基于微觀角度的中醫(yī)舌診客觀化研究的現(xiàn)在與未來(lái)*

張 冬，龐穩(wěn)泰，王可儀，楊豐文，張俊華**

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)循證醫(yī)學(xué)中心 天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院 天津 300193）

舌診是中醫(yī)臨床診斷與辨證論治的重要依據(jù)[1-3]。隨著圖像采集與分析處理方法的不斷突破，中醫(yī)舌診的客觀化研究也在較多開(kāi)展。中醫(yī)舌診客觀化主要是指依據(jù)中醫(yī)舌診的相關(guān)理論和成果，通過(guò)各種高新技術(shù)實(shí)現(xiàn)臨床舌診的模擬診療過(guò)程。通過(guò)舌診客觀化的研究，能夠有效利用采集裝備和技術(shù)實(shí)現(xiàn)中醫(yī)舌診的數(shù)字化、標(biāo)準(zhǔn)化，有效彌補(bǔ)了臨床醫(yī)生舌診診療過(guò)程中易出現(xiàn)的主觀性強(qiáng)、受外界環(huán)境干擾等問(wèn)題，對(duì)中醫(yī)舌診的發(fā)展與傳承具有重要的意義。

近年來(lái)，隨著生物信息科學(xué)的不斷發(fā)展，針對(duì)中醫(yī)舌診舌象的微觀形成機(jī)制研究逐漸增加與深入。通過(guò)檢測(cè)儀器探索不同舌象的形成機(jī)制，包括微生態(tài)學(xué)、代謝組學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、血液流變、蛋白組學(xué)、基因表達(dá)譜等[4]，能夠從微觀的角度對(duì)舌象形成進(jìn)行探索，深入分析舌象形成機(jī)制，進(jìn)而推測(cè)其舌象表現(xiàn)，從而為舌診的客觀化研究提供微觀機(jī)制角度的支持。當(dāng)前，微生態(tài)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)、基因表達(dá)譜等方法已經(jīng)成功的應(yīng)用于舌診，尤其是舌苔的形成機(jī)制研究上，已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展[5-6]，但是當(dāng)前研究依然存在一些問(wèn)題，例如沒(méi)有形成理論方法、研究樣本量較少且難以合并、典型舌象研究較為集中等?；谖⒂^角度進(jìn)行中醫(yī)舌診客觀化研究的前提和基礎(chǔ)在于總結(jié)與規(guī)范不同技術(shù)方法的采樣流程、實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)、分析模型等，從而為微觀舌診客觀化研究奠定理論依據(jù)和方法支撐。本文從微觀角度等方向?qū)ι嘞笮纬傻南嚓P(guān)機(jī)制進(jìn)行了總結(jié)與分析，并對(duì)相關(guān)研究的現(xiàn)在與未來(lái)提出了建議。

1 中醫(yī)舌診的微生態(tài)研究進(jìn)展

1.1 舌體微生態(tài)簡(jiǎn)介與常用技術(shù)

微生態(tài)學(xué)能夠從細(xì)胞水平和分子水平對(duì)微生物群進(jìn)行研究，并且能夠從中總結(jié)相應(yīng)分布規(guī)律。由于舌體結(jié)構(gòu)和舌苔性質(zhì)的特殊性，能夠有效保存微生物并形成舌體微生態(tài)，因而舌體微生物菌群的失調(diào)可能會(huì)導(dǎo)致舌面發(fā)生變化[4]。研究舌象的微生態(tài)分布與變化規(guī)律，能夠從微觀角度對(duì)舌象形成機(jī)制進(jìn)行微生態(tài)探索，建立微生態(tài)-舌象的關(guān)聯(lián)機(jī)制和模型，從而輔助疾病診斷與辨證施治[4,7]。

微生態(tài)學(xué)研究方法包括測(cè)定觀察、培養(yǎng)、基因工程、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、變性梯度凝膠電泳等[8]?；蚬こ套鳛槲⑸鷳B(tài)檢測(cè)的常用技術(shù)，能夠有效分析某一基因片段的功能結(jié)構(gòu)，從而揭示微生態(tài)系統(tǒng)中各菌群的活動(dòng)及關(guān)系，其中常用的為16S rRNA基因[9]。

1.2 舌體微生態(tài)研究進(jìn)展

正常人的舌苔微生態(tài)環(huán)境由于舌的自潔作用而相對(duì)穩(wěn)定，總體菌群數(shù)量相對(duì)較少并且種類單一[10-11]。王靜[12]對(duì)正常健康人的舌苔進(jìn)行了取樣和微生態(tài)檢測(cè)，得到了菌群的大致總數(shù)和分布。王翰章[10]對(duì)舌背面的微生態(tài)環(huán)境進(jìn)行研究，并列舉出了優(yōu)勢(shì)菌種。

研究人員對(duì)不同中醫(yī)證型的厚膩苔進(jìn)行了微生態(tài)研究[13]。朱蓮娜等[14]檢測(cè)并分析了濕熱證患者舌苔和正常健康人舌苔的微生態(tài)環(huán)境，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濕熱證患者相較于正常健康舌苔具有更加豐富的真菌分布[4]。盧林等[15]對(duì)脾虛濕盛泄瀉患者膩苔和薄苔進(jìn)行了微生態(tài)環(huán)境檢測(cè)與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舌苔厚膩程度與微生物菌群總數(shù)之間存在關(guān)聯(lián)性，舌苔越厚膩表現(xiàn)出菌群數(shù)量越多。付肖巖等[16]對(duì)慢性腹瀉脾胃濕熱證患者進(jìn)行菌群檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)舌苔都存在菌群失調(diào)，而脾胃濕熱證比脾虛證表現(xiàn)更為突出。

針對(duì)臨床疾病，研究人員也對(duì)口腔（口臭等）、消化系統(tǒng)、癌癥（肝癌、胃癌、食管癌）等疾病進(jìn)行了舌象的微生態(tài)研究[17-18]。王菁等[19]發(fā)現(xiàn)口臭患者的菌群分布與種類與正常健康人之間存在顯著的差異。李福鳳等[20]發(fā)現(xiàn)慢性胃炎患者的膩苔、非膩苔和正常健康舌苔之間的微生態(tài)特征之間存在差異，并分析出膩苔的形成可能與舌面微生態(tài)變化失調(diào)具有相關(guān)性。肖飛等[21]對(duì)肺癌患者的舌苔微生態(tài)進(jìn)行了檢測(cè)，同樣分析出膩苔可能與舌面微生態(tài)有關(guān)[4]。

從上述研究中可以看出，研究人員使用了多種微生態(tài)檢測(cè)技術(shù)對(duì)正常人舌苔、典型臨床疾病和中醫(yī)證型舌苔進(jìn)行了微生態(tài)環(huán)境的檢測(cè)。與正常人舌苔微生態(tài)相比，患病人群的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了失調(diào)，并且在部分疾病舌苔微環(huán)境中能夠發(fā)現(xiàn)失調(diào)的細(xì)菌種類和總數(shù)。但是由于當(dāng)前研究技術(shù)手段多種多樣，導(dǎo)致研究還不能很好的進(jìn)行合并分析，并且針對(duì)疾病舌苔微生態(tài)只是進(jìn)行了菌群種類和總數(shù)的檢測(cè)，而很少與宏觀的舌象舌苔進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。

1.3 舌體與腸道菌群的研究進(jìn)展

最新的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)消化道能夠?qū)崿F(xiàn)口腔與腸道微生態(tài)的關(guān)聯(lián)分析，使得口腔菌群和腸道菌群具有密不可分的聯(lián)系。隨著口腔菌群與腸道菌群相關(guān)性研究進(jìn)展，逐步形成口腔舌體-腸道菌群的關(guān)聯(lián)模型和作用機(jī)制，能夠有效促進(jìn)中醫(yī)舌診的微觀角度研究在臨床診療中的應(yīng)用[22-24]。

李琪等[25]研究發(fā)現(xiàn)泄瀉患者舌、腸菌群的變化趨勢(shì)具有一致性。對(duì)脾虛濕盛泄瀉患者進(jìn)行了舌面菌群檢測(cè)和腸道微生態(tài)檢測(cè)，結(jié)果表明其中具有關(guān)聯(lián)性，即二者同步失調(diào)或改善[26]。當(dāng)前基于腸道菌群的舌診研究開(kāi)展較少，而研究結(jié)果集中在腸道菌群與舌面菌群的關(guān)聯(lián)性方面，而對(duì)舌象表現(xiàn)-舌面菌群-腸道菌群的具體關(guān)聯(lián)流程研究不足，導(dǎo)致結(jié)果還不能應(yīng)用于臨床診療評(píng)價(jià)中。

2 中醫(yī)舌診的代謝組學(xué)研究進(jìn)展

2.1 代謝組學(xué)簡(jiǎn)介與常用技術(shù)

代謝組學(xué)相關(guān)方法能夠深入研究機(jī)體新陳代謝的變化情況，并分析其可能導(dǎo)致的人體微生態(tài)環(huán)境變化，為微觀視角研究提供了新的方法和技術(shù)[27]。在中醫(yī)舌診相關(guān)研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)基于代謝組學(xué)方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)舌苔變化機(jī)制和臨床辨證的區(qū)別和鑒定[4]。核磁共振波譜、質(zhì)譜、高效液相色譜等分析方法是進(jìn)行代謝組學(xué)研究常用的技術(shù)方法[28]。

2.2 代謝組學(xué)在中醫(yī)舌診研究中的進(jìn)展

在對(duì)不同的疾病進(jìn)行代謝組學(xué)分析中，李福鳳等[29]對(duì)慢性胃炎患者膩苔、非膩苔、正常人舌苔進(jìn)行了代謝組學(xué)檢測(cè)和分析，標(biāo)記出了相關(guān)代謝組學(xué)差異。Sun等[30]對(duì)胃炎患者進(jìn)行了代謝組學(xué)相關(guān)研究，并發(fā)現(xiàn)了菌群的代謝標(biāo)志分子[4]。王廣基等[31]對(duì)不同證型冠心病患者的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)方法的采樣和檢測(cè)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其存在差異，并且能夠?qū)崿F(xiàn)不同證型的區(qū)分和鑒別。

通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)舌面的相關(guān)代謝指紋圖譜的檢測(cè)，進(jìn)而鑒定出潛在標(biāo)志物或標(biāo)志分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)異常舌象的識(shí)別。當(dāng)前研究開(kāi)展較少并集中在典型異常舌苔上，針對(duì)舌象舌苔的代謝指紋圖譜沒(méi)有進(jìn)行詳細(xì)描繪，與舌苔外在表現(xiàn)的關(guān)聯(lián)性研究不足。

3 中醫(yī)舌診蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展

3.1 蛋白組學(xué)簡(jiǎn)介與常用技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)能夠從蛋白質(zhì)的組成與活動(dòng)角度總結(jié)出相應(yīng)規(guī)律和特點(diǎn)，進(jìn)而進(jìn)行生命活動(dòng)的分析。當(dāng)前，蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)在中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中具有重要的應(yīng)用場(chǎng)景和價(jià)值[4,32]。目前應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)主要包括質(zhì)譜技術(shù)、激光捕獲切割、凝膠電泳等[33]。

3.2 蛋白組學(xué)技術(shù)在中醫(yī)舌診研究中的進(jìn)展

對(duì)正常舌苔和不同病理舌苔進(jìn)行蛋白組學(xué)的采樣和檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其蛋白組學(xué)特征存在顯著差異，實(shí)現(xiàn)了微觀辨證學(xué)的研究[4,32-33]。王憶勤等[34]對(duì)正常健康人、慢性胃炎患者的血清蛋白組學(xué)進(jìn)行了采集和檢測(cè)，分析了慢性胃炎患者相對(duì)于正常健康人的微觀組學(xué)差異。通過(guò)對(duì)消化疾病患者的唾液樣本進(jìn)行采集和分析，得到了相應(yīng)的蛋白指紋，并以此為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)了正常舌苔與消化疾病舌苔的區(qū)別和鑒定[35]。Zhang等[36]對(duì)正常健康人，異常薄苔、厚苔和剝脫苔進(jìn)行了舌苔蛋白質(zhì)組的檢測(cè)，并從中發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致異常舌苔變化可能與相關(guān)蛋白質(zhì)有關(guān)[4]。

蛋白指紋質(zhì)譜的建立能夠有效的篩選和發(fā)現(xiàn)與病例舌象發(fā)生發(fā)展有關(guān)的蛋白質(zhì)差異表達(dá)，進(jìn)而進(jìn)行疾病的診斷和區(qū)分。而當(dāng)前研究的蛋白組學(xué)采集來(lái)源和分析方法沒(méi)有實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一化和規(guī)范化，也沒(méi)有建立起蛋白指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)，導(dǎo)致還不能利用蛋白組學(xué)技術(shù)進(jìn)行舌象客觀化描述。

4 中醫(yī)舌診基因表達(dá)譜研究進(jìn)展

4.1 基因表達(dá)譜簡(jiǎn)介與常用技術(shù)

基因表達(dá)譜（Gene expression profile）技術(shù)能夠有效描繪出相關(guān)檢測(cè)目標(biāo)的基因表達(dá)種類和豐度。目前廣泛應(yīng)用于臨床樣本的分析與處理中[37]。隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，不同的研究成果均發(fā)現(xiàn)舌粘膜上皮細(xì)胞是影響舌苔形成的重要因素，而舌上皮細(xì)胞的表達(dá)與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)[38-39]?；虮磉_(dá)譜分析技術(shù)逐漸應(yīng)用于舌苔的形成分子機(jī)制分析上，并取得了一定的進(jìn)展。常用的舌苔基因表達(dá)譜分析方法包括對(duì)舌苔的取樣分析和病理檢查等[4,40]。

4.2 基因表達(dá)譜方法在中醫(yī)舌診研究中的進(jìn)展

李明等[41]分別對(duì)薄厚苔的上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax、TGF-β3表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，厚苔的細(xì)胞凋亡相對(duì)較少，并且Bax、TGF-β3等相關(guān)凋亡基因表達(dá)水平降低，從而推測(cè)厚苔的形成原因可能與其相關(guān)[4]。吳正治等[42]研究了舌上皮細(xì)胞凋亡、Bax、bcl-2等方面與舌苔厚度的變化關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舌苔中均沒(méi)有檢測(cè)到bc1-2基因表達(dá)，而B(niǎo)ax基因表達(dá)與舌上皮細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)正比例關(guān)系，從而推測(cè)Bax基因表達(dá)可能與舌苔厚度有關(guān)。吳正治等[43]通過(guò)對(duì)正常薄白苔、薄苔、厚苔、剝苔的取樣與分析發(fā)現(xiàn)，各組舌苔均能夠發(fā)現(xiàn)舌上皮細(xì)胞凋亡的發(fā)生，分析出厚苔可能與Bax、TGF-β3 mRNA的低表達(dá)有關(guān)，剝苔可能與Bax、fas基因的過(guò)度表達(dá)有關(guān)，整體呈現(xiàn)舌苔厚度變化與凋亡表達(dá)變化趨勢(shì)相反。研究結(jié)果表明凋亡相關(guān)基因不同水平的變化會(huì)引起舌苔上皮細(xì)胞的凋亡發(fā)生，從而導(dǎo)致舌苔出現(xiàn)不同的變化。佟書(shū)娟等[44]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)黃厚苔中Fas基因的表達(dá)最高。呂軍影等[45]對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的舌苔上皮細(xì)胞基因表達(dá)譜分析中發(fā)現(xiàn)，濕熱郁型證表現(xiàn)出與舌苔變化一致的規(guī)律。綜合以上研究結(jié)果可以提示舌苔厚度變化的重要因素可能是凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平[46-47]。

從當(dāng)前研究進(jìn)展中可以看出，凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平可能引起舌苔厚度的變化，并發(fā)現(xiàn)了部分凋亡表達(dá)基因。但是當(dāng)前研究集中在了薄厚苔的區(qū)分上，而對(duì)其它的舌苔舌象研究不足，還不能形成相關(guān)科學(xué)理論和系統(tǒng)。

5 當(dāng)前研究存在的問(wèn)題

（1）采集技術(shù)與研究方法沒(méi)有形成規(guī)范化。不同的研究者使用的采集設(shè)備，采集技術(shù)存在差異，采集對(duì)象沒(méi)有規(guī)范化，采集樣本位置不統(tǒng)一，與采集對(duì)象和采集樣本相對(duì)應(yīng)的臨床診斷、病理檢測(cè)等信息同樣不規(guī)范，因此在對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行整合的過(guò)程中，很難實(shí)現(xiàn)研究的合并和交叉對(duì)比分析[4]。

（2）當(dāng)前研究大部分為小樣本研究，采集的樣本數(shù)據(jù)量有限，很少開(kāi)展多中心、大樣本的舌象微觀信息的標(biāo)準(zhǔn)采集與存儲(chǔ)，也沒(méi)有形成規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)的舌象微觀特征數(shù)據(jù)庫(kù)，不可避免的形成了數(shù)據(jù)孤島，從而給研究的深入進(jìn)行帶來(lái)了困難。

（3）典型舌象的研究較多，在對(duì)舌象的微生態(tài)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、基因表達(dá)譜研究過(guò)程中，大部分研究集中在黃厚膩苔上，而對(duì)舌質(zhì)與舌苔的其他表現(xiàn)則研究不足，所得到的研究成果還不足以涵蓋豐富的中醫(yī)舌診內(nèi)容。

（4）當(dāng)前大多數(shù)舌象微觀研究都屬于探索性研究，未形成系統(tǒng)總結(jié)或標(biāo)準(zhǔn)，研究流程與結(jié)果表達(dá)缺乏規(guī)范化，還不具備通用性，因此還不能作為指標(biāo)直接應(yīng)用于臨床疾病的診斷與療效評(píng)價(jià)之中。

6 微觀舌診研究的建議

（1） 研究方法的規(guī)范化

在進(jìn)行舌象微觀角度的分析過(guò)程中，采樣位置、采樣時(shí)間、檢測(cè)設(shè)備、檢測(cè)方法的選擇都會(huì)對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，因此需要對(duì)舌象微生態(tài)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、基因表達(dá)譜等微觀采集技術(shù)進(jìn)行研究并加以規(guī)范，能夠滿足準(zhǔn)確性、標(biāo)準(zhǔn)性、快速性、通用性等要求，為舌象的微觀角度數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)積累提供基礎(chǔ)。

（2） 微觀舌象數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建

舌象的微生態(tài)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、基因表達(dá)譜等方面都包含了舌體微觀角度的眾多信息，因此對(duì)微觀舌象進(jìn)行深入、系統(tǒng)的信息挖掘，從多種角度對(duì)舌象形成的分子機(jī)制研究進(jìn)行關(guān)聯(lián)與探索是舌診客觀化研究的重要內(nèi)容之一。因此，如何構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的微觀舌象信息數(shù)據(jù)庫(kù)是一項(xiàng)重要的研究任務(wù)。

（3） 微觀與宏觀舌象研究的結(jié)合

目前的中醫(yī)舌診客觀化研究大部分依賴于舌象圖像的分析與處理上，所得到的研究結(jié)果大多集中在宏觀舌象的特征提取與分析。因此將宏觀舌象的顏色、紋理、空間、光譜等特征與微觀角度的微生態(tài)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等不同信息進(jìn)行融合，建立舌象多模態(tài)客觀化研究模型，實(shí)現(xiàn)微觀與宏觀舌象研究的融合與交叉，對(duì)揭示中醫(yī)舌診的科學(xué)內(nèi)涵具有重要的意義。

（4） 新技術(shù)和新算法的引入與應(yīng)用

當(dāng)前的微觀舌象研究方法大多集中在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與聚類等，所用研究模型多為通用算法，沒(méi)有結(jié)合中醫(yī)舌診特色形成具有臨床實(shí)用價(jià)值的舌診客觀化分析算法。因此，在未來(lái)研究中需要進(jìn)一步引入最新的大數(shù)據(jù)、人工智能算法，注重多學(xué)科交叉融合，最終形成具有中醫(yī)特色、符合臨床需求的舌診標(biāo)準(zhǔn)量化技術(shù)方法與流程。

（5） 中醫(yī)微觀舌診儀等新設(shè)備的研發(fā)

當(dāng)前舌診儀器大多基于普通相機(jī)，對(duì)周圍環(huán)境、光線、顯示設(shè)備有著較高的要求。因此，研究新型的微觀舌診儀，實(shí)現(xiàn)對(duì)舌體便捷的采樣，能夠快速分析其微生態(tài)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、基因表達(dá)譜等多種角度的相關(guān)信息，也是未來(lái)中醫(yī)藥智能診療設(shè)備研發(fā)的重要方向。