荷斯坦奶牛miR-146a的組織表達分析及靶基因驗證

趙瑞鵬，李志雄

(1.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川 成都 610041； 2. 西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041； 3.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041)

奶牛乳腺炎為乳腺組織受到物理、化學和微生物等外界各種環(huán)境因素影響，引起乳腺實質(zhì)和間質(zhì)組織的炎癥，從而影響乳腺組織的泌乳功能，導致產(chǎn)奶量下降，造成巨大的經(jīng)濟損失.乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖中危害最大、經(jīng)濟損失最嚴重的一種疾病，是世界奶牛養(yǎng)殖業(yè)的一道難題.據(jù)統(tǒng)計，目前全世界2.2億頭奶牛中約有33.3%受到乳腺炎的影響，每年為此所遭受的損失高達350億美元[1-2].在我國，奶牛乳腺炎發(fā)病率普遍高于國外，每年因為乳腺炎的損失高達1.35億人民幣.雖然已采取很多相關(guān)的防治策略，卻并沒有收到預期的效果，因此，奶牛乳腺炎的防治對奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重要的意義.

miRNA是一類內(nèi)源性、長為18～25個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA[3].由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長約70～110個核苷酸的miRNA前體(pre-miRNA)剪切加工形成.在轉(zhuǎn)錄后水平能夠與靶基因的特定序列結(jié)合，從而發(fā)揮其對靶基因的調(diào)控作用[4].研究表明miRNA能夠參與生物體內(nèi)多種生物學過程，包括細胞的增殖與分化、肌肉與脂肪的發(fā)育及形成、新陳代謝、激素的分泌、免疫應答、疾病的發(fā)生和腫瘤的形成[5].

miR-146家族包含miR-146a和miR-146b兩條miRNA序列，其中miR-146a定位于人類第5號染色體LOC285628基因[6]，牛miR-146a則定位于第7號染色體[7].miR-146a序列在不同物種間高度保守，揭示其在免疫、炎癥和腫瘤的發(fā)生等生理、病理過程中可能發(fā)揮著重要的作用.在小鼠巨噬細胞受到水泡性口膜炎病毒感染后，miR-146a可與其靶基因腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TRAF6)、白細胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK1)以及白細胞介素-2受體相關(guān)激酶(IRAK2)結(jié)合，作為視黃酸誘導基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)依賴抗病毒通路的負調(diào)控因子[8].miR-146a在血液中的表達水平可以作為敗血癥[9]和白血病的生物學診斷標記[10].在乳腺癌細胞中，miR-146a/b被證實在叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子-3(FOXP3)調(diào)節(jié)的腫瘤抑制過程中可以引起細胞凋亡[11].miR-146a在患糖尿病大鼠海馬體內(nèi)表達量的下降，會導致NF-κB表達量的上升，從而引起炎癥的加劇和細胞凋亡[12].miR-146a在天然免疫中發(fā)揮著重要負反饋調(diào)節(jié)因子的作用，在免疫系統(tǒng)中具有重要的功能，推測miR-146a在奶牛乳腺炎的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用.然而，現(xiàn)在對于miR-146a在奶牛不同組織中的表達及其靶基因方面研究的缺失，嚴重影響了對于miR-146a功能的深入了解.

本研究以荷斯坦奶牛為研究對象，利用實時定量PCR(qPCR)技術(shù)檢測miR-146a在奶牛不同組織中的表達情況，利用靶基因預測軟件TargetScan和RNAhybrid共同預測其可能的靶基因，并利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)進一步驗證預測的靶基因，從而為進一步研究miR-146a在調(diào)控荷斯坦奶牛乳腺炎免疫過程中的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

于陜西省西安市草灘農(nóng)場選取健康(H)和患乳腺炎(M)的荷斯坦奶牛各5頭，屠宰于西安屠宰場.屠宰后，迅速采集心(heart)、肝(liver)、脾(spleen)、肺(lung)、腎(kidney)和乳腺組織(mammary gland, MG)樣品各2 g左右，用DEPC滅菌水清洗后，裝入無RNA酶的凍存管中并立即置于液氮中保存，用于組織總RNA的提取.

1.1.2 主要試劑

miRNA mimics和miRNA NC (Negative control) 交由上海生工合成，RNA提取試劑Trizol和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑均從Invitrogen公司購買，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser、QuantiFastTMSYBR Green PCR kit、pMD-19T Vector、XhoⅠ和NotⅠ購自大連TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、2× Taq PCR Master Mix、質(zhì)粒小提試劑盒和DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)從Promega公司購買，psiCHECK-2載體為本實驗室保存.苯酚、氯仿、酒精、異丙醇等試劑均為國產(chǎn)生化試劑.

1.2 方法

1.2.1 miR-146a靶基因的預測

利用TargetScan[13]和RNAhybrid[14]2個在線軟件，預測能夠被miR-146a序列靶向結(jié)合的基因及其結(jié)合位點，選取兩者預測結(jié)果的交集作為miR-146a潛在的靶基因.

1.2.2 引物設計與合成

根據(jù)前文靶基因預測的結(jié)果，將腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TRAF6)基因和Toll樣受體-4(TLR4)基因作為miR-146a潛在的靶基因.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的牛TRAF6基因(NM_001034661.2)和TLR4基因(NM_174198.6)的序列設計引物，擴增預測靶位點兩端的序列.miR-146a的表達水平檢測采用Chen等[15]提出的Stem-loop RT-PCR方法，采用18S rRNA作為實時定量PCR的內(nèi)參基因[16].引物具體情況見表1.

表1 PCR引物序列

1.2.3 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法提取組織總RNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性.采用NanoDrop ND-1000(Agilent)分光光度計測定RNA的濃度以及OD260nm/OD280nm值，以1.9～2.1之間為最佳.利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并保存在-20 ℃?zhèn)溆?

1.2.4 TRAF6-3′ UTR和TLR4-3′ UTR野生型和突變型載體構(gòu)建

利用預測獲得的miR-146a與靶基因的結(jié)合區(qū)域，設計包含miR-146a和TRAF6基因及TLR4基因結(jié)合區(qū)域的擴增引物TRAF6-3′ UTR和TLR4-3′ UTR.在引物中加入XhoⅠ和NotⅠ兩種限制性內(nèi)切酶的酶切位點及各自的保護堿基.以cDNA為模板，分別利用引物TRAF6-3′ UTR和TLR4-3′ UTR進行擴增.產(chǎn)物電泳后回收和純化目的條帶.利用XhoⅠ和NotⅠ對TRAF6-3′ UTR和TLR4-3′ UTR的PCR產(chǎn)物及psiCHECK-2載體分別進行雙酶切，然后測序鑒定.測序鑒定成功的重組質(zhì)粒命名為TRAF6-WT和TLR4-WT.將TRAF6-3′ UTR和TLR4-3′ UTR各自的擴增產(chǎn)物送由上海生工進行定點敲除，把預測的miR-146a的結(jié)合區(qū)域敲除掉，將敲除后片段連接到psiCHECK-2載體，測序鑒定成功的重組質(zhì)粒命名為TRAF6-Mut和TLR4-Mut.

1.2.5 HEK293T細胞培養(yǎng)

將HEK293T細胞培養(yǎng)在HEK293T細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2濃度和100%飽和濕度.當細胞融合度達到90%以上時準備傳代，首先吸掉培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，吸取適量的PBS將貼壁的細胞洗兩遍，加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶后放置培養(yǎng)箱20 s，然后加入1 mL含血清的培養(yǎng)液制成細胞懸液.最后，按照1∶3～1∶5的比例傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)細胞轉(zhuǎn)染實驗.HEK293T細胞培養(yǎng)液配方為基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清以及100 U/mL的青霉素和鏈霉素.

1.2.6 HEK293T細胞轉(zhuǎn)染

等到細胞長至70%～80%時利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染.實驗分為4組，共轉(zhuǎn)染miR-146a mimic + TRAF6-WT，miR-146a mimic + TRAF6-Mut及miR-146a mimic + TLR4-WT，miR-146a mimic + TLR4-Mut為過表達組，共轉(zhuǎn)染miR-146a mimic NC + TRAF6-WT，miR-146a mimic NC + TRAF6-Mut及miR-146a mimic NC + TLR4-WT，miR-146a mimic NC + TLR4-Mut為對照組.轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)細胞48 h，利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)試劑盒檢測雙熒光素酶活性.

1.2.7 實時定量PCR(qPCR)與組織表達檢測

根據(jù)Chen等[15]提出的Stem-loop RT-PCR方法，設計miR-146a反轉(zhuǎn)錄和實時定量特異性引物.利用CFX96實時定量PCR儀(Bio-Rad)測定miR-146a在各組織的表達水平.qPCR反應體系：上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，SYBR 10 μL，水7μL.實時定量程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，36個循環(huán).熔解曲線分析：95 ℃ 10 s，然后以0.5 ℃/5 s的速度從55 ℃升到95 ℃.健康和患乳腺炎奶牛各5個生物學重復，每個樣本設3個技術(shù)重復，并設置3個無cDNA模板的樣本作為陰性對照，利用18S rRNA作為實時定量PCR的內(nèi)參基因[16].

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法分析miR-146a的相對表達量.雙熒光素酶檢測結(jié)果用螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，即熒光值表示.利用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析比較統(tǒng)計兩組間的差異，所有試驗都進行三次生物學重復.

2 結(jié)果

2.1 miR-146a靶基因的預測

利用TargetScan和RNAhybrid 2個在線軟件對miR-146a的靶基因進行預測，并結(jié)合之前Small RNA測序中預測的miR-146a的靶基因，對三者預測出的靶基因取其交集.經(jīng)過初步分析，獲得兩個可信的靶基因及其相互作用靶序列，結(jié)果如圖1所示，miR-146a的種子區(qū)序列(2～8)堿基與TRAF6基因3′ UTR第57～63個堿基及176～183個堿基完全互補，miR-146a的種子區(qū)序列堿基與TLR4基因3′ UTR第592～599個堿基完全互補.這些結(jié)果在理論上說明miR-146a與TRAF6基因和TLR4基因具有靶標關(guān)系.

圖1 miR-146a與靶基因TRAG6 (A)和TLR4 (B)結(jié)合位點的預測

2.2 miR-146a在奶牛各組織中表達分析

qPCR結(jié)果顯示，miR-146a表達水平在健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛乳腺組織中具有顯著差異(圖2A,P< 0.001).在健康荷斯坦奶牛中，miR-146a在乳腺組織中具有最高的表達水平，且顯著高于肺和腎兩個組織(圖2B,P< 0.01).

圖2 荷斯坦奶牛miR-146a的組織表達分析

2.3 miR-146a與TRAF6 mRNA靶標關(guān)系的驗證

共轉(zhuǎn)染miR-146a mimic和TRAF6-WT及miR-146a mimic和TRAF6-Mut后，過表達組中，共轉(zhuǎn)染miR-146a mimic和TRAF6-WT組的熒光活性(0.66 ± 0.05)極顯著(P< 0.001)低于陰性對照組(1.00 ± 0.06)，而共轉(zhuǎn)染miR-146a mimic和TRAF6-Mut組的熒光活性(0.86 ± 0.01)則與陰性對照組(1.00 ± 0.04)無顯著差異(圖3A).由此說明，miR-146a與TRAF6基因3′ UTR靶位點的結(jié)合抑制了熒光信號的產(chǎn)生，二者存在靶標關(guān)系.

2.4 miR-146a與TLR4 mRNA靶標關(guān)系的驗證

共轉(zhuǎn)染miR-146a mimic和TLR4-WT及miR-146a mimic和TLR4-Mut后，過表達組中，共轉(zhuǎn)染miR-146a mimic和TLR4-WT組的熒光活性(0.34 ± 0.02)極顯著(P< 0.01)低于陰性對照組(1.00 ± 0.02)，而共轉(zhuǎn)染miR-146a mimic和TLR4-Mut組的熒光活性(0.96 ± 0.07)則與陰性對照組(1.00 ± 0.04)無顯著差異(圖3B).由此說明，miR-146a與TLR4基因3′ UTR靶位點的結(jié)合抑制了熒光信號的產(chǎn)生，二者存在靶標關(guān)系.

圖3 TRAF6-3′ UTR和TLR4-3′ UTR重組雙熒光質(zhì)粒的相對熒光素酶活性 (A) TLR4-WT+NC, TLR4-Mut+NC：陰性對照組；TLR4-WT+miR-146a, TLR4-Mut+miR-146a：過表達組 (B) TRAF6-WT+NC, TRAF6-Mut+NC：陰性對照組；TRAF6-WT+miR-146a, TRAF6-Mut+miR-146a：過表達組； **：P< 0.01；***：P< 0.001

3 討論

miRNA靶基因的預測主要根據(jù)miRNA與其靶基因相互作用的規(guī)律.TargetScan和RNAhybrid基于不同的預測原理進行miRNA靶基因的預測[13-14]，在本研究中，TargetScan和RNAhybrid 2個在線軟件被用來預測miR-146a的靶基因.本研究結(jié)合趙艷艷和師濤等人所采用的預測miRNA靶基因的多個在線軟件[17-18]，最終篩選TargetScan和RNAhybrid 2個在線軟件，并結(jié)合之前Small RNA測序中預測的miR-146a的靶基因，選取三者交集.經(jīng)過分析，最終確定TRAF6基因和TLR4基因為miR-146a潛在的靶基因，用于后續(xù)利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)對二者與miR-146a靶標關(guān)系的驗證.

目前常用的用于識別合成miRNA第一鏈的方法主要有頸環(huán)法(Stem-loop RT-PCR)和加尾法兩種.加尾法可以檢測到成熟的miRNA序列及miRNA前體，但特異性較低，無法識別只有一個堿基差別的miRNA序列.頸環(huán)法是利用具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)(Stem-loop)的引物進行miRNA的反轉(zhuǎn)錄，然后再進行qPCR，特異性強，靈敏度高，樣品消耗量少.每一條miRNA都可以針對自身序列設計特異性的具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，可以精確識別到只有一個堿基只差的miRNA序列，能夠區(qū)分miRNA家族的不同變體[15,19].基于頸環(huán)法的以上優(yōu)點，本研究采用了頸環(huán)法檢測miR-146a在荷斯坦奶牛不同組織中的表達水平.

與作者之前Small RNA測序的結(jié)果一致[7]，miR-146a在健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛乳腺組織中表達差異顯著，并且miR-146a在患乳腺炎荷斯坦奶牛乳腺組織中的表達水平要遠遠超過其在健康奶牛乳腺組織中的表達水平.在健康荷斯坦奶牛中，miR-146a在乳腺組織中仍具有最高的表達水平，且顯著高于肺和腎兩個組織.推測miR-146a在患乳腺炎荷斯坦奶牛乳腺組織免疫調(diào)控的過程中發(fā)揮著重要作用，具體調(diào)控機制還需要進一步確認.

本研究預測得到miR-146a的兩個潛在靶基因TRAF6和TLR4及其結(jié)合位點，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)證明了miR-146a可與TRAF6和TLR4基因3′ UTR靶向結(jié)合，從而下調(diào)二者的表達.腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAFs)包括7個密切相關(guān)的蛋白，是腫瘤壞死因子(TNF)和Toll樣/白細胞介素-1受體(Toll/IL-1 receptor, TIR)超家族重要的接頭分子，作為細胞內(nèi)信號傳導通路上的關(guān)鍵接頭分子，TRAFs在天然免疫與獲得性免疫中具有重要作用.TRAF6是TRAFs家族中唯一可以直接和白細胞介素受體相關(guān)激酶(IRAK)、NF-κB受體激活因子(RANK)及CD40直接結(jié)合的信號分子，具有獨特的受體結(jié)合特異性[20].Toll樣受體(TLRs)是一組與天然免疫密切相關(guān)的受體家族，TLRs通過識別不同病原體的病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，激活先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生促炎性因子、抗微生物肽抵御病原體所致的損害和引發(fā)的信號傳導并導致炎癥介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中具有重要作用，同時TLRs也是天然免疫和獲得性免疫之間的橋梁.TLR4是TLRs家族中發(fā)現(xiàn)最早、研究最廣的受體之一，以PAMP的方式識別配體.TLR4通過識別病原體和內(nèi)源性配體可引發(fā)促炎性固有免疫反應，但TLR4的表達異常也會導致多種疾病的發(fā)生[21].在人和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-146a可以靶向結(jié)合IRAK1和TRAF6基因，從而以負反饋的方式調(diào)控TLR信號通路和NF-κB信號通路應答外來感染，促進細胞凋亡，降低細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力[22-23].本研究通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)證明了TRAF6和TLR4基因均為miR-146a的靶基因，進一步證實miR-146a在患乳腺炎荷斯坦奶牛乳腺組織免疫調(diào)控的過程中發(fā)揮著重要作用.

4 結(jié)論

本研究通過Stem-loop RT-PCR方法分析了miR-146a在荷斯坦奶牛各組織中的表達情況，結(jié)果顯示，miR-146a在健康和患乳腺炎荷斯坦奶牛乳腺組織中表達差異顯著.通過預測軟件發(fā)現(xiàn)，miR-146a可靶向作用于TRAF6和TLR4基因，雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)實驗證實miR-146a可靶向結(jié)合TRAF6和TLR4基因3′UTR特定序列，并下調(diào)TRAF6和TLR4基因的表達.推測miR-146a在荷斯坦奶牛乳腺炎的發(fā)生和發(fā)展過程中可能具有重要的作用，本研究結(jié)果為進一步研究miR-146a在荷斯坦奶牛乳腺炎免疫過程中的作用奠定了基礎(chǔ).