麥玉輪作農(nóng)田秸稈降解真菌的篩選與鐮刀菌拮抗特性研究

李月， 譚金芳， 陳林， 梅浩， 王祎， 李慧， 李芳， 韓燕來

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 州 450002；2.中山大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510000；3.中國科學(xué)院南京土壤研究所，江蘇 南京 210000)

秸稈還田是各地大力推廣、應(yīng)用最多的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式，也是當(dāng)前中國秸稈資源利用的主渠道[1]。自20世紀(jì)90年代秸稈還田技術(shù)在中國被廣泛推廣以來，其在農(nóng)田肥力提升、緩解秸稈焚燒所帶來的空氣污染方面的貢獻(xiàn)受到普遍的認(rèn)可。然而，有研究顯示，秸稈還田小區(qū)小麥根腐病、紋枯病、全蝕病發(fā)病率顯著高于秸稈移除處理，且發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢[2-3]。因此，土傳病害高發(fā)是長期秸稈還田過程中的熱點(diǎn)問題。亦有研究顯示，秸稈還田非但沒有增加土傳病害的發(fā)病率，反而抑制了鐮刀屬病原菌的生長，降低作物土傳病害的發(fā)病率[4-5]。由此可見，秸稈還田對于土壤病原菌的作用及最終發(fā)病率表征因各地的環(huán)境、土壤條件和農(nóng)業(yè)管理措施而異。

土壤微生物作為主要的分解者，維系著農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的平衡，與作物的健康和還田秸稈的降解密切相關(guān)[6]。研究表明，秸稈還田后，不僅顯著增加了纖維素降解功能微生物豐度[7-8]，而且促進(jìn)了部分富營養(yǎng)型病原菌的增加[9]。韋中等[10]提出，依托有益菌與病原菌之間的拮抗關(guān)系來維系農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的健康是行之有效的途徑之一。與細(xì)菌相比，真菌在秸稈的降解過程中表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在耕作農(nóng)田中真菌對新加入纖維素的反應(yīng)迅速而且持久，尤其是在秸稈降解的后期階段，真菌比細(xì)菌更加活躍[11-12]。研究表明，高效降解纖維素和木質(zhì)素的毛殼菌屬真菌的豐度與土傳病害的發(fā)生率呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系[13-14]。長期定位試驗(yàn)表明，擔(dān)子菌門和子囊菌門真菌豐度在秸稈還田處理下增加，并且增加了有益的功能性真菌的種類和數(shù)量[15]。

黃淮海地區(qū)作為農(nóng)業(yè)主產(chǎn)區(qū)，以麥玉輪作系統(tǒng)作為主要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式，其秸稈還田量巨大。然而，對于麥玉輪作農(nóng)田秸稈還田引起的土壤有益菌及致病菌的變化情況目前尚無系統(tǒng)研究。因此，本研究選擇河南省麥玉輪作區(qū)代表性土壤類型潮土和砂姜黑土作為研究對象，對秸稈還田條件下土壤秸稈降解真菌進(jìn)行篩選鑒定，對其抑菌特性進(jìn)行評價(jià)，以明確潮土和砂姜黑土秸稈降解過程中有益菌和病原菌變化的共性及個(gè)性特征，為建立秸稈還田下土壤有益和病原真菌資源庫，更好地解決秸稈還田引起的農(nóng)作物土傳病害頻發(fā)問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 纖維素降解真菌的篩選

供試土壤均采自連續(xù)秸稈還田10 a以上的農(nóng)田土壤，土壤類型分別為河南省原陽教科園區(qū)的壤質(zhì)潮土，封丘縣潘店鎮(zhèn)沙質(zhì)潮土，駐馬店市西平縣酸性砂姜黑土和南陽市方城縣黃褐土，共計(jì)4份土壤樣品。于2018年玉米收獲后用土鉆按照五點(diǎn)采樣法采集秸稈還田處理的耕層土壤，去除土壤中的石塊和雜質(zhì)，過2 mm篩，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.1 篩選培養(yǎng)基 KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，KNO30.5 g，NH4NO30.1 g，瓊脂粉20 g，球磨纖維素粉20 g，蒸餾水1 L。剛果紅纖維素培養(yǎng)基：在篩選培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加剛果紅0.2 g。培養(yǎng)基分別定容分裝后高溫高壓滅菌20 min，冷卻備用。

1.1.2 稀釋涂平板法 將處理好的土壤樣品稱取5.0 g，置于滅菌三角瓶中，加入50 mL無菌水和無菌玻璃珠，置于28 ℃，150 r·min-1，震蕩培養(yǎng)30 min，即母液。對母液進(jìn)行梯度稀釋，將稀釋的倍數(shù)分別是10-1、10-2、10-3的樣品溶液涂布到篩選培養(yǎng)基上。倒平板前，每100 mL培養(yǎng)基加入50 g·L-1卡那霉素100 μL，用于抑制細(xì)菌生長。28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，挑取平板上的單菌落到新的PDA平板上培養(yǎng)，連續(xù)幾代轉(zhuǎn)接，直至得到純菌落后進(jìn)行鑒定。

1.2 菌種鑒定

使用Takara公司生產(chǎn)的Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR試劑，按照說明書操作快速獲取真菌DNA。真菌DNA擴(kuò)增：提取得到的真菌DNA對其ITS1F[16-17]區(qū)的擴(kuò)增，采用引物ITS1F/ITS2[18]。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：2×HiFi Hot Start Ready Mix 30 μL，引物(10 μmol·L-1)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5min，95 ℃ 40 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，采用Sanger測序技術(shù)進(jìn)行測序。序列通過National Center for Biotechnology Information數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST，初步確定這些菌株種類。

1.3 秸稈降解能力預(yù)判

將純化并鑒定的菌株用打孔器(直徑約0.5 cm)打孔后，接種于剛果紅纖維素培養(yǎng)基平板(9 cm)的中央，28 ℃培養(yǎng)3 d。根據(jù)剛果紅纖維素培養(yǎng)基菌落周圍水解圈直徑的大小，初步評價(jià)菌株的纖維素降解能力[19-20]。本研究中采用的分級標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)水解圈直徑d≥4 cm判定為纖維素快速降解真菌，當(dāng)3 cm

1.4 拮抗試驗(yàn)

基于PDA培養(yǎng)基進(jìn)行鐮刀菌和其他秸稈降解真菌的拮抗試驗(yàn)。將致病菌接種于平板的中央，生防菌接種于致病菌的四周，僅接種鐮刀菌的平板作為對照，28 ℃培養(yǎng)3 d。觀察致病菌和生防菌生長時(shí)的拮抗情況，根據(jù)對照組和處理組病原菌落的直徑，按照公式：生長速率=(單一致病菌菌落直徑-接種生防菌后致病菌菌落直徑)/單一致病菌菌落直徑×100%，計(jì)算不同生防真菌對致病真菌生長速率的抑制情況，以致病菌生長速率≥30%作為具有拮抗效應(yīng)的判斷依據(jù)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種的篩選、秸稈降解能力及抗病潛力預(yù)判

使用初篩培養(yǎng)基，從4份土壤中篩選得到200株真菌，通過對其ITS區(qū)測序結(jié)果的比對，將序列100%相似的菌株合后，得到64株真菌。經(jīng)過鑒定，這些菌株全部屬于子囊菌門，包括了7個(gè)科和10個(gè)屬，并對各個(gè)屬真菌占篩選得到全部菌種的百分比進(jìn)行展示(圖1)。表1展示了64株真菌的鑒定信息以及來源，并對其分布進(jìn)行展示(圖2)。菌種序列已上傳到National Center for Biotechnology Information網(wǎng)站的GenBank，序列號為MZ353521-MZ353584。

表1 纖維素降解真菌鑒定信息及來源Table 1 Indentification information and sources of cellulose degradingstrains

續(xù)表 Continuing table

注：NA：未檢索到。下同。

2.2 纖維素降解能力預(yù)判

利用纖維素剛果紅培養(yǎng)基對菌株培養(yǎng)3 d，根據(jù)平板上產(chǎn)生的水解圈大小，評價(jià)菌株的纖維素降解效果，并對其親緣關(guān)系進(jìn)行分析(圖3)。其中，快速纖維素降解真菌有19株，分別是木霉屬(Trichoderma)的11個(gè)菌株、青霉屬(Penicillium)的2個(gè)菌株、毛殼屬(Chaetomium)的1個(gè)菌株，鐮刀菌屬(Fusarium)的2個(gè)菌株，曲霉屬(Aspergillus)的1個(gè)菌株，籃狀菌屬(Talaromyces)的2個(gè)菌株；纖維素降解速率居中的菌株共14個(gè)，分別是青霉屬(Penicillium)的5個(gè)菌株，彎孢屬(Curvularia)的1個(gè)菌株，鐮刀菌屬(Fusarium)的6個(gè)菌株，梭孢科屬(Thielavia)的2個(gè)菌株；降解速率較慢的菌株共12個(gè)，分別是：籃狀菌屬(Talaromyces)的3個(gè)菌株，曲霉屬(Aspergillus)的2個(gè)菌株，青霉屬(Penicillium)的2個(gè)菌株，Meyerozyma的1個(gè)菌株，鐮刀菌屬(Fusarium)的2個(gè)菌株、枝頂孢屬(Acremonium)的1個(gè)菌株，梭孢殼屬(Thielavia)的1個(gè)菌株。剩余19個(gè)菌株在培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生大量孢子，在平板上沒有形成整齊的水解圈，因而無法分類。

圖2 纖維素降解真菌篩選來源分布情況

圖3 纖維素降解真菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

2.3 拮抗試驗(yàn)

本研究通過對已經(jīng)篩選出來的64個(gè)菌種的ITS測序結(jié)果進(jìn)行親緣關(guān)系的比對及查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選出4株鐮刀屬真菌：茄鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)和禾谷鐮刀菌(Fusariumasiaticum)；29株非致病真菌，包括Meyerozyma1株；毛殼屬(Chaetomium)1株；梭孢殼屬(Thielavia)2株；籃狀菌屬(Talaromyces)8株；木霉屬(Trichoderma)9株；青霉屬(Penicillium)8株。

進(jìn)行拮抗試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，部分非致病真菌對2株生防真菌和3株病原真菌產(chǎn)生了抑制作用(圖4)，菌種之間出現(xiàn)了非常明顯的拮抗作用，當(dāng)生防菌對某種致病菌有抑制作用時(shí)，生防菌和致病菌之間出現(xiàn)了明顯的拮抗區(qū)域，致病菌生長速度減緩甚至不再生長。

注：a：球毛殼菌strain-45，b：尖孢鐮刀菌strain-47，c：茄鐮刀菌strain-33，d：草酸青霉菌strain-48，e：黃籃狀菌strain-50，f：NAstrain-34，g：黃籃狀菌strain-51。

圖5結(jié)果顯示，共有22株對茄鐮刀菌(Fusariumsolani)有拮抗作用，13株對禾谷鐮刀菌(Fusa-riumasiaticum)有拮抗作用，7株對層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)有拮抗作用，僅6株非致病真菌對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)有拮抗作用。其中，籃狀菌屬(Talaromyces)的8株真菌對禾谷鐮刀菌(Fusariumasiaticum)、層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)均沒有拮抗作用；微紫青霉(Penicilliumjanthinellumstrain-36)對4株鐮刀菌都有拮抗作用；木霉屬真菌(Trichodermasp. strain-24)對5株真菌產(chǎn)生拮抗效果；Meyerozymacaribbicastrain-62僅對茄鐮刀菌(Fusariumsolani)有拮抗效果。

圖5 鐮刀菌與其他秸稈降解真菌間的拮抗作用

3 結(jié)論與討論

已有研究表明，長期周期性的有機(jī)添加會引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變[22]。研究發(fā)現(xiàn)，長期秸稈還田會引起土壤中鐮刀屬真菌相對豐度的顯著增加[23]。鐮刀屬真菌引起的植物病害問題在全世界的農(nóng)作物生產(chǎn)中造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀屬真菌具有較強(qiáng)的纖維素降解能力。SISTA-KAMESHWAR等[25]通過對不同類型腐生真菌的研究中同樣證明了鐮刀屬真菌具有較強(qiáng)的纖維素、半纖維素和果膠降解能力。SARSAIYA等[26]利用羧甲基纖維素鈉為底物的Mander培養(yǎng)基篩選纖維素降解真菌的研究中，檢測到粉紅鐮刀菌(Fusariumroseum)可以產(chǎn)生較高活性的外切β-葡聚糖酶和內(nèi)切β-葡聚糖酶，尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)可產(chǎn)生內(nèi)切β-葡聚糖酶。尖孢鐮刀菌、輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)[27]、茄鐮刀菌(Fusariumsolani)[28]都被證明可以高效降解纖維素。其中，茄鐮刀菌(Fusariumsolani)被證實(shí)在防治作物真菌病害、促進(jìn)作物生長等方面有良好效果[29]。CHANG等[30]通過對鐮刀菌Q7-31T所產(chǎn)生的內(nèi)切β-葡聚糖酶和蛋白酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)的深入研究表明，該菌產(chǎn)生的酶在45 ℃時(shí)水浴30 min后仍然具有80%的生物活性，并在pH值5.0～8.0的范圍內(nèi)可以保持70%以上的生物活性，并能夠高效降解羧甲基纖維素鈉。GAWADE等[31]的研究表明，鐮刀屬致病真菌所產(chǎn)生的胞外酶，如纖維素分解酶、半纖維素分解酶、果膠分解酶和蛋白水解酶的活性在一定程度上決定了該病菌對寄主植物的侵染速率。由此可見，在沒有拮抗微生物存在的條件下，以鐮刀菌為主的病原真菌豐度在秸稈還田條件下的增加有一定的必然性，探索其拮抗物種對于土壤安全和植物健康意義重大。

木霉屬真菌在控制鐮刀菌引起的植物病害方面有巨大的潛力[32]。在本研究中，綠色木霉(Trichodermavirens)對茄鐮刀菌和禾谷鐮刀菌(Fsariumaminearum)均產(chǎn)生抑制效果，對尖孢鐮刀菌和層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)無明顯效果。哈茨木霉(Trichodermaharzianum)對鐮刀菌屬的4株病原真菌均有效。木霉屬真菌在土壤、作物根系和葉面中廣泛存在，被作為抗真菌病原體的生防制劑而廣泛應(yīng)用[33]。該屬真菌對番茄晚疫病[34]、莖腐病[34]等常見植物真菌病害的防治有顯著的效果。平板培養(yǎng)拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木霉屬真菌對莖腐病的抑制率達(dá)到69.52%～81.43%，同時(shí)會導(dǎo)致致病菌絲由白色變?yōu)樽丶t[34]。研究表明，木霉屬真菌對病原真菌的抑制不僅僅表現(xiàn)在養(yǎng)分和生長空間的爭奪上[35]，其產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)苯基乙醇有效地抑制病原真菌的生長?？股仡愇镔|(zhì)如滴蟲素Ⅵ，Ⅶ和Ⅷ均在木霉屬真菌產(chǎn)生的分泌物種被分離提純，并且在不同pH值、溫度甚至高壓滅菌條件下都保持生物活性，具有良好的抑菌效果[36]。BENTEZ等[37]的研究表明，木霉屬真菌可以寄生在紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)菌絲體上，通過分泌幾丁質(zhì)酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶等裂解酶破壞寄主的細(xì)胞壁，從而達(dá)到殺死病菌的效果。亦有研究認(rèn)為，木霉屬真菌可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性抵御病原真菌的侵染[38]。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，木霉屬真菌可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生生長素，并降低細(xì)胞分裂素和脫落酸的含量，從而促進(jìn)植株的生長[39]。自從20世紀(jì)60年代木霉屬真菌的纖維素降解能力被發(fā)現(xiàn)以來，人們不斷探索利用化學(xué)或物理誘變產(chǎn)生更高效纖維素酶突變體[40-41]。里氏木霉(Trichodermareesei)作為生物纖維素酶來源之一而被深入研究。在纖維素為底物條件下培養(yǎng)24 h后開始產(chǎn)生纖維素酶，并在48 h左右表現(xiàn)出最快的纖維素酶活性增強(qiáng)過程，72 h后達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，對纖維素底物具有很高的水解能力[42]。同時(shí)，哈茨木霉(Trichodermaharzianum)同樣被證實(shí)可以產(chǎn)生活性較高的幾丁質(zhì)酶和纖維素酶[43]。木霉屬真菌在工業(yè)領(lǐng)域被用于生產(chǎn)果膠酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶等多種酶類，在食品、紡織、釀造等領(lǐng)域也發(fā)揮著巨大作用[44]。本研究顯示，篩選得到的11株木霉屬真菌均具有纖維素降解能力。

纖維素作為世界上產(chǎn)量最大的可再生資源，其利用率極低。木霉屬和鐮刀屬真菌在自然界生存范圍極為廣泛，可以利用這兩個(gè)屬的真菌降解纖維素，已達(dá)到資源的最大化利用。其中，木霉屬真菌對多種致病真菌有極為有效的防治作用，在開發(fā)生防制劑方面的應(yīng)用更加廣闊，不僅能夠防治真菌病害，還有利于作物的生長與產(chǎn)量的增加。根據(jù)本研究結(jié)果，不僅可以快速鎖定抑制病害微生物的菌種，同時(shí)可以避免對某些益生菌的抑制，有效提高真菌病害的生物防治效果，并在一定程度上促進(jìn)作物生長與產(chǎn)量的增加。

從目前實(shí)際情況來看，幾乎所有的秸稈還田措施均配合化肥的施用?；食私o植物的生長提供養(yǎng)分外，也為秸稈降解真菌提供了氮磷鉀等營養(yǎng)元素，對真菌的生長產(chǎn)生顯著影響。研究表明，當(dāng)以磷酸氫二銨和尿素作為氮源時(shí)，擬康寧木霉的產(chǎn)孢數(shù)量大于以硫酸銨和硝酸銨為氮源的情況，而菌絲長速則低于以硫酸銨和硝酸銨為氮源的情況[45]。磷酸氫二銨、硝酸銨對深色有隔內(nèi)生真菌沙門外瓶柄霉生物量的促進(jìn)要遠(yuǎn)高于尿素和硫酸銨；硝酸銨和硫酸銨對另一種深色有隔真菌甘瓶霉生物量的促進(jìn)作用是尿素和磷酸氫二銨的兩倍[46]。由此可見，即便是發(fā)揮同樣功能或親緣關(guān)系很近的真菌，其對不同氮源添加的響應(yīng)亦不同。然而，這些有機(jī)無機(jī)肥料的添加如何影響有益菌和病原菌之間的拮抗關(guān)系尚未得到研究。而這項(xiàng)研究在指導(dǎo)秸稈還田農(nóng)田施肥措施上具有重大的應(yīng)用價(jià)值。通過探索不同類型肥料對病原菌和有益菌之間的拮抗關(guān)系的影響，有益于因地制宜地解決好秸稈還田引起的河南省農(nóng)作物土傳病害頻發(fā)的問題，對于全面地研究河南省其他類型土壤適宜的施肥措施具有極強(qiáng)的參考價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義，以期付出最小的環(huán)境代價(jià)、人力物力成本來保證高效率的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。