高通量測序分析小清河濟(jì)南段微生物群落結(jié)構(gòu)

鄭琳琳，李海濱，唐厚全，吳 慧，李明明，尹西翔，王兆軍

(山東省濟(jì)南生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，山東 濟(jì)南 250101)

水體中微生物是水域生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。微生物群落狀況與水質(zhì)狀況存在密切的聯(lián)系，微生物群落結(jié)構(gòu)的變化對水質(zhì)污染負(fù)荷積累有很好的響應(yīng)，在微生物生源要素循環(huán)、有機(jī)物分解和污染物凈化等方面具有非常重要的作用[1-4]。河流是陸地水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是氮營養(yǎng)元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中的重要環(huán)節(jié)[5]。有研究表明，底泥表面是硝化作用的主要位點(diǎn)之一，其表面微生物在河流生態(tài)系統(tǒng)氮的轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用[6-7]。淡水微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)由物理化學(xué)和生物參數(shù)的時(shí)間和空間變異性決定，對環(huán)境的變化響應(yīng)迅速，調(diào)整群落結(jié)構(gòu)以適應(yīng)生態(tài)環(huán)境等的變化[8]。將微生物作為環(huán)境質(zhì)量指標(biāo)已經(jīng)被人們廣泛接受，建立特定環(huán)境微生物指示物，首先需要確定特定環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)，然后確定其對環(huán)境因子的功能貢獻(xiàn)。

小清河是山東省境內(nèi)的一條重要河流，是一條防洪除澇、灌溉、航運(yùn)綜合利用河道。小清河濟(jì)南段重要斷面有3個(gè)，分別是睦里莊、還鄉(xiāng)店和辛豐莊。睦里莊為源頭斷面，還鄉(xiāng)店為市區(qū)生活污水出市區(qū)控制斷面，辛豐莊為小清河濟(jì)南段出境斷面。自睦里莊到還鄉(xiāng)店，小清河來水包括源頭水(玉清湖滲水)、泉水和生活污水，其中生活污水比例最大。自還鄉(xiāng)店至辛豐莊，小清河來水包括工業(yè)污水、生活污水，另外在該段還存在農(nóng)灌取水。目前，已有研究對小清河底泥沉積物中細(xì)菌類群進(jìn)行了檢測分析，結(jié)果顯示底泥中的細(xì)菌具有很強(qiáng)的多樣性，且存在明顯差異[9]。還有學(xué)者從小清河濟(jì)南段水樣中共獲得不同菌落特征的細(xì)菌微生物13種，利用分子生物學(xué)方法對培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析，并對其中2株進(jìn)行污染河水修復(fù)實(shí)驗(yàn)[10]。盡管如此，針對小清河全面分析水和沉積物中微生物群落特征及環(huán)境因子關(guān)系的研究仍較少。

小清河濟(jì)南段是城市生活污水主要的外排和處理水體，兩岸廢水入口十分復(fù)雜，研究其特征性微生物數(shù)量變化對評價(jià)小清河水系及其環(huán)境改善修復(fù)具有重要意義。高通量測序能提供不同分類水平上的菌群多樣性全貌，信息豐富。本文中選取小清河濟(jì)南段為研究區(qū)，采用高通量測序方法分析和比較水和沉積物中微生物群落組成，全面、深入地了解小清河濟(jì)南段微生物多樣性，揭示水和沉積物中的微生物群落特征與生態(tài)環(huán)境效應(yīng)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域和樣品采集

依據(jù)小清河源頭、泉水、支流、排污溝、污水處理廠、中水站、工業(yè)污染源等的分布、排放流量、排放濃度、排放位置等信息，選取小清河源頭睦里莊、還鄉(xiāng)店、G35高速公路匝口、大碼頭、鴨旺口、辛豐莊共6個(gè)斷面。在上述斷面分別采集水和沉積物，s代表沉積物，w代表水體。水樣采集采用豎式有機(jī)玻璃采水器采集，水樣體積均為500 mL，并經(jīng)過孔徑為0.22 μm的濾膜收集微生物。沉積物采用彼得遜采泥器采集。收集的水微生物濾膜和采集的沉積物放入無菌的封口袋后，在溫度為-80 ℃環(huán)境中保存。

1.2 微生物群落檢測

獲得的微生物樣品送交測序公司，將16S rRNA作為標(biāo)記基因，設(shè)計(jì)通用引物，在Illumina平臺上進(jìn)行高通量測序。采用QIIME軟件進(jìn)行原始測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，主要包括數(shù)據(jù)拆分、引物序列去除、拼接、嵌合體序列去除等質(zhì)量評估和質(zhì)控步驟。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物群落整體結(jié)構(gòu)

小清河濟(jì)南段水體和沉積物微生物群落在門水平上的組成如圖1所示。由圖可以看出：水體微生物群落的的主要組成為變形菌門、放線菌門、藍(lán)藻門、綠彎菌門、厚壁菌門和浮霉菌門等，沉積物微生物群落的主要組成為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、藍(lán)藻門、浮霉菌門、厚壁菌門等。小清河濟(jì)南段水體和沉積物微生物在門水平差別不大，兩相共有48門微生物，沉積物特有4門，水體特有2門，沉積物中含有更加豐富的微生物類群，表明水體微生物群落與沉積物微生物群落有著極其密切的兩相互通關(guān)系，并且變形菌門、放線菌門、藍(lán)藻門是豐度相對較大的三大類群，說明水體和沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)基本一致，兩者間微生物群落關(guān)系密切，沉積物中微生物群落種類數(shù)量更多，豐富度更高。

(a)水體中不同菌門的豐度

2.2 斷面間微生物群落差異

α多樣性指數(shù)是研究物種多樣性分析的一個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的方法，檢測河流不同斷面多樣性指數(shù)值是否具有顯著性差異，如顯著性水平p<0.001，表明微生物群落α多樣性差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

小清河濟(jì)南段不同斷面間水體和沉積物微生物群落差異檢驗(yàn)采用2個(gè)多樣性指數(shù)，即菌種豐富度指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)，結(jié)果見圖2。2個(gè)指數(shù)的檢驗(yàn)結(jié)果在中段(大碼頭、G35高速公路匝口、還鄉(xiāng)店斷面)存在一定的差異，但在上游(睦里莊斷面)與中游(鴨旺口斷面)之間、下游(辛豐莊斷面)與中游(鴨旺口斷面)之間結(jié)果基本一致。從多樣性指數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果看，辛豐莊、睦里莊斷面與大碼頭、G35高速公路匝口、還鄉(xiāng)店斷面形成了3個(gè)差異明顯的斷面，中游斷面區(qū)別不明顯。差異性檢驗(yàn)結(jié)果表明，不同斷面間普遍存在顯著性或極顯著性差異，說明斷面設(shè)置合理，能夠代表小清河濟(jì)南段不同斷面的微生物群落，從整體上反映研究區(qū)的微生物群落狀態(tài)。從菌種豐富度指數(shù)和香農(nóng)多樣性指數(shù)的比較來看，菌種豐富度指數(shù)更能說明不同斷面間微生物群落多樣性差異明顯。

2.3 環(huán)境因子相關(guān)性分析

本文中選擇的環(huán)境因子為pH、氨氮(NH4-N)、總氮(TN)、生化需氧量(BOD5)、化學(xué)需氧量(COD)和溶解氧(DO)。采用冗余分析(RDA)或典型關(guān)聯(lián)分析(CCA)法對小清河濟(jì)南段不同斷面間環(huán)境因子相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出：睦里莊、辛豐莊斷面的微生物群落與水體pH和DO呈正相關(guān)，與NH4-N、TN、BOD5和COD呈負(fù)相關(guān)；大碼頭和還鄉(xiāng)店斷面的則相反，與NH4-N、TN、BOD5和COD呈正相關(guān)，與pH和DO呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果說明水域中的pH及NH4-N、TN、BOD5、COD和DO濃度對流域中不同斷面微生物群落結(jié)構(gòu)有重要的影響，其中睦里莊、辛豐莊斷面受pH、DO的影響最大，大碼頭和還鄉(xiāng)店斷面受NH4-N、TN、BOD5和COD的影響較大。環(huán)境因子作為影響微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化的重要參數(shù)，在以后的研究中應(yīng)更加關(guān)注，可以通過調(diào)控對群落結(jié)構(gòu)影響較大的環(huán)境因子來進(jìn)一步優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提升水環(huán)境質(zhì)量。

圖3 小清河濟(jì)南段環(huán)境因子與不同斷面微生物群落間的相關(guān)性

2.4 氨氮降解相關(guān)微生物分析

本文中利用環(huán)境因子與微生物間的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析，得到不同環(huán)境因子與微生物科級和屬級階元的相關(guān)性(見表1)，重點(diǎn)分析與氨氮顯著相關(guān)的微生物類群。由表可以看出，小清河濟(jì)南段各斷面富含大量與與氨氮降解過程密切相關(guān)的微生物類群[11]，大量類群高頻率地出現(xiàn)在其他研究報(bào)道中，是常見的氨氮降解相關(guān)微生物，如莫拉菌科[12]、紅細(xì)菌科[13]、叢毛單胞菌科[14]中的類群等。也有多種微生物類群雖然不常出現(xiàn)在文獻(xiàn)報(bào)道中，但是以非常大的豐度和顯著的氨氮相關(guān)性分布于各個(gè)斷面，如肉桿菌科、紅環(huán)菌科等，這些微生物群是本地化氨氮降解微生物的潛在菌庫。有研究發(fā)現(xiàn)，在氨氮降解微生物中，硝化菌群對氨氮污染水體強(qiáng)化修復(fù)具有顯著的效果[15]，因此，可進(jìn)一步利用小清河中的硝化菌群等微生物進(jìn)行水質(zhì)凈化。

表1 小清河濟(jì)南段與氨氮指標(biāo)具有顯著正相關(guān)性的微生物類群

3 結(jié)論

1)小清河濟(jì)南段水體和沉積物微生物在門水平差別不大，兩相共有48門微生物，沉積物特有4門，水體特有2門，沉積物中含有更加豐富的微生物類群，表明水體微生物群落與沉積物微生物群落有著極其密切的兩相互通關(guān)系。高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)了水體微生物群落中應(yīng)引起重視的菌種，如還鄉(xiāng)店斷面水體中弧形桿菌。弧形桿菌是城市污染水體的主要菌種，是一種人畜共患的食源性和水源性病原菌，與人類胃腸炎和菌血癥有關(guān)，可危及老年人的生命[16]。

2)睦里莊斷面的微生物群落與水體pH和DO呈正相關(guān)，與NH4-N、TN、BOD5和COD呈負(fù)相關(guān)，大碼頭、還鄉(xiāng)店斷面的則相反，與NH4-N、TN、BOD5和COD呈正相關(guān)，與pH和DO呈負(fù)相關(guān)。

3)各斷面富含大量與氨氮降解過程密切相關(guān)的微生物類群，且大量類群高頻率地出現(xiàn)在其他研究報(bào)道中，是常見的氨氮降解相關(guān)微生物，如莫拉菌科、紅細(xì)菌科、叢毛單胞菌科中的類群等。還有多種微生物類群雖然不常出現(xiàn)在文獻(xiàn)報(bào)道中，但是以非常大的豐度和顯著的氨氮相關(guān)性分布于各個(gè)斷面，

如肉桿菌科、紅環(huán)菌科等。這些微生物群是本土化氨氮降解微生物的潛在菌庫。