采用HPLC法測(cè)定鹽生肉蓯蓉中苯乙醇苷類含量

楊 雯，石 妍

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014000)

肉蓯蓉，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在歷代補(bǔ)益性中藥處方中出現(xiàn)率占第1位[1]。現(xiàn)在普遍認(rèn)為我國肉蓯蓉屬植物有4種和1變種，分別為肉蓯蓉(又名荒漠肉蓯蓉)Cistanche deserticola Y.C.Ma、管花肉蓯蓉C.tubulosa(Schenk)Wight、鹽生肉蓯蓉C.salsa(C.A.Mey.)G.Beck、沙蓯蓉 C.sinensis G.Beck 及白花鹽蓯蓉 C.salsa var.albiofora P.F.Tu et Z.C.Lou，var.nov[2]。目前市場(chǎng)上流通的藥材肉蓯蓉主要來源于荒漠肉蓯蓉、管花肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉和沙蓯蓉這4種肉蓯蓉屬植物，其中，荒漠肉蓯蓉、鹽生肉蓯蓉和沙蓯蓉為我區(qū)地產(chǎn)品種。由于對(duì)肉蓯蓉的開發(fā)較早，人們對(duì)于荒漠肉蓯蓉的認(rèn)識(shí)較深，應(yīng)用也更為廣泛，而對(duì)鹽生肉蓯蓉和沙蓯蓉的研究并不深入。蓯蓉類藥材的化學(xué)成分包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、多糖類、生物堿類、揮發(fā)油類等多種活性成分[3-6]。其中，苯乙醇苷類是主要化學(xué)成分，具有補(bǔ)腎壯陽、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、增強(qiáng)記憶力之功效[7-12]。故本課題將對(duì)苯乙醇苷類活性成分進(jìn)行測(cè)定分析，為今后肉蓯蓉類藥材的評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 儀器、試藥及樣品

1.1 儀器

島津LC-20A型高效液相色譜儀；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AE100型萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；ME5型百萬分之一天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 試劑與試藥

對(duì)照品毛蕊花糖苷(111530-201713，中國食品藥品檢定研究院)、松果菊苷(111670-201706，中國食品藥品檢定研究院)。

色譜乙腈(SIGMA-ALDRICH)、色譜甲醇(SIGMA-ALDRICH)、甲醇、甲酸(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

實(shí)驗(yàn)共收集到13批鹽生肉蓯蓉藥材，具體情況見表1所示。

表1 鹽生肉蓯蓉藥材采收情況表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜條件如下[13-16]，色譜柱：AlltimaC18柱(250×4.6mm5μm)，流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫程序見表2，流速：1.0mL·min-1，柱溫：35℃，檢測(cè)波長：330nm；進(jìn)樣量：10μL。HPLC色譜圖見圖1，光譜圖見圖2。

鹽生肉蓯蓉混合對(duì)照品

松果菊苷光譜圖

表2 流動(dòng)相洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的鹽生肉蓯蓉粉末(65目)約1.0g，加入70%甲醇溶液50mL，稱量，浸泡30min后，超聲提取30min后，放冷后加70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過，取續(xù)濾液以0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取松果菊苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，采用30%的甲醇溶解，分別制成每1mL含0.50mg、0.40mg的對(duì)照品溶液，即得混合對(duì)照品溶液，保存于4℃冰箱中，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1.0μL、2.0μL、6.0μL、10.0μL、15.0μL、20.0μL、25.0μL進(jìn)行測(cè)定，所得結(jié)果見表3，表明對(duì)照品在各自進(jìn)樣范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表3 回歸方程及線性范圍

2.4.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積積分值，計(jì)算RSD分別為0.19%、0.26%。結(jié)果表明儀器精密度良好。數(shù)據(jù)見表4。

表4 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(Y5樣品)10μL，于制備后0h、2h、4h、8h、12h分別進(jìn)樣測(cè)定松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積積分值，計(jì)算RSD分別為0.32%、0.47%，結(jié)果表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。數(shù)據(jù)見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一供試品(Y5樣品)6份，按照上述方法進(jìn)行供試品溶液的制備，并按上述色譜條件分別進(jìn)樣10μL。測(cè)定計(jì)算松果菊苷、毛蕊花糖苷含量的平均值(n=6)分別為1.47%、0.87%，RSD分別為0.53%、0.93%。結(jié)果表明方法重復(fù)性較好。數(shù)據(jù)見表6。

表6 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4.5 加樣回收試驗(yàn)

取同一供試品(Y5)，平行取樣精密稱定6份置于錐形瓶中，各約0.25g，分別將適量對(duì)照品溶液加入各錐形瓶中，按上述方法制備供試品溶液，按外標(biāo)法計(jì)算松果菊苷、毛蕊花糖苷的平均回收率依次為99.9%、98.8%，RSD依次為0.39%、1.11%(n=6)，表明該方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表7。

表7 加樣回收試驗(yàn)

2.4.6 耐用性試驗(yàn)

取同一供試品溶液(Y3)，采用不同色譜柱，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算鹽生肉蓯蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷的平均含量，RSD均小于3%，表明該方法對(duì)于不同色譜柱的耐用性良好，試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表8。

表8 不同色譜柱測(cè)得鹽生肉蓯蓉3號(hào)樣中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量

2.5 樣品含量測(cè)定

取13批鹽生肉蓯蓉，制備成供試品溶液后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果分別見表9。

表9 鹽生肉蓯蓉含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)對(duì)提取溶劑進(jìn)行考察：分別考察了以30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇為提取溶劑制備供試品溶液，結(jié)果顯示當(dāng)以70%甲醇溶液進(jìn)行提取時(shí)，鹽生肉蓯蓉中苯乙醇苷的含量達(dá)到最大值。故選擇70%甲醇溶液作為提取溶劑。對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行考察：本實(shí)驗(yàn)分別考察了超聲時(shí)間15min、30min、45min、60min對(duì)待測(cè)成分的提取效果，測(cè)定結(jié)果顯示當(dāng)超聲提取時(shí)間為30min時(shí)，鹽生肉蓯蓉中苯乙醇苷類含量達(dá)最高，并且在45min以后含量下降，故選擇超聲時(shí)間為30min。對(duì)超聲功率進(jìn)行考察：考察了250W、400W、500W對(duì)待測(cè)組分的影響，結(jié)果表明各功率下提取效率基本一致，故參照2015版藥典肉蓯蓉項(xiàng)下供試品溶液制備的超聲條件：功率250W、頻率40kHz。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了4種流動(dòng)相，分別為甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水，結(jié)果顯示，采用甲醇-0.1%甲酸水流動(dòng)相系統(tǒng)，各峰的基線平穩(wěn)、峰形好，且各待測(cè)成分的分離度符合要求，因此，最終采用甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)作為流動(dòng)相系統(tǒng)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也考察了不同型號(hào)色譜柱Shim-pack C18(250mm×4.6mm，5μm)、Agilentzobarx C18(250mm×4.6mm，5μm)、Alltima C18(250mm×4.6mm，5μm)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果表明采用不同色譜柱對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響，耐用性良好。