β-glucan誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫及其在逆轉(zhuǎn)免疫耐受中的應(yīng)用

鐘秋梅張佳李林英鄭世進(jìn)*

(1. 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,福建 廈門 361100;2. 廈門大學(xué)細(xì)胞應(yīng)激生物學(xué)國家重點實驗室,福建 廈門 361100)

免疫記憶指當(dāng)機體初次刺激時能產(chǎn)生一個免疫反應(yīng),當(dāng)再次遇到同種刺激時機體能產(chǎn)生更強大的免疫反應(yīng)。1950 ~ 1960年,免疫學(xué)家一直認(rèn)為只有具有T/B淋巴細(xì)胞的脊椎動物才具有免疫記憶[1]。后天免疫反應(yīng)依賴于T/B淋巴細(xì)胞,特異性識別病原體并建立該特定感染的免疫記憶。在第2次遇到相同的病原體時,記憶T/B細(xì)胞的克隆擴增會誘導(dǎo)快速有效的反應(yīng)。然而,在后面的研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)在一些植物或非脊椎動物,甚至一些細(xì)菌和古細(xì)菌中也有免疫記憶,但顯然它們的免疫記憶并不是由T/B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的[1]。研究報道,缺乏T/B細(xì)胞的Rag1-/-小鼠初次感染過非致死劑量的白色念珠菌(Candidaalbicans),當(dāng)再次感染時能夠抵抗感染而存活下來[2]。這說明先天免疫系統(tǒng)也能介導(dǎo)一種免疫記憶的產(chǎn)生,后來免疫學(xué)家將這種先天免疫介導(dǎo)的保護(hù)作用定義為訓(xùn)練免疫(trained immunity)[3]。訓(xùn)練免疫是指先天免疫系統(tǒng)在首次遇到刺激后,經(jīng)過急性反應(yīng)回到穩(wěn)態(tài)后,當(dāng)再次遇到同源或異源刺激時,機體能產(chǎn)生更快速的免疫應(yīng)答,從而保護(hù)機體。β-葡聚糖(β-glucan)是訓(xùn)練免疫的典型誘導(dǎo)劑,β-glucan訓(xùn)練免疫模型最開始在人源單核細(xì)胞中建立。先天免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,當(dāng)?shù)?次遇到β-glucan時,細(xì)胞內(nèi)糖代謝途徑向有氧糖酵解轉(zhuǎn)變,同時促進(jìn)附近的組蛋白甲基化進(jìn)行重編程,細(xì)胞內(nèi)的Akt-mTOR信號通路也會被激活等[4]。當(dāng)再次遇到同源或異源刺激時,巨噬細(xì)胞會產(chǎn)生更迅速和更強大的免疫反應(yīng)以抵抗感染,保護(hù)機體。這表明訓(xùn)練免疫可賦予先天免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫記憶,對后續(xù)的細(xì)菌感染等能做出及時有效的免疫應(yīng)答[5]。

敗血癥(sepsis)指致病菌進(jìn)入血液并在其中繁殖,通過血液循環(huán)向全身擴散,從而引發(fā)全身性感染。敗血癥每年造成20萬 ~ 30萬人死亡,是導(dǎo)致發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家人口死亡的主要因素之一[6]。敗血癥的病理進(jìn)程分為兩個部分,主要由細(xì)菌感染引發(fā),首先是進(jìn)入急性期,引發(fā)多種組織損傷和多器官衰竭,從而導(dǎo)致全身性功能障礙,該階段稱為全身性炎癥反應(yīng)綜合癥(systemic inflammatory response syndrome,SIRS);急性期過后機體將產(chǎn)生抗炎因子以限制炎癥反應(yīng)的損害,該階段稱為代償性抗炎綜合征(compensatory antiinflammatory syndrome,CARS)[7]。在敗血癥晚期階段的抗炎反應(yīng)會壓倒宿主,抵消宿主的初始反應(yīng),并可能導(dǎo)致全身性的免疫耐受。這種敗血癥引起的免疫耐受可以持續(xù)多年,使患者容易發(fā)生持續(xù)性和繼發(fā)性感染,從而增加死亡率。

為了研究敗血癥的臨床發(fā)病機制,并開發(fā)有效的治療方式,需要使用一些有效的實驗?zāi)Ｐ蛠砟M復(fù)制臨床敗血癥患者的病癥。以下幾種模型常用來研究敗血癥:靜脈注射脂多糖(LPS)、腹腔注射大腸桿菌(E.coli)以及盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)[8]。目前使用最廣泛的是CLP模型,與臨床敗血癥病癥具有高度的相容性。在該模型中,敗血癥起源于腹腔內(nèi)的多種細(xì)菌感染,隨后細(xì)菌易位進(jìn)入血液,然后引發(fā)全身性的炎癥反應(yīng)[9]。CLP模型可重復(fù)性高,可以通過控制針頭尺寸、盲腸穿刺次數(shù)和抗生素的使用來改變敗血癥的嚴(yán)重程度[10]。

目前敗血癥的治療仍舊是一個難題,找到確切的分子機制有效治療敗血癥是首要任務(wù)。訓(xùn)練免疫和免疫耐受是兩種功能狀態(tài)相反的免疫應(yīng)答,目前鮮有研究報道通過誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫來逆轉(zhuǎn)敗血癥引發(fā)的免疫耐受狀態(tài)。Novakovic等[11]發(fā)現(xiàn)βglucan加入到免疫系統(tǒng)不再發(fā)揮功能的受試驗者的血液樣品中,這些單核-巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答可于體外被重新激活。這表明應(yīng)用訓(xùn)練免疫逆轉(zhuǎn)免疫耐受狀態(tài)可能是治療敗血癥的可行策略。因此,本研究通過建立β-glucan訓(xùn)練免疫模型以及小鼠的CLP引起的免疫耐受模型,擬通過誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫逆轉(zhuǎn)免疫耐受并闡明其中的分子機制,為敗血癥治療提供一種可行策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本論文涉及的所有雄鼠(86只)均是SPF級的C57BL/6J背景,平均周齡為8周,體重約為22 g,購買于廈門大學(xué)實驗動物中心【SCXK(閩)2018-0003】。飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實驗動物中心的屏障環(huán)境中【SYXK(閩)2018-0009】,飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水,保持pH = 6.0 ~ 8.5,飼喂由廈門大學(xué)實驗動物中心提供的普通飼料。飼養(yǎng)環(huán)境:白光和暗光各12 h循環(huán)照射,溫度恒定,溫度控制在25℃左右,濕度:45% ~ 55%,換氣:每小時6 ~ 15次。所有小鼠實驗操作均通過動物保護(hù)與使用委員會審核批準(zhǔn),嚴(yán)格執(zhí)行廈門大學(xué)實驗動物中心(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)制定的動物福利保障條例,并履行動物實驗倫理承諾(XMULAC20200219)。

1.1.2 主要試劑與儀器

β-glucan(實驗室從白色念珠菌中自提),LPS(Invitrogen,tlrl-pb5lps),Mouse TNF-α ELISA試劑盒(Invitrogen,88-7324-76),Mouse IL-6 ELISA試劑盒(Invitrogen,88-7064-76),SYBR Green染料(AG,AG11701)。酶標(biāo)儀(Biotek,美國),凝膠成像儀(賽智,中國),CFX ConnectTM熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad,美國)。

1.2 方法

1.2.1 β-glucan在BMDM中訓(xùn)練免疫模型的建立

為了在體外建立訓(xùn)練免疫模型,因此分離C57BL/6J小鼠的脛骨,外源添加M-CSF刺激分化為成熟的巨噬細(xì)胞(bone marrow derivedmacrophage, BMDM),隨后向成熟分化的BMDM中加入40 μg/mL的β-glucan,24 h后換液,加入含10 ng/mL M-CSF的DMEM再培養(yǎng)6 d,中間第3天需補加一半含10 ng/mL M-CSF的DMEM。6 d后將細(xì)胞消化,用100 ng/mL LPS再次刺激4 h和24 h。

1.2.2 β-glucan誘導(dǎo)的體內(nèi)訓(xùn)練免疫模型

感染前的第7天和第4天采用腹腔注射的方式注射200 μL體積1 mg的β-glucan,共注射2次,在7 d的時候感染致死劑量104CFUs的金黃色葡糖球菌(Staphylococcusaureus115-69)。

1.2.3 CLP模型

為了探究如何改善敗血癥引發(fā)的免疫耐受,CLP手術(shù)在本研究用于建立敗血癥免疫耐受模型,操作與先前文獻(xiàn)報道一致[9]。簡單來說,手術(shù)前給小鼠腹腔注射與體重相適應(yīng)的1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)以麻醉(單位:μL)。腹部的毛發(fā)用剃毛器剃除以暴露腹部皮膚,隨后依次剪開表皮和內(nèi)皮,傷口大小為1 cm左右,找到盲腸,隨后用醫(yī)用真絲編織線(上海金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司)結(jié)扎,然后用注射器對穿一次后擠出1 mm的糞便。結(jié)扎的位置和穿刺注射器的大小根據(jù)實驗所需要的死亡率而定。隨后將盲腸還原至腹腔,然后依次縫合內(nèi)皮和外皮。手術(shù)結(jié)束,背部皮下注射1 mL 37℃的生理鹽水,以面部朝下的姿勢,熱照燈照射小鼠1 ~ 3 h左右,以恢復(fù)麻醉引起的常規(guī)體溫過低。

1.2.4 抗生素治療

CLP手術(shù)2 h后小鼠接受1次抗生素治療,隨后在手術(shù)后的第1天和第2天(共3次),背部皮下注射1 mL 25 mg/kg的抗生素亞胺培南(源葉,S26289)。對照組注射1 mL的含5%葡萄糖的乳酸林格氏液(5% dextrose in lactated ringer’s solution,D5W)。亞胺培南的使用能夠有效減少CLP后血液中細(xì)菌的數(shù)量,其劑量依照先前CLP模型和臨床使用情況[12-13]。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

106個細(xì)胞加入150 μL蛋白裂解液(1 mmol/L tris-HCl, 0.3 mol/L NaCl,0.01% SDS,1.5% NP40,120 mmol/L deoxycholate,1 mol/L MgCl2,含蛋白酶磷酸酶抑制劑),冰上裂解20 min后離心取上清。加入上樣緩沖液制備蛋白樣品,95℃加熱使其變性。加入10 μL的蛋白樣品到10%的SDS-PAGE凝膠中,90 ~ 130 V的電壓值跑樣。濕法轉(zhuǎn)膜,恒壓100 V轉(zhuǎn)膜90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5% BSA室溫封閉1 h,之后敷上相應(yīng)一抗于4℃搖床上,過夜。使用的一抗包括p70 S6 Kinase Antibody(Rabbit,CST,9202S),Phospho-p70 S6 Kinase(Thr389)Antibody(Rabbit,CST,9205S),4E-BP1(53H11)Rabbit mAb(Rabbit,CST,9644S),Phospho-4E-BP1(Thr37/46)(236B4)Rabbit mAb(Rabbit,CST,2855L),m-TOR Antibody(Rabbit,CST,2972S),Phospho-mTOR(Ser2448)Antibody (Rabbit,CST,2971S),稀釋比為1∶1000,β-tubulin(Mouse,SAB,48352)的稀釋比為1∶5000。第2天室溫孵育對應(yīng)一抗來源的辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記的二抗,最后使用ECL(四正柏,4AW012-500)顯色。

1.2.6 細(xì)胞因子、乳酸和NO測定

細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子使用商業(yè)化的TNF-α(Invitrogen,88-7324-76)和IL-6(Invitrogen,88-7064-76)ELISA試劑盒,操作按照說明書。乳酸測定方案中,乳酸與酶混合物(乳酸氧化酶和HRP)特異性反應(yīng)生成產(chǎn)物,該產(chǎn)物與Amplex red(sigma,119171-73-2)相互作用生成顏色和熒光(Ex/Em=535/590 nm)。NO測定按照Griess法。

1.2.7 mRNA的提取和RT-PCR

在第6天,經(jīng)訓(xùn)練后的細(xì)胞用100 ng/mL LPS刺激4 h后收集RNA。mRNA的提取采用磁珠法,105個細(xì)胞中加入150 μL裂解液(100 mmol/L Tris-HCl pH = 7.5, 0.5 mol/L LiCl,10 mmol/L EDTA,1.5% SDS,5 mmol/L DTT),取120 μL加入6μL磁珠(Biotin-oligo dT streptavidin magnetic beads)室溫結(jié)合5 min;置磁力架上待液體澄清,棄掉上清;隨后用洗滌液A(10 mmol/L Tris-HCl pH = 7.5,0.15 mol/L LiCl,1 mmol/L EDTA,0.1% SDS)洗滌1次,洗滌液B(10 mmol/L Tris-HCl pH = 7.5,0.15 mol/L LiCl,1 mmol/L EDTA)洗2次,最后加入15 μL Tris-HCl(10 mmol/L,pH = 7.5)于80℃加熱2 min洗脫。cDNA合成使用碧云天dNTP(D7366),RNase抑制劑(AG11608)和逆轉(zhuǎn)錄酶(AG11605)。RTPCR使用SYBR Green 染料(AG,AG11701),操作按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗均采用隨機分配的小鼠進(jìn)行,不設(shè)研究者盲法。實驗的細(xì)節(jié)可以在結(jié)果中找到。所有數(shù)據(jù)點和“n”值反映了生物復(fù)制(即小鼠)。使用GraphPad Prism 8.0.3.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,結(jié)果用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。以P< 0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 β-glucan在BMDM中訓(xùn)練免疫模型的建立

雖然先前科學(xué)家們在人源單核細(xì)胞中已成功建立訓(xùn)練免疫模型,但是為了進(jìn)一步理清訓(xùn)練免疫模型的機制,小鼠作為比較好的模式動物,建立小鼠訓(xùn)練免疫模型能夠為研究訓(xùn)練免疫機制帶來便利。因此,首要目標(biāo)是在BMDM中建立一個細(xì)胞模型來驗證訓(xùn)練免疫反應(yīng)的形成(圖1A)。訓(xùn)練免疫能夠促進(jìn)先天免疫細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。先前研究表明,在敗血癥的早期階段,訓(xùn)練免疫能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型極化[14]。結(jié)果表明,β-glucan訓(xùn)練增強BMDM促炎因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生(圖1B)。同時,通過qPCR檢測LPS刺激4 h后抽提的mRNA在TNF和IL-6在轉(zhuǎn)錄水平上的差異。結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)錄水平上經(jīng)β-glucan訓(xùn)練的BMDM炎癥因子TNF并沒有顯著性差異,然而IL-6顯著高于未被訓(xùn)練的BMDM(圖1C)。在先天免疫細(xì)胞中,巨噬細(xì)胞使最早觀察到產(chǎn)生一氧化氮(NO)的細(xì)胞,NO發(fā)揮其抗菌抗炎的作用以清除病毒、細(xì)菌和真菌等感染[15]。因此,通過Griess法檢測了訓(xùn)練前后BMDM產(chǎn)生NO的水平差異。結(jié)果表明,與未訓(xùn)練的BMDM相比,當(dāng)LPS再次刺激時,訓(xùn)練后的BMDM產(chǎn)生NO的水平明顯高于未被訓(xùn)練的BMDM(圖1D)。從形態(tài)學(xué)上觀察,β-glucan訓(xùn)練后使BMDM增大。同時,將細(xì)胞消化下來用自動細(xì)胞計數(shù)儀(Automated Cell Counter LUNA II)檢測細(xì)胞直徑。從數(shù)值上看,經(jīng)過β-glucan訓(xùn)練的BMDM直徑明顯大于對照組(圖1E)。提示細(xì)胞內(nèi)的m-TOR信號通路有可能被活化,因此通過蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測了m-TOR及其下游調(diào)控蛋白質(zhì)合成的靶蛋白磷蛋白70核糖體蛋白S6激酶(phosphoprotein 70 ribosomal protein S6 kinase-1,p70s6k)和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1),該通路的活化表現(xiàn)為p70s6k和4EBP1磷酸化。結(jié)果顯示,βglucan訓(xùn)練會增強m-TOR、p70s6k和4EBP1的磷酸化。考慮到訓(xùn)練免疫的代謝基礎(chǔ)是有氧糖酵解,研究也聚焦于糖酵解相關(guān)蛋白即己糖激酶-1(Hexokinase-1,HK1)和己糖激酶-3(Hexokinase-3,HK3)的變化,結(jié)果表明β-glucan訓(xùn)練增加HK1和HK3的表達(dá)(圖1F)。除此之外,乳酸在免疫調(diào)節(jié)中也能夠發(fā)揮重要作用,研究也關(guān)注乳酸的變化。結(jié)果表明,β-glucan訓(xùn)練使BMDM產(chǎn)生更多的乳酸分泌于上清中(圖1G)。

圖1 β-glucan在BMDM中誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫Note. A. Schematic of in vitro β-glucan induced trained immunity experimental setup. B. Supernatant collected from 24 h LPS re-stimulation were measured by TNF-α and IL-6 commercial ELISA kit. C. mRNA level of TNF and IL-6 were measured by qPCR, cells collected from 4 h LPS restimulation. D. Supernatant collected from 24 h LPS re-stimulation were measured following Griess assay protocol. E. After RIMI or β-glucan trained, the cell images were snapped by microscope at a 20 fold magnification. F. Western Blot analysis the protein level of m-TOR, 4EBP1, p70s6k, HK1 and HK3. G. Supernatants collected from 24 h LPS re-stimulation were measured following lactate assay protocol.Figure 1 β-glucan induced trained immunity in BMDM

以上結(jié)果表明,在體外BMDM中成功建立了訓(xùn)練免疫模型,并且與先前人源單核細(xì)胞訓(xùn)練免疫模型一致[4]。

2.2 β-glucan體內(nèi)誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫具有保護(hù)作用

先前研究成功在體外建立了訓(xùn)練免疫模型,因此進(jìn)一步研究擬在體內(nèi)建立訓(xùn)練免疫模型。以8周齡大的野生型C57BL/6J雄鼠作為實驗對象,在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus115-69,S.aureus115-69)感染的前7 d和前4 d腹腔注射β-glucan,每次每只為1 mg(見圖2A)。結(jié)果表明,β-glucan在體內(nèi)誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫能保護(hù)致病菌S.aureus115-69誘導(dǎo)的感染,提高小鼠的生存率(見圖2B)。

圖2 β-glucan在體內(nèi)誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫能抵抗S.aureus的感染(n = 5)Note. A. The scheme of β-glucan induced trained immunity in vivo. B. The survival curve of S.aureus 115-69 in abdominal infection.Figure 2 β-glucan induced trained immunity protected from S.aureus infection(n = 5)

2.3 β-glucan在體外可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的免疫耐受

由于訓(xùn)練免疫能夠促進(jìn)免疫應(yīng)答,因此對誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫是否能夠逆轉(zhuǎn)免疫耐受進(jìn)行了研究。首先,LPS刺激成熟分化的BMDM 24 h以引起巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫耐受。隨后,再用β-glucan刺激BMDM 24 h,換上含10 ng/mL M-CSF的DMEM靜置培養(yǎng)BMDM 1 d。最后,再次用LPS刺激BMDM(圖3A)。通過檢測促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的變化水平來反映耐受的逆轉(zhuǎn)情況。與耐受的BMDM相比,β-glucan逆轉(zhuǎn)組產(chǎn)生的TNF-α和IL-6更高,甚至比原始狀態(tài)下的BMDM還產(chǎn)生更多的促炎細(xì)胞因子(圖3B,3C)。從RNA水平分析TNF和IL-6的變化也觀察到一樣的趨勢,β-glucan逆轉(zhuǎn)組TNF和IL-6基因表達(dá)在一定程度上得到恢復(fù)(圖3D,3E)。同時檢測了NO的分泌水平,β-glucan逆轉(zhuǎn)組產(chǎn)生的一氧化氮明顯高于耐受組,甚至比原始狀態(tài)下的BMDM還要產(chǎn)生更多(圖3F)。上述結(jié)果一致表明,在體外β-glucan能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的免疫耐受。

圖3 β-glucan逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的免疫耐受Note. A. The in vitro BMDM tolerance reversal model, with β-glucan added therapeutically after 24 h of 100 ng/mL LPS exposure, let BMDM rested for 1 day and re-stimulated with LPS. B, C. Supernatant collected from 24 h LPS re-stimulation were measured by TNF-α and IL-6 commercial ELISA kit. D, E. mRNA level of TNF-α and IL-6 were measured by qPCR, cells collected from 4 h LPS re-stimulation. F. Supernatant collected from 24 h LPS restimulation were measured following Griess assay protocol.Figure 3 β-glucan can reverse LPS-induced immune tolerance

2.4 體內(nèi)免疫耐受模型的建立

鑒于訓(xùn)練免疫能夠在體外逆轉(zhuǎn)免疫耐受,因此研究提出假設(shè)訓(xùn)練免疫同樣能夠逆轉(zhuǎn)體內(nèi)免疫耐受。通過給小鼠實施CLP手術(shù)引起多種微生物感染導(dǎo)致免疫耐受作為動物模型。在CLP手術(shù)(25 G,20%)7 d后,使小鼠感染一個非致死劑量的白色念珠菌(CandidaalbicansATCC MTA-3573(UC 820)),觀察小鼠在此情形下是否處于免疫耐受狀態(tài)(圖4A)。結(jié)果顯示,在CLP第7天感染時,CLP組的存活率都明顯低于Sham組(圖4B)。之前的報導(dǎo)顯示血液中IL-6濃度可作為敗血癥死亡率的最佳預(yù)測因子[16],因此對術(shù)后6、24和48 h尾靜脈采血分離的血清中IL-6的水平進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,CLP組的IL-6會在術(shù)后6 h立即升高,在24 h后這種細(xì)胞因子引起的細(xì)胞風(fēng)暴已經(jīng)減少,直至48 h細(xì)胞因子風(fēng)暴消失(圖4C)?？紤]到在CLP手術(shù)7 d后,小鼠大約有20%的致死率(圖4D),因此改變盲腸結(jié)扎的位置以降低CLP組的致死率,同時CLP手術(shù)3 d后就感染劑量減半的C.albicans,以明確機體免疫耐受出現(xiàn)的最早時間(圖5A)。結(jié)果顯示,CLP組的存活率明顯低于Sham組,而且在術(shù)后3 d感染減半的C.albicans致死現(xiàn)象比術(shù)后7 d感染更嚴(yán)重(圖5B)。因此,CLP 3 d后的體內(nèi)免疫耐受模型,可用于免疫耐受逆轉(zhuǎn)的后續(xù)研究。

圖5 體內(nèi)免疫耐受模型的建立(n = 5,3 d)Note. A. The scheme of immune tolerance model in vivo, cecum was ligated (10%) and punctured once with a 25 G needle. B. The survival curves of C.albicans for tail vein infection 3 days after CLP.Figure 5 Establishment of an in vivo immune tolerance model(n = 5,3 d)

2.5 β-glucan在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)免疫耐受的功能探索

構(gòu)建體內(nèi)免疫耐受模型選擇的是在感染前3 d進(jìn)行CLP手術(shù),條件是在盲腸10%處結(jié)扎及用25 G的穿刺針對穿。β-glucan的治療設(shè)為3組,分別為術(shù)后第1天、術(shù)后第2天、術(shù)后第1天和第2天同時給藥,然后在術(shù)后的第3天進(jìn)行非致死劑量的C.albicans感染(圖6A)。從感染后的生存狀況來看,與PBS組相比,β-glucan治療組的生存率沒有顯著改變,并且與β-glucan干預(yù)治療的時間前后或者次數(shù)沒有太大相關(guān)性(圖6B)。感染3 h后尾靜脈采血,檢測小鼠體內(nèi)促炎細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生水平,與PBS組相比,β-glucan治療組的小鼠產(chǎn)生的IL-6也沒有改變(圖6C)。這個結(jié)果與生存曲線一致,說明在體內(nèi)β-glucan的治療并不能像體外一樣通過恢復(fù)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生來逆轉(zhuǎn)免疫耐受狀態(tài),從而提高抗感染時的生存率。

圖6 β-glucan在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)免疫耐受的功能探索(n=4~5)Note. A. Diagram of experimental design model. B. The survival curve 3 days post CLP after infected with 105 CFUs C.albicans through tail vein.C. The serum IL-6 level 3 h after infected with C.albicans.Figure 6 Functional exploration of β-glucan in reversing immune tolerance in vivo (n=4~5)

在敗血癥患者的急性期,為了控制病情醫(yī)生會考慮給予抗生素治療。為了更密切的模擬臨床敗血癥,研究采用了另外一種CLP模型。在盲腸20%處結(jié)扎,用23 G的穿刺針對穿,致死率大約為40%的CLP模型[17]。然后在CLP手術(shù)后的2 h,第1天和第2天分別給抗生素治療?？股貋啺放嗄?imipenem)對革蘭氏陽性、陰性的需氧和厭氧菌具有抗菌作用,可用于敏感菌引起的敗血癥等[12]。在該CLP模型中亞胺培南的確能夠減少死亡率,但對CLP引起的體重減輕癥狀沒有緩解(圖7A,7B)。根據(jù)2.2結(jié)果中證明了β-glucan在感染前7 d和前4 d的兩次給藥,能有效抵抗感染,具有保護(hù)作用,所以在感染前7 d和前4 d(即CLP手術(shù)后的第5天和第8天)給β-glucan治療,在CLP手術(shù)后第12天時進(jìn)行再次細(xì)菌感染(圖7C)。結(jié)果表明,在此模型條件下,β-glucan的治療也并不能完全逆轉(zhuǎn)小鼠的免疫耐受狀態(tài),提高再次感染時的生存率(圖7D,7E,7F)。

圖7 β-glucan在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)免疫耐受的功能探索Note. A. The survival curve after treatment with imipenem, CLP condition was cecum was ligated (20%) and punctured once with a 23 G needle(n=4). B. Weight loss after treatment with imipenem(n=4). C. The in vivo tolerance reversal model. D. The survival curve within 12 days after CLP(n=5). E. Weight loss within 12 days after CLP(n=5). F. The survival curve of 103 × CFUs S.aureus in abdominal infection(n=5).Figure 7 Functional exploration of β-glucan in reversing immune tolerance in vivo

總的來講,目前探究從β-glucan治療后小鼠的生存情況雖然沒有得到改善,但是我們推測訓(xùn)練免疫的誘導(dǎo)可能通過改變體內(nèi)先天免疫細(xì)胞的比例組成,進(jìn)而改善體內(nèi)免疫耐受狀態(tài),只是不足以從生存率上面體現(xiàn)。因此,關(guān)于β-glucan在體內(nèi)是否能夠逆轉(zhuǎn)免疫耐受以及逆轉(zhuǎn)耐受的機理還得需要繼續(xù)探究。

3 討論

β-glucan是體外和體內(nèi)訓(xùn)練免疫的典型誘導(dǎo)劑,其刺激可使巨噬細(xì)胞具有長期的促炎表型,從而增強機體對再感染的免疫應(yīng)答[5,18]。在這項研究結(jié)果中,證實了BMDM經(jīng)β-glucan訓(xùn)練之后,當(dāng)二次遇到同源或異源刺激時細(xì)胞內(nèi)能產(chǎn)生更高水平的促炎因子TNF-α、IL-6,分泌更多的NO;細(xì)胞代謝模式發(fā)生重要改變即向糖酵解轉(zhuǎn)變,分泌更多的乳酸;細(xì)胞內(nèi)的m-TOR信號通路活化。同時,經(jīng)過β-glucan訓(xùn)練的小鼠能夠有效抵抗S.aureus的感染。

與訓(xùn)練免疫相反的功能狀態(tài)是免疫耐受,耐受細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄處于無法激活的狀態(tài),并且再刺激時無法發(fā)揮其功能。敗血癥在細(xì)胞因子風(fēng)暴結(jié)束后,進(jìn)入第二階段免疫耐受。免疫耐受狀態(tài)的逆轉(zhuǎn)引起了研究者的關(guān)注,因為從炎癥阻斷治療方面來降低敗血癥的整體死亡率的成功案例有限,并且因為大多數(shù)敗血癥的死亡往往發(fā)生在耐受階段期間的醫(yī)院二次感染[19]。巨噬細(xì)胞經(jīng)訓(xùn)練免疫誘導(dǎo)可以對繼發(fā)感染產(chǎn)生更強的吞噬反應(yīng),這種反應(yīng)可以由多種微生物相關(guān)分子模式(MAMP)誘導(dǎo),例如白色念珠菌、卡介苗(BCG)和β-glucan[2,11]。根據(jù)訓(xùn)練免疫和免疫耐受的功能特點,想通過在已經(jīng)處于免疫耐受的細(xì)胞中,加入能夠誘導(dǎo)訓(xùn)練免疫的物質(zhì),探究細(xì)胞的免疫耐受狀態(tài)是否可以被逆轉(zhuǎn)。假設(shè)β-glucan是可以逆轉(zhuǎn)免疫耐受的。在免疫耐受逆轉(zhuǎn)的體外研究結(jié)果中,β-glucan在一定程度上確實能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的免疫耐受。已有研究發(fā)現(xiàn),LPS誘導(dǎo)耐受的巨噬細(xì)胞和β-glucan訓(xùn)練過的巨噬細(xì)胞具有不同的表觀遺傳和代謝模式[11]。

有研究表明,IFN-γ可以部分恢復(fù)從敗血癥患者體內(nèi)分離的耐受單核細(xì)胞的代謝功能[20]。因此,想在體內(nèi)探究β-glucan是否能夠改變由CLP誘導(dǎo)的免疫耐受狀態(tài),從而提高再次感染時的存活率。進(jìn)一步用CLP模型模擬敗血癥,在感染金黃色葡萄球菌之前給β-glucan治療,但β-glucan并沒有提高CLP組再感染時的存活率。隨之,又重新建立一種聯(lián)合抗生素亞胺培南治療的CLP模型,在此情形下,β-glucan治療的CLP組的生存率與PBS治療的CLP組相比,沒有顯著性差異。雖然在體內(nèi)應(yīng)用βglucan逆轉(zhuǎn)沒有得到預(yù)期的實驗結(jié)果,但是證實了先天免疫“訓(xùn)練者”β-glucan在體外可以逆轉(zhuǎn)巨噬細(xì)胞免疫耐受。

針對進(jìn)一步體內(nèi)免疫耐受逆轉(zhuǎn)的研究,考慮是否β-glucan改變了一些免疫細(xì)胞如單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等的比例組成,以及這些細(xì)胞的反應(yīng)性改變。有研究表明,在由E.coli感染引起的腹膜炎中,經(jīng)酵母聚糖訓(xùn)練的小鼠,其腹腔細(xì)胞組成由維持穩(wěn)態(tài)的大腹腔巨噬細(xì)胞向促炎的小腹腔巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變[5]。此外,宿主的單核細(xì)胞數(shù)目增多可介導(dǎo)白色念珠菌誘導(dǎo)的訓(xùn)練免疫,增強宿主二次感染免疫應(yīng)答能力[2]。因此,我們提出假設(shè)細(xì)胞群表型和特定細(xì)胞群數(shù)量的改變可能在介導(dǎo)訓(xùn)練免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

綜上所述,成功地在小鼠BMDM中用β-glucan建立了體外訓(xùn)練免疫模型。之后建立了CLP免疫耐受模型,確定一個能夠?qū)е旅庖吣褪艿滤缆实偷臈l件,以及致死率過半但聯(lián)合抗生素治療能夠減少死亡率的條件。在體外中證明了β-glucan能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的免疫耐受,驗證了β-glucan在體內(nèi)能夠有效抵抗金黃色葡萄球菌的感染。但是目前結(jié)果尚未證明β-glucan能夠逆轉(zhuǎn)CLP誘導(dǎo)的免疫耐受,提高二次感染時的存活率。