不同MMP mRNA和ADAMTS mRNA表達與椎間盤退行性變性程度的相關性

徐明元，徐貴森，楊曉鯤，羅 勇，關思書，范云飛

（中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院急診科，四川 成都 610083）

在全球疾病負擔調(diào)查中，腰疼高居第6位[1]。該病不僅會給患者帶來生理上的痛苦，還常會導致焦慮、抑郁等精神疾病的發(fā)生[2]。眾多研究結(jié)果表明，腰疼與椎間盤退行性變性（簡稱退變）密切相關，主要特征之一是髓核細胞外基質(zhì)的降解。髓核細胞外基質(zhì)主要是由Ⅱ型膠原和蛋白聚糖構成，使髓核能夠保留水分，緩沖和吸收機體的負荷?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS）是切割蛋白聚糖和膠原蛋白的主要酶，其成員蛋白在退變的椎間盤中呈現(xiàn)高表達，與髓核細胞外基質(zhì)分解和椎間盤退變的進展密切相關[3-4]。此外，椎間盤退變可導致腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和巨噬細胞抑制因子（macrophage inhibition factor，MIF）等炎癥因子的異常表達，并刺激髓核等鄰近椎間盤組織，加重退變的嚴重程度[5]。本研究擬通過探討MMP和ADAMTS與椎間盤退變程度及炎癥因子的相關性，為臨床防治椎間盤退變提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年11月—2019年11月中國人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的椎間盤退變患者160例。所有患者均符合椎間盤退變相關疾病的診斷標準?；颊咝g前均行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）檢查，并依據(jù)檢查結(jié)果進行Pfirrmann分級[6]（級別越高，椎間盤退變程度越嚴重），包括：Ⅰ級30例，其中男17例、女13例，年齡（59.91±12.24）歲；Ⅱ級32例，其中男18例、女14例，年齡（61.28±12.71）歲；Ⅲ級35例，其中男20例、女15例，年齡（59.35±13.14）歲；Ⅳ級33例，其中男18例、女15例，年齡（60.74±13.21）歲；Ⅴ級30例，其中男18例、女12例，年齡（61.33±13.57）歲。納入標準：（1）均符合椎間盤退變相關疾病的診斷標準；（2）擬接受相關手術治療；（3）患者知情同意。排除標準：（1）合并惡性腫瘤者；（2）合并嚴重心、腦、腎等系統(tǒng)性疾病者；（3）合并血液及免疫系統(tǒng)疾病者；（4）合并感染性疾病者；（5）臨床資料不全者。

1.2 方法

收集所有患者手術時的椎間盤髓核組織約5 g，存入液氮中保存，統(tǒng)一檢測。取出液氮凍存的組織樣本，加入適量液氮，用研缽磨成細粉。采用RNeasy微型試劑盒（德國Qiagen公司）提取總RNA，采用UV-vis 1200分光光度計（日本日立公司）測定總RNA含量。將RNA轉(zhuǎn)錄為互補DNA（complementary DNA，cDNA），逆轉(zhuǎn)錄體系：0.5 μg RNA、4 μL dNTP混合液（40 μmol/L）、4 μL 5×RT緩沖液[含50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.3）、75 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2]、2 μL基礎混合液、2 μL二硫蘇糖醇、1 μL HiFiScript逆轉(zhuǎn)錄酶，添加不含RNase的dH2O至20 μL。采用Prism 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）進行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）。擴增體系：反應總體積為20 μL，包括2 μL cDNA、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、7.2 μL dH2O和10 μL SYBR。擴增條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。引物序列見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 不同Pfirrmann分級組各項指標比較結(jié)果

Ⅳ級組和Ⅴ級組MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA、IL-1αmRNA和IL-1βmRNA相對表達量顯著高于Ⅰ級組、Ⅱ級組和Ⅲ級組（P＜0.05），且Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組依次升高（P＜0.05），Ⅳ級組和Ⅴ級組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Ⅲ級組、Ⅳ級組、Ⅴ級組ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-5 mRNA相對表達量顯著高于Ⅰ級組和Ⅱ級組（P＜0.05），Ⅱ級組顯著高于Ⅰ級組（P＜0.05），Ⅲ級組、Ⅳ級組和Ⅴ級組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組MMP-1 mRNA、MMP-13 mRNA、ADAMTS-1 mRNA、IL-6 mRNA和IL-8 mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同Pfirrmann分級組各項指標比較結(jié)果

2.2 各項指標與Pfirrmann 分級的相關性

Spearman相關分析結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA、ADAMTS-4 mRNA、ADAMTS-5 mRNA、IL-1αmRNA及IL-1βmRNA相對表達量與Pfirrmann分級均呈正相關（rs值分別為0.935、0.921、0.873、0.567、0.412、0.372，P＜0.05）。

2.3 各項指標之間的相關性

Pearson相關分析結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA、ADAMTS-4 mRNA、ADAMTS-5 mRNA相對表達量與IL-1αmRNA、IL-1βmRNA相對表達量均呈正相關（P＜0.05）。見表3。

表3 各項指標之間的相關性

3 討論

椎間盤是脊柱椎體之間的功能單位，由層狀纖維環(huán)、軟質(zhì)凝膠狀髓核及軟骨終板3個部分構成，共同作為椎體之間的減震器，完成脊柱的彎曲和扭轉(zhuǎn)[7]。在正常椎間盤中，髓核細胞外基質(zhì)的合成和分解處于平衡狀態(tài)，當分解速率超過合成時常會導致椎間盤的退變。MMP和ADAMTS是髓核細胞外基質(zhì)降解過程中關鍵的蛋白水解酶，幾乎對髓核細胞外基質(zhì)所有成分都有降解作用[8]。其中MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13是參與髓核細胞外基質(zhì)降解過程的主要MMP[9]。MMP-3是降解過程中的重要前體酶，其對Ⅱ型膠原的降解活性是MMP-1的5～10倍[10]。MMP-9是一種明膠酶，在膠原酶裂解后進一步降解變性膠原或明膠[11]。MMP-1和MMP-13均為膠原酶，主要作用于纖維狀膠原蛋白。有研究結(jié)果顯示，在椎間盤退變過程中，MMP-1 mRNA和MMP-13 mRNA相對表達量未升高，提示MMP-1和MMP-13在髓核細胞外基質(zhì)降解中的作用不明顯[12]。TAKAHASHI等[13]的研究結(jié)果顯示，椎間盤中MMP-3 mRNA相對表達量可隨著機械負荷的加重而明顯升高，其表達異常導致的椎間盤退變程度可隨時間的延長而加重。ZHANG等[12]的研究結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA和MMP-9 mRNA相對表達量在椎間盤退變過程中明顯上調(diào)，且起著關鍵的作用。本研究結(jié)果顯示，Pfirrmann分級Ⅳ級組和Ⅴ級組MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA相對表達量顯著高于Ⅰ級組、Ⅱ級組和Ⅲ級組（P＜0.05），且Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組依次升高（P＜0.05），而各組間MMP-1 mRNA、MMP-13 mRNA相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA相對表達量與Pfirrmann分級均呈正相關（rs值分別為0.935、0.921，P＜0.05）。ADAMTS-1、ADAMTS-4和ADAMTS-5在正常椎間盤和退變椎間盤中均有分布，但在退變的椎間盤中表達較高[14]。PATEL等[15]采用免疫印跡法檢測了退變早期和晚期椎間盤中ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白的表達，結(jié)果顯示晚期椎間盤退變組織中ADAMTS-4蛋白的表達顯著高于早期（P＜0.05）。CHEN等[16]的研究結(jié)果顯示，隨著椎間盤退變的進展，ADAMTS-5 mRNA相對表達量逐漸升高。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ級組、Ⅳ級組和Ⅴ級組ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-5 mRNA相對表達量顯著高于Ⅰ級組和Ⅱ級組（P＜0.05），且Ⅱ級組顯著高于Ⅰ級組（P＜0.05），而Ⅲ級組、Ⅳ級組和Ⅴ級組之間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組間ADAMTS-1 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Spearman相關分析結(jié)果顯示，ADAMTS-4 mRNA、ADAMTS-5 mRNA相對表達量與Pfirrmann 分級均呈正相關（rs值分別為0.873、0.567，P＜0.05）。由此可見，MMP-3、MMP-9、ADAMTS-4和ADAMTS-5可能在髓核細胞外基質(zhì)降解過程中起關鍵作用。

此外，椎間盤退變是TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的潛在來源[17]，椎間盤退變引起的炎癥反應可促進炎癥因子表達的增加，并刺激髓核等鄰近椎間盤組織，進而加重退變程度。本研究結(jié)果顯示，Ⅳ級組和Ⅴ級組IL-1αmRNA和IL-1βmRNA相對表達量顯著高于Ⅰ級組、Ⅱ級組和Ⅲ級組（P＜0.05），且Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組依次升高（P＜0.05）；Spearman相關分析結(jié)果顯示，IL-1αmRNA及IL-1βmRNA相對表達量與Pfirrmann分級均呈正相關（rs值分別為0.412、0.372，P＜0.05）。提示炎癥因子在椎間盤退變過程中扮演著重要角色。LI等[18]的研究結(jié)果顯示，椎間盤退變越嚴重，MMP-9 mRNA和IL-1αmRNA相對表達量越高。ZHANG等[12]分析了30例接受腰椎融合手術的腰痛患者的退變軟骨終板樣本，以10例無腰痛史且因椎體爆裂性骨折行腰椎手術的患者為對照，結(jié)果表明，MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA表達與IL-1αmRNA、IL-1βmRNA呈正相關（r值分別為0.577、0.407、0.571和0.486，P＜0.05），MMP-3、MMP-9可能受IL-1α、IL-1β的調(diào)節(jié)。WANG等[19]采用TNF-α處理人類椎間盤細胞后發(fā)現(xiàn)，ADAMTS-4和ADAMTS-5 mRNA呈高表達，并通過核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）通路促進聚集蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的降解。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α和IL-1β可通過多配體蛋白聚糖4途徑促進ADAMTS-5 mRNA表達，進而增強對聚集蛋白聚糖的降解作用[20]。有動物實驗結(jié)果顯示，在經(jīng)IL-1β處理的大鼠NP細胞中，ADAMTS-4 mRNA相對表達量明顯升高，并通過絲裂原活化蛋白激酶和NF-κB通路增強聚集蛋白聚糖的降解[21]。本研究結(jié)果顯示，MMP-3 mRNA、MMP-9 mRNA、ADAMTS-4 mRNA和ADAMTS-5 mRNA相對表達量與IL-1αmRNA和IL-1βmRNA均呈正相關（P＜0.05）。由此可見，IL-1α、IL-1β與MMP-3、MMP-9、ADAMTS-4、ADAMTS-5均有一定的聯(lián)系。

綜上所述，ADAMTS-4、ADAMTS-5、MMP-3、MMP-9、IL-1α和IL-1β與椎間盤退變有關，可反映病情的嚴重程度。