黃連非藥用部位4 種生物堿含量變化

趙兵令 汪令 王紅志 王露 李華聲 宋玉卓,3 馮金民 車(chē)曉菲*

1.河北維爾利動(dòng)物藥業(yè)有限公司 050000

2.河北省中獸藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 050000

3 河北省功能性添加劑技術(shù)創(chuàng)新中心 050000

黃連是毛茛科植物黃連、云連或三角葉黃連的干燥根莖，三者分別稱(chēng)為“川連或味連”“云連”“雅連”。主產(chǎn)地有四川、湖北、重慶、貴州、云南等地。其始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被譽(yù)為上品，其性寒、味苦，歸心、脾、胃、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒的作用；現(xiàn)代藥理學(xué)表明，對(duì)抗菌和抗炎具有“中藥抗生素”的贊譽(yù)，并且黃連還有降血糖、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜催眠及對(duì)心血管系統(tǒng)的影響。黃連主要有效成分為小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿和藥根堿等生物堿類(lèi)物質(zhì)。黃連作為常用中藥，其不僅為人類(lèi)臨床應(yīng)用及健康做出重要貢獻(xiàn)，而且也是畜禽疾病防治的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。比如“白頭翁口服液”“黃連解毒湯”以及“四黃止痢顆?！保饕δ転榍鍩峤舛?，涼血止痢，研究表明其方劑用于治療家禽腸道感染性疾病有很好的效果。然而處方中君藥黃連起主要藥效作用且市場(chǎng)價(jià)格較貴。隨著國(guó)內(nèi)對(duì)黃連的需求量與日俱增，并且黃連對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求苛刻、生長(zhǎng)年限長(zhǎng)、單位面積產(chǎn)量低。在經(jīng)濟(jì)利益的誘惑下，黃連被大量過(guò)度采挖，導(dǎo)致其野生藥材資源銳減，越來(lái)越多的獸藥企業(yè)因節(jié)約成本不投、少投、投劣質(zhì)黃連或黃連須替代黃連，原材料的差異對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性、臨床效果存在很大隱患。隨著我國(guó)畜禽飼用產(chǎn)品限抗、減抗、禁抗政策的頒布實(shí)施，中藥替抗已成為目前畜牧行業(yè)的研究熱點(diǎn)，相關(guān)政策指出中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中所產(chǎn)生的非藥用部位及副產(chǎn)物是開(kāi)發(fā)替抗類(lèi)飼用產(chǎn)品潛在的重要原料。目前黃連只以其根莖入藥，非藥用部位須根、莖和葉作為廢料遺棄，造成資源的嚴(yán)重浪費(fèi)，然而關(guān)于黃連不同部位通過(guò)薄層色譜法定性鑒別以及高效液相色譜法定量檢測(cè)雙重控制質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的報(bào)道鮮有顯示。本文對(duì)藥用部位黃連以及非藥用部位4 種主要生物堿活性成分的薄層鑒別、含量進(jìn)行比較分析，由此為黃連相關(guān)的中藥制劑能否用非藥用部位替代提供參考和理論依據(jù)，并且為黃連非藥用部位合理利用和資源開(kāi)發(fā)，以期為中藥資源產(chǎn)業(yè)的提質(zhì)增效和綠色發(fā)展提供支撐，為飼用抗生素的有效替代提供途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特DK-98-11)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)KQ5200B)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療器械101～3AS)；電子天平(島津菲律賓廠(chǎng)AUW120D)；硅膠G板，青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)生產(chǎn)；美國(guó)安捷倫Agilent1260-II 高效液相色譜儀。

1.2 試劑鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、巴馬汀、表小檗堿（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110713-201814,110745-201978,110732-201913,110765-202035）；甲醇、乙腈、磷酸均為天津市康科德試劑有限公司產(chǎn)品，色譜純。環(huán)己烷、乙酸乙酯、異丙醇、三乙胺、磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉均為科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理黃連3 批樣品均采集于湖北利川，取健康整株黃連分別將每株的根莖、須根、莖和葉進(jìn)行分離，將上述處理好的材料分別置于55℃～60℃干燥烘箱內(nèi)烘干至恒重，粉碎二號(hào)篩，獲得不同部位黃連材料粉末，室溫密封保存待用。

1.3.2 薄層色譜鑒別按照中華人民共和國(guó)《獸藥典2020版》分別取黃連各部位粉末0.25g，加甲醇25mL，超聲處理30min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。另取黃連對(duì)照藥材0.25g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、巴馬汀、表小檗堿對(duì)照品，加甲醇分別制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法 (通則 0502)試驗(yàn)，吸取上述6 種溶液各1μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3 ∶ 3.5 ∶1 ∶1.5 ∶O.5 ∶ 1）為展開(kāi)劑，置用濃氨試液預(yù)飽和20min 的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈 (365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯4 個(gè)以上相同顏色的熒光斑點(diǎn) ;對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

1.3.3 高效液相色譜檢測(cè)按照中華人民共和國(guó)《獸藥典2020 版》十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05moI/L 磷酸二氫鉀溶液 (50 :50)(每100mL 中加十二烷基硫酸鈉0.4g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH 值為4.0)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為345nm，流速1.0mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL 含90.5μg的溶液備用。取本品粉末 (過(guò)二號(hào)篩)約0.2，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100:1)的混合溶液50mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率50W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2mL，置10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得 。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析高效液相色譜檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果用（Means±SE）表示，用SPSS19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，P ＜0.05 有意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連不同部位外觀(guān)、形狀本實(shí)驗(yàn)樣品采于湖北利川，將健康整株黃連分為黃連葉、黃連莖、黃連跟、黃連須四個(gè)部分（如圖1），經(jīng)專(zhuān)業(yè)藥材鑒定師鑒定為毛茛科植物味連，并且其外觀(guān)和形狀與劉芳報(bào)道相一致。

圖1 黃連不同外觀(guān)、形狀

2.2 薄層色譜鑒別如圖2 所示，黃連不同部位四種生物堿均能顯示熒光斑點(diǎn)，而黃連葉表小檗堿熒光斑點(diǎn)較淺，且黃連根四種生物堿熒光斑點(diǎn)最明顯。通過(guò)比較黃連不同部位熒光斑點(diǎn)的大小，未呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性。

圖2 黃連不同部位薄層鑒別

2.3 高效液相色譜含量測(cè)定如圖3 所示，通過(guò)高效液相色譜含量測(cè)定與黃連根相比，小檗堿含量分別是黃連葉的4.58 倍、黃連莖的4.82 倍、黃連須的4.01 倍，差異均顯著（P ＜0.01）；巴馬汀含量分別是黃連葉的11.3 倍、黃連莖的13.17 倍、黃連須的9.25 倍，差異均顯著（P ＜0.01）；黃連堿含量分別是黃連葉的16.77 倍、黃連莖的3.09 倍、黃連須的1.22 倍，差異均顯著（P ＜0.01）；表小檗堿含量分別是黃連葉的60.57 倍、黃連莖的7.89 倍、黃連須的1.25 倍，差異均顯著（P ＜0.01）；由此可見(jiàn)，黃連各生物堿含量明顯高于其他部位，并且黃連四種生物堿小檗堿含量最高。

圖3 黃連不同部位含量檢測(cè)

3 討論

中藥及其復(fù)方殘留低、不易產(chǎn)生耐藥性、質(zhì)量難于量化控制以及非藥用部位可飼用等特點(diǎn)，建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制體系和評(píng)價(jià)體系，把控中藥制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性、藥材副產(chǎn)物的合理利用成為急需待解決的問(wèn)題。生物堿類(lèi)是黃連最主要的藥效成分，包括黃連堿、巴馬汀、小檗堿、表小檗堿等。本研究通過(guò)薄層色譜鑒別結(jié)果顯示黃連各部位生物堿熒光斑點(diǎn)清晰，且黃連各生物堿熒光斑點(diǎn)最大；結(jié)合高效液相色譜含量測(cè)定結(jié)果可知與黃連相比非藥用部位黃連葉、黃連莖、黃連須中4 種生物堿含量存在明顯變化，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的黃連不同部位總生物堿含量大小順序依次是根莖 ＞ 須根＞ 葉片結(jié)果相吻合。并且本研究結(jié)果顯示黃連的4 種生物堿含量最高與文獻(xiàn)報(bào)的黃連藥材生物堿含量順序?yàn)樾￠迚A＞黃連堿＞巴馬?。颈硇￠迚A＞非洲防己堿＞藥根堿結(jié)果相一致。此外相關(guān)研究表明在黃連生長(zhǎng)過(guò)程中，其植株的生物堿隨著生長(zhǎng)不斷向根莖轉(zhuǎn)移，該結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定出入，可能不同品種、季節(jié)對(duì)黃連生物堿的分布存在一定的影響。而中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含有的化學(xué)成分，黃連的廣泛應(yīng)用與其所含各種生物堿的藥理作用存在密切關(guān)系，并且黃連的藥理作用并不是某單一生物堿作用的結(jié)果，比如黃連中小檗堿抗炎作用較強(qiáng)，但是黃連水提液的最低抑菌能力要強(qiáng)于小檗堿，由此表明黃連中含有其他抗菌或?qū)咕袇f(xié)同作用的成分 。所以只有對(duì)其主要生物堿的含量進(jìn)行全面控制，才能保證藥材的質(zhì)量。此外有資料顯示黃連其須根、莖、葉等可以作為黃連的代用品 。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果這為加強(qiáng)中獸藥在動(dòng)物養(yǎng)殖中的實(shí)踐應(yīng)用，開(kāi)發(fā)替抗類(lèi)飼用產(chǎn)品，有效推動(dòng)我國(guó)畜牧養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展提供很好的保障。

黃連非藥用部位各生物堿具有一定的綜合利用價(jià)值，能否完全或部分替代藥用部位臨床效果有待于進(jìn)一步確定，同時(shí)也為黃連非藥用部位作為飼料添加劑開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。