共納入368名表觀健康者，其中男120名、女248名，年齡16～100歲。本研究獲得上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：無5種甾體激素異常相關(guān)疾病，無糖尿病、高血壓、腫瘤、冠心病、多囊卵巢綜合癥、月經(jīng)不調(diào)、骨質(zhì)疏松癥等相關(guān)病史及癥狀；體檢結(jié)果正常，血常規(guī)、尿常規(guī)、血清學(xué)檢查和肝功能、腎功能、血糖、血脂、腫瘤標(biāo)志物等檢測(cè)結(jié)果均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：近期妊娠、哺乳期、大量飲酒、近期或長(zhǎng)期獻(xiàn)血、輸血、接受手術(shù)者以及溶血、脂血等質(zhì)量不合格樣本。

1.2 血清樣本采集與保存

采集所有研究對(duì)象晨起空腹前臂靜脈全血，1 200×g離心10 min，分離血清，保存于2 mL離心管中，-70 ℃冷凍保存待測(cè)。

1.3 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

分析物T（純度為99.54%）、DHT（純度為99.80%）、AD（純度為99.44%）、DHEA（純度為99.87%）、17OHP（純度為96.40%）、T-d3、DHT-d3、AD-13C3、DHEA-d5、17OHP-d8（純度均＞97.00%）及內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Cerilliant公司。甲酸、甲醇、乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)TEDIA公司） ；氨水（色譜純?cè)噭袊?guó)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；30%脂肪乳注射液（C14～C24，無錫費(fèi)森尤斯卡比華瑞制藥有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為本實(shí)驗(yàn)室采用Millipore純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司） 自制。

1.4 主要儀器與耗材

API 4000串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）；LC-30AD高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；色譜柱為Poroshell 120 EC-C18（2.1×100 mm，2.7 μm，美國(guó)Agilent公司）；Vortex Genie2 渦旋混合器（ 美國(guó)Scientific Industries公司） ；Mikro22R冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司） ；移液器（ 德國(guó)Eppendorf公司）；固相微萃取小柱為SOLAμ HRP（2 mg/mL 96 well plate，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.5 溶液配制

因無法得到人空白血清基質(zhì)，故用活性炭吸附過的小牛血清替代人血清作為空白基質(zhì)，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制和稀釋實(shí)驗(yàn)中的稀釋液，質(zhì)控樣本和回收率、基質(zhì)效應(yīng)等的考察使用含本底的混合人血清樣本。

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控添加液的配制 用50%甲醇將（T、AD、17OHP）/DHT/DHEA儲(chǔ)備液配制成混合工作液，并按比例稀釋，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線添加液和低、中、高濃度的質(zhì)控添加液。詳細(xì)分析物濃度見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線添加液和質(zhì)控添加液配制濃度 ng/mL

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控品的配制 準(zhǔn)確吸取500 μL活性炭吸附過的小牛血清，加入5 μL標(biāo)準(zhǔn)曲線添加液中，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品；準(zhǔn)確吸取500 μL混合人血清，加入5 μL質(zhì)控品添加液中，得到質(zhì)控品。

1.5.3 內(nèi)標(biāo)工作液的配制 將T-d3、AD-13C3、17OHP-d8、DHT-d3和DHEA-d5儲(chǔ)備液用50%甲醇稀釋，配制成濃度為10、20、20、40、100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液，待用。

1.6 樣本前處理

將待測(cè)人血清樣品和配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)控品和內(nèi)標(biāo)工作液取出，室溫平衡，檢測(cè)前混勻。取500 μL人血清樣品（另補(bǔ)充5 μL 50%甲醇）、505 μL標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和質(zhì)控品，分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋震蕩5 min混勻，再加入500 μL甲醇沉淀，震蕩5 min，22 136×g離心10 min，棄上清，分別加入500 μL 2%氨水和3.5 mL 2%氨水-10%甲醇，混勻，上樣至固相萃取小柱。固相萃取小柱操作步驟：（1）700 μL甲醇活化；（2）700 μL 10%甲醇-2%氨水平衡；（3）上樣；（4）700 μL 40%甲醇清洗2次；（5）50 μL甲醇洗脫2次（每步操作壓力均控制在30 psi以內(nèi)）。將洗脫下來的溶液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣管中，加入20 μL水混勻后進(jìn)行分析，進(jìn)樣體積為30 μL。

1.7 液相色譜條件

采用Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）。流動(dòng)相A為0.05%甲酸-30%乙腈水溶液，流動(dòng)相B為0.05%甲酸-90%乙腈溶液。梯度洗脫程序：0.00 min（0%B），0.1～7.00 min（35%B），7.01～9.00 min（100%B），9.01～12.00 min（0%B）。流速為0.3 mL /min，持續(xù)12 min，進(jìn)樣體積為30 μL。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃。

1.8 質(zhì)譜條件

用電噴霧離子源在正離子掃描模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式分析，掃描間隔為5 ms。霧化氣（Gas1）60 psi，輔助氣（Gas2）70 psi，氣簾氣（CUR）30 psi，碰撞氣（CAD）12 psi，離子源溫度為550 ℃。分析物的具體質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 分析物質(zhì)譜參數(shù)

1.9 方法學(xué)驗(yàn)證

1.9.1 殘留評(píng)價(jià) 在標(biāo)準(zhǔn)曲線最高濃度點(diǎn)樣品進(jìn)樣完成后，進(jìn)1針空白樣品，考察是否存在殘留。以分析物保留時(shí)間處的峰面積不超過最低定量檢測(cè)限（lower limit of quantification，LLOQ）的20.0%，內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間處的峰面積不超過內(nèi)標(biāo)峰面積的5.0%為進(jìn)樣無殘留。

1.9.2 準(zhǔn)確度與精密度 準(zhǔn)確吸取505 μL低、中、高濃度質(zhì)控品和用于配制該質(zhì)控品的混合人血清，按預(yù)處理方法各進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定質(zhì)控品各個(gè)分析物的濃度，計(jì)算批內(nèi)準(zhǔn)確度和精密度。連續(xù)制備3批質(zhì)控品，考察批間準(zhǔn)確度和精密度。計(jì)算公式：準(zhǔn)確度=（實(shí)際測(cè)定值-本底值）/理論添加值×100%，精密度[以（變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示]=標(biāo)準(zhǔn)偏差/測(cè)定濃度平均值×100%。

1.9.3 稀釋實(shí)驗(yàn) 在混合的人血清基質(zhì)中加入工作液配成最高定量檢測(cè)限（upper limit of quantification，ULOQ）和5倍的ULOQ樣本，用活性炭吸附過的小牛血清作為稀釋液分別稀釋2倍和10倍，至ULOQ濃度的1/2，按預(yù)處理方法處理后進(jìn)樣分析，考察6份稀釋樣本的準(zhǔn)確度和精密度。

1.9.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率 取5份不同來源的人血清各500 μL，加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，按預(yù)處理方法處理，100 μL甲醇洗脫后加15 μL 50%甲醇水溶液和5 μL蒸餾水，混勻，進(jìn)樣（A1/IS1）。取同樣來源的人血清500 μL，分別加入5 μL低、中、高3種濃度的質(zhì)控添加液，再加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，按預(yù)處理方法處理，100 μL甲醇洗脫后加15 μL 50%甲醇水溶液和5 μL蒸餾水，混勻，進(jìn)樣（A2/IS2）。取同樣來源的人血清500 μL，不加內(nèi)標(biāo)，按預(yù)處理方法處理，100 μL甲醇洗脫后分別添加5 μL低、中、高3種濃度的質(zhì)控添加液、10 μL內(nèi)標(biāo)工作液和5 μL蒸餾水，混勻，進(jìn)樣（A3/IS3）。另取100 μL甲醇，分別加入5 μL低、中、高3種濃度的質(zhì)控添加液、10 μL內(nèi)標(biāo)工作液和5 μL蒸餾水，混勻，進(jìn)樣（A4/IS4）。以上樣品重復(fù)測(cè)定3次，分別得出分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積。計(jì)算公式：分析物基質(zhì)效應(yīng)=（A3峰面積-A1峰面積）/A4峰面積，內(nèi)標(biāo)校正的基質(zhì)效應(yīng)=分析物基質(zhì)效應(yīng)×IS4峰面積/IS3峰面積，分析物提取回收率（%）=（A2峰面積-A1峰面積）/（A3峰面積-A1峰面積）×100%，內(nèi)標(biāo)提取回收率（%）=IS2峰面積 / IS3峰面積×100%。

1.9.5 選擇性 盡管LC-MS/MS技術(shù)在特異性和選擇性方面優(yōu)于其他檢測(cè)技術(shù)，但甾體激素種類豐富，血清中其他內(nèi)源性結(jié)構(gòu)類似物可能會(huì)對(duì)分析產(chǎn)生潛在干擾；此外，溶血和脂血也可能影響檢測(cè)結(jié)果。因此，本研究評(píng)估了UPLCMS/MS對(duì)結(jié)構(gòu)類似的甾體激素、溶血、脂血等的抗干擾能力。

（1）干擾物。將可能干擾甾體激素檢測(cè)結(jié)果的分析物加入混合人血清中，并配置低值和高值質(zhì)控品，測(cè)定待測(cè)物濃度，與未添加干擾物的質(zhì)控品比較，計(jì)算結(jié)果的偏差。干擾物（血清濃度，根據(jù)參考區(qū)間上限或上限的10倍濃度確定加入量）包括孕酮（100 ng/mL）、雌二醇（4 ng/mL）、雌酮（2 ng/mL）、孕烯醇酮（30 ng/mL）、17羥基孕烯醇酮（100 ng/mL）、皮質(zhì)醇（100 ng/mL）、可的松（100 ng/mL）。

（2）溶血。收集3份不同來源的全血樣本，各取2 mL血清，分別加入40 μL（2%）對(duì)應(yīng)的血細(xì)胞，通過超聲處理使血細(xì)胞完全破碎后，各取510 μL，按前處理方法處理后測(cè)定其濃度，將結(jié)果與對(duì)應(yīng)的無溶血的血清樣本濃度進(jìn)行比較，計(jì)算偏差。

（3）脂血。收集3份不同來源的全血樣本，各取2 mL血清，分別加入10、20、40 μL（0.5%、1.0%、2.0%）的脂肪乳，振蕩混勻，得到高三酰甘油血清樣本，測(cè)定其三酰甘油濃度依次為4.58、6.65、10.79 mmol/L，各取510 μL，按前處理方法處理后，測(cè)定其中的甾體激素濃度，考察高三酰甘油對(duì)激素測(cè)定是否有干擾。

1.9.6 穩(wěn)定性 收集6名體檢人員（男、女各3名）的血清樣本，每份樣本分裝成3份，分別考察其室溫（25 ℃）放置4、24 h；-25～-15 ℃放置30、100 d，以及-90～-70 ℃放置30、100 d的穩(wěn)定性。

1.10 參考區(qū)間的建立

采用UPLC-MS/MS檢測(cè)368名表觀健康者的血清T、DHT、AD、DHEA和17OHP水平，并建立參考區(qū)間。采用UPLC-MS/MS檢測(cè)368名表觀健康者血清T、DHT、AD、DHEA和17OHP水平，并建立參考區(qū)間。按性別和年齡（16～20歲、21～30歲、31～40歲、51～60歲、＞61歲）分別分組。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Dixon法剔除離群值。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Q-Q圖結(jié)合Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用方差分析，采用±1.96s方式建立參考區(qū)間。呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Kruskal-Walli檢驗(yàn)，采用百分位數(shù)法（P2.5～P97.5）建立參考區(qū)間。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分離條件的摸索與優(yōu)化

甾體激素在人體內(nèi)含量低，人血清經(jīng)蛋白沉淀后再用固相萃取柱純化濃縮，可以有效減小基質(zhì)對(duì)分析測(cè)定的干擾，提高激素的檢測(cè)靈敏度。使用Poroshell 120 EC-C18色譜柱，用含甲酸的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，可以較好地分離T、DHT、AD、DHEA和17OHP，峰形好，且靈敏度高。優(yōu)化后的分析物及對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的色譜圖見圖1。

圖1 人血清樣本中T、DHT、AD、DHEA及17OHP及其對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)、空白替代基質(zhì)典型色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限

以標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品分析物的濃度為X軸，分析物峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y軸，用最小二乘法1/x權(quán)重進(jìn)行線性回歸，得到T、DHT、AD、DHEA、17OHP的回歸方程分別為：Y=0.004 89X+0.029（r2=0.999 6）、Y=1.67X+0.007（r2=0.999 5）、Y=2.05X+0.005（r2=0.999 8）、Y=0.28X+0.011（r2=0.999 8）、Y=2.51X+0.015（r2=0.999 9），線性關(guān)系良好。T、DHT、AD、DHEA和17OHP的最低定量限分別為0.01、0.02、0.01、0.10和0.01 ng/mL。

2.3 殘留評(píng)價(jià)

計(jì)算結(jié)果顯示，5種甾體激素各分析物保留時(shí)間處峰面積均不超過最低定量限LLOQ的20%，且內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間處的峰面積不超過內(nèi)標(biāo)峰面積的5%，表明進(jìn)樣無明顯殘留。

2.4 準(zhǔn)確度、精密度和稀釋實(shí)驗(yàn)

5種甾體激素3個(gè)批次的準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定低、中、高濃度質(zhì)控樣品的批內(nèi)平均準(zhǔn)確度均為96.6%～105.6%，CV均＜8%；批間準(zhǔn)確度為95.0%～105.2%，批間CV均＜6%。稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5倍ULOQ以內(nèi)的樣本稀釋10倍后，采用本方法檢測(cè)，準(zhǔn)確度為86.16%～103.60%，CV＜5%，本方法的可報(bào)告范圍可覆蓋5 000倍。見表3。

表3 批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度與精密度

2.5 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

5種甾體激素均存在一定程度的基質(zhì)抑制，經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后，T、DHT、AD、DHEA和17OHP的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)分別為0.945 3、1.005 0、1.003 0、0.966 9和1.009 0，表明同位素內(nèi)標(biāo)可校正基質(zhì)效應(yīng)。此外，各分析物及內(nèi)標(biāo)在血清中的提取回收率均＞60%。見表4。

表4 5種甾體激素基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

2.6 選擇性

干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8種潛在干擾物對(duì)甾體激素檢測(cè)結(jié)果的偏差為-9.90%～2.72%，均在可接受范圍內(nèi)。溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，含有2%溶血細(xì)胞的血清樣本T、DHT、AD和17OHP測(cè)定結(jié)果的偏差為1.93%～9.49%，無明顯影響，但會(huì)導(dǎo)致DHEA測(cè)定結(jié)果偏低18.65%。高三酰甘油對(duì)5種甾體激素的測(cè)定結(jié)果偏差為0.15%～12.54%，對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾。

2.7 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清樣本室溫放置24 h，除DHEA濃度下降-37.33%外，其他4種甾體激素均較穩(wěn)定；此外，血清樣本分別在-25～-15 ℃和-90～-70 ℃下凍存100 d，檢測(cè)結(jié)果偏差均＜±15%。見表5。

表5 5種甾體激素不同溫度放置不同時(shí)間對(duì)血清樣本穩(wěn)定性（相對(duì)偏差）的影響 %

2.8 室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

采用本研究建立的UPLC-MS/MS方法參加2019年國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心全國(guó)內(nèi)分泌正確度驗(yàn)證質(zhì)譜法調(diào)查，結(jié)果顯示，T、17OHP 2個(gè)項(xiàng)目測(cè)定結(jié)果與靶值的偏差為-5.00%～0.38%，均在可接受的范圍內(nèi)，合格率為100%。相關(guān)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果見表6。

表6 2019年國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心T、17OHP相關(guān)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

2.9 參考區(qū)間

2.9.1 離群值 采用Dixon法在女性研究對(duì)象T測(cè)定值中發(fā)現(xiàn)1個(gè)離群值（8.8 ng/mL），與相鄰值的D為8.1 ng/mL，R為8.73，D/R=0.93＞1/3。故最終有367名研究對(duì)象納入本研究。

2.9.2 不同性別、年齡表觀健康者5種甾體激素水平比較 男、女性血清T、DHT、AD、DHEA和17OHP水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此需按性別建立不同的參考區(qū)間。男性5個(gè)年齡段之間血清T、DHT、AD、DHEA和17OHP水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），因此將男性不同年齡段合并后建立統(tǒng)一的參考區(qū)間。16～20歲、21～30歲和31～40歲女性血清T、DHT、AD、DHEA和17OHP水平與51～60歲、＞61歲女性比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而16～20歲、21～30歲、31～40歲女性之間和51～60歲、＞61歲女性之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此女性按16～50歲和＞50歲分別建立參考區(qū)間。見表7。

表7 不同性別及年齡的表觀健康者5種甾體激素比較

2.9.3 參考區(qū)間建立 正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，1 6～5 0歲女性血清D H T水平呈正態(tài)分布（P=0.200），男性和＞50歲女性血清T、AD、DHT、DHEA和17OHP水平均呈非正態(tài)分布（P＜0.05）。采用不同方式建立的參考區(qū)間見表8。

表8 5種甾體激素的參考區(qū)間

3 討論

本研究建立了一種選擇性高、準(zhǔn)確好的檢測(cè)血清5種甾體激素（T、AD、DHT、DHEA和17OHP）的UPLC-MS/MS方法。血清樣品經(jīng)甲醇沉淀等前處理后，用SOLAμ HRP固相萃取小柱純化，可以有效除去雜質(zhì)干擾。各激素用其對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)，可減小基質(zhì)干擾和前處理損失的影響，提高定量的準(zhǔn)確度。本研究建立的LC-MS/MS檢測(cè)方法可排除其他結(jié)構(gòu)類似的內(nèi)源性激素的干擾，各激素檢測(cè)的線性范圍達(dá)到1 000倍，r2值均＞0.999 5，可報(bào)告范圍達(dá)到5 000倍，在生理和病理濃度下均可被準(zhǔn)確檢出。LLOQ低于以往的文獻(xiàn)報(bào)道[6]，分別為0.01（T/17OHP /AD）、0.02（DHT）、0.10 ng/mL（DHEA），可靈敏且準(zhǔn)確定量樣本中的低濃度甾體激素水平，在短時(shí)間內(nèi)高效完成人體內(nèi)痕量類固醇激素多組分的定量分析。此外，本研究還考察了溶血、脂血對(duì)于測(cè)定結(jié)果的影響，證實(shí)了溶血樣本會(huì)干擾DHEA的測(cè)定結(jié)果，建議在實(shí)際應(yīng)用中，嚴(yán)格控制樣本溶血，保證檢驗(yàn)質(zhì)量。

本研究建立的方法參加2019年國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心開展的16種17OHP制備物和新鮮冰凍人血清基于2種評(píng)價(jià)方案的互通性研究結(jié)果顯示，所有正確度驗(yàn)證材料和甾體激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)室和金域醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室2個(gè)LCMS/MS分析系統(tǒng)中表現(xiàn)出良好的互通性[17]。T和17OHP項(xiàng)目參加了2019年上半年國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心全國(guó)內(nèi)分泌正確度驗(yàn)證質(zhì)譜法調(diào)查，合格率為100%。本研究建立的方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)甾體激素多組分的分快速準(zhǔn)確測(cè)定，可為臨床雄激素異常相關(guān)疾病的檢測(cè)和診斷提供準(zhǔn)確、有效的依據(jù)。

T、AD、DHT、DHEA和17OHP是輔助臨床鑒別診斷多囊卵巢綜合征的重要指標(biāo)，建立適合本地區(qū)臨床實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間可以更好地為相應(yīng)疾病的診斷提供參考。本研究對(duì)367名體檢者血清樣本的激素水平進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，并根據(jù)性別和年齡差異進(jìn)行分組，建立了基于UPLCMS/MS方法的參考區(qū)間。雖然與文獻(xiàn)報(bào)道[18]存在微小的差異，但考慮到研究對(duì)象的地域、種族、生活習(xí)慣等因素，本研究結(jié)果更適用于為上海地區(qū)人群甾體激素相關(guān)疾病的診斷提供參考。后續(xù)將擴(kuò)大樣本量對(duì)此參考區(qū)間進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。