雞傳染性鼻炎三價(jià)滅活疫苗油乳佐劑的篩選及免疫效果評(píng)價(jià)

黃 堅(jiān)，李成燚，劉 杰，杜德燕，李 妍

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,四川 成都 610041； 2.華派生物工程集團(tuán)有限公司,四川 成都 641423)

雞傳染性鼻炎(Infectious coryza，IC)是由副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum, Apg)引起的一種急性或亞急性上呼吸道傳染病，主要導(dǎo)致蛋雞的產(chǎn)蛋性能下降(10%～40%)以及育成雞和肉雞的生長發(fā)育停滯[1].該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，而疫苗免疫依然是目前最有效的防治措施[2].根據(jù)Page分型法可將Apg分為A、B和C三個(gè)血清型[3-4]，不同的血清型菌株都有在國內(nèi)雞群中出現(xiàn)流行，但優(yōu)勢(shì)流行菌株多有變化，其中以B型菌株的流行較為廣泛，且免疫保護(hù)具有型特異性[5-6].由于三個(gè)血清型之間缺少交叉抗體保護(hù)，因此制備針對(duì)流行菌株的IC三價(jià)(A型+B型+C型)滅活疫苗有著重要的臨床意義.目前，禽類滅活疫苗制備所用佐劑主要為油乳佐劑或鋁膠佐劑，早期研究顯示雞傳染性鼻炎滅活疫苗使用油乳佐劑可提供的較長的免疫保護(hù)期及較高的免疫保護(hù)水平[7-9]，且免疫效果也優(yōu)于鋁膠佐劑疫苗[10-11]，因此在生產(chǎn)上更受青睞.

目前禽類滅活疫苗多使用油乳佐劑，常制備成油包水(W/O)劑型，使得疫苗抗原在注射部位形成有效的抗原庫，產(chǎn)生持續(xù)的免疫刺激作用.但油乳佐劑可能會(huì)引起一定的不良反應(yīng)如注射部位的炎癥、降解吸收問題等，這與佐劑的成分、質(zhì)量和穩(wěn)定性有關(guān)[12-13].因此，為了保證雞傳染性鼻炎(A型+B型+C型)三價(jià)滅活疫苗的安全性和免疫效力，利于臨床推廣使用，篩選出最適的油乳佐劑尤為重要.本研究將對(duì)比三種不同品牌的礦物油佐劑制備的IC三價(jià)滅活疫苗的物理性狀、安全性及免疫效力差異，確定最佳的油乳佐劑.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

A型副雞禽桿菌C-Apg-8株和C型副雞禽桿菌Apg-668株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，B型副雞禽桿菌Apg-BJ05(北京分離株)株購自北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，均由華派生物工程集團(tuán)有限公司保存.B型XN株(四川眉山分離株)和HN株(江蘇安徽分離株)為2019年分離的國內(nèi)流行菌株，由華派生物工程集團(tuán)有限公司分離鑒定和保存.

1.1.2 培養(yǎng)基和佐劑

雞血清雞肉湯、雞血清雞肉湯瓊脂、半合成培養(yǎng)基等按照文獻(xiàn)配方進(jìn)行制備[7,14]，并添加適量的輔酶Ⅰ(NADH).3種礦物油佐劑分別購自法國道達(dá)爾公司(Eolane130)、美國?？松梨诠?Marcol-52)和法國賽比克公司(ISA 71VG).

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80只20日齡和220只6周齡SPF雞購自濟(jì)南斯派福瑞禽業(yè)科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

將上述3種菌株分別接種雞血清雞肉湯瓊脂平皿，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)16～18h.挑取典型菌落分別接種半合成培養(yǎng)基，于37 ℃再培養(yǎng)16～24 h，完成一級(jí)種子培養(yǎng)，純粹檢驗(yàn)合格后保存于-80 ℃?zhèn)溆?將3個(gè)血清型的一級(jí)種子，按照3%比例分別接種半合成培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)16～24 h，然后進(jìn)行純粹檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù).將純檢合格的三個(gè)血清型菌液，根據(jù)活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，經(jīng)中空纖維超濾器濃縮至制備疫苗所需濃度.再按濃縮菌液體積的0.15%終濃度加入甲醛溶液，于2～8 ℃滅活7 d，期間每日攪拌1～2次.滅活完成后進(jìn)行滅活檢驗(yàn).

1.2.2 疫苗配制

將滅活檢驗(yàn)合格的副雞禽桿菌抗原(含3個(gè)血清型)與三種不同礦物油佐劑(命名為佐劑1、佐劑2和佐劑3)按其推薦的乳化方式制備疫苗，分別制備了SY2019001、SY2019002、SY2019003三批雞傳染性鼻炎(A型+B型+C型)三價(jià)滅活疫苗.

1.2.3 疫苗的性狀檢驗(yàn)

1.2.3.1 外觀

應(yīng)為乳白色乳劑.

1.2.3.2 劑型

應(yīng)為油包水型.取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散.

1.2.3.3 穩(wěn)定性

吸取疫苗10 mL加入離心管中，以3 000 r/min離心15 min，管底析出的水相應(yīng)不多于0.5 mL.

1.2.3.4 黏度

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定.

1.2.4 無菌檢驗(yàn)

按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行測定，應(yīng)無菌生長.

1.2.5 不同佐劑疫苗的安全性試驗(yàn)

80只20日齡SPF雞隨機(jī)分成4組，每組20只，飼養(yǎng)于相同條件的隔離器，1～3組為免疫組，分別胸部肌肉注射兩倍劑量的SY2019001、SY2019002、SY2019003試驗(yàn)疫苗(1.0 mL/只)，第4組為對(duì)照組，胸部肌肉注射生理鹽水(1.0 mL/只)，觀察接種雞的精神、飲水和采食等狀態(tài).免疫后第14天，每組解剖10只SPF雞，觀察注射部位的疫苗吸收情況，其余雞只繼續(xù)飼養(yǎng)至第28天，剖檢并觀察注射部位的疫苗吸收情況.

1.2.6 不同佐劑疫苗的免疫效力試驗(yàn)

120只6周齡SPF雞隨機(jī)分為4組，每組30只，飼養(yǎng)于相同條件的隔離器，1～3組為免疫組，分別胸部肌肉注射SY2019001、SY2019002、SY2019003試驗(yàn)疫苗(0.5 mL/只)，第4組為非免疫對(duì)照組，免疫后第30天，各組隨機(jī)選取10只SPF雞分別用A、B、C型副雞禽桿菌攻毒，攻毒方式為眶下竇內(nèi)注射，攻毒劑量分別為A型C-Apg8株 5.0×105CFU/0.2 mL、B型Apg-BJ05株 2.0×105CFU/0.2 mL、C型Apg-668株 5.0×105CFU/0.2 mL.攻毒后連續(xù)觀察7天，記錄發(fā)病情況，計(jì)算攻毒保護(hù)率.

以篩選的最佳佐劑生產(chǎn)制備雞傳染性鼻炎(A型+B型+C型)三價(jià)滅活疫苗，將其免疫50只6周齡SPF雞(0.5 mL/只)，每組10只，飼養(yǎng)于相同條件的隔離器，另設(shè)50只SPF雞為非免疫對(duì)照.免疫后第30天，同時(shí)以1株A型、3株B型及1株C型副雞禽桿菌分別攻毒免疫組及對(duì)照組.攻毒方式為眶下竇內(nèi)注射，攻毒劑量分別為A型C-Apg8株 5.0×105CFU/0.2 mL、B型Apg-BJ05株 2.0×105CFU/0.2 mL、XN株2.0×102CFU/0.2 mL、HN株6.0×102CFU/0.2 mL、C型Apg-668株 5.0×105CFU/0.2 mL.攻毒后連續(xù)觀察7天，記錄發(fā)病情況，計(jì)算攻毒保護(hù)率.

2 結(jié)果

2.1 不同佐劑制備疫苗的性狀檢驗(yàn)及無菌檢驗(yàn)

佐劑1、佐劑2、佐劑3分別制備的三種疫苗經(jīng)外觀、劑型、穩(wěn)定性、黏度檢驗(yàn)及無菌檢驗(yàn)，結(jié)果見表1.三種佐劑均能制備成穩(wěn)定的油包水劑型，黏度均不大于200 Pa.s，但佐劑3制備疫苗的黏度顯著低于佐劑1和佐劑2制備的疫苗.

表1 疫苗的性狀及無菌檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 不同佐劑疫苗的安全性

結(jié)果顯示，安全試驗(yàn)期間，3種佐劑制備的疫苗免疫的SPF雞均健康存活，精神、飲水和采食等良好，無接種疫苗引起的應(yīng)激反應(yīng).但不同佐劑免疫組注射部位的疫苗吸收情況差異顯著.其中，佐劑1制備的SY2019001免疫組免疫后第14天及第28天，注射部位的疫苗吸收效果均弱于另外兩種佐劑免疫組(見表2及圖1)，注射部位有無法吸收的白色液體或黃色顆粒.佐劑2和佐劑3免疫組在免疫后第14天均有大部分剖檢的SPF雞的注射部位存在黃色顆粒，但第28天剖檢結(jié)果顯示注射部位的疫苗均已吸收完全，并且佐劑3制備的SY2019003免疫組注射部位的肌肉色澤更接近于對(duì)照組.安全性試驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然3種佐劑制備的疫苗免疫后均無應(yīng)激反應(yīng)，但佐劑3在注射部位的吸收效果優(yōu)于佐劑1和佐劑2，其更適用于雞傳染性鼻炎三價(jià)滅活疫苗.

表2 不同佐劑疫苗的安全性試驗(yàn)結(jié)果

圖1 不同佐劑疫苗免疫組注射部位的疫苗吸收情況

2.3 不同佐劑疫苗的免疫效力

攻毒后的第2天，A型和C型菌株攻毒的對(duì)照組雞只均90%(9/10)發(fā)病，B型菌株攻毒的對(duì)照組雞只100%(10/10)發(fā)病，表現(xiàn)為眶下竇腫脹明顯，流鼻液等典型的雞傳染性鼻炎臨床癥狀.A型和B型菌株攻毒對(duì)照組有部分雞呈一過性失明.攻毒后7天的保護(hù)率結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表3.佐劑1制備的SY2019001免疫組對(duì)三個(gè)不同血清型菌株的攻毒保護(hù)率為70%～80%，低于其它兩種佐劑制備的疫苗免疫組(攻毒保護(hù)率為90%～100%)，即佐劑2、佐劑3制備的疫苗(SY2019002、SY2019003)能對(duì)三個(gè)血清型副雞禽桿菌的攻擊提供不低于90%的保護(hù).因此，從免疫效力方面考慮佐劑2和佐劑3均適宜用于制備雞傳染性鼻炎三價(jià)滅活疫苗.

表3 不同佐劑疫苗的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

從以上試驗(yàn)結(jié)果可見佐劑3為最適佐劑.使用佐劑3生產(chǎn)制備的雞傳染性鼻炎(A型+B型+C型)三價(jià)滅活疫苗(批號(hào)2019003批)免疫SPF雞，對(duì)三個(gè)不同血清型的五株副雞禽桿菌的攻毒保護(hù)率為90%～100%，既能有效抵抗A型C-Apg8株、B型Apg-BJ05株及C型Apg-668株的攻擊，也能對(duì)近期國內(nèi)B型流行菌株(HN株及XN株)提供較好的免疫保護(hù)(見表4).

表4 佐劑3制備疫苗的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果

綜上結(jié)果可知，佐劑3制備的疫苗黏度低，安全性良好，吸收效果好，且能為免疫雞群提供不低于90%的免疫保護(hù)力，較其它兩個(gè)佐劑更合適用于制備雞傳染性鼻炎(A型+B型+C型)三價(jià)滅活疫苗.

3 討論

油乳佐劑通過增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答及抗原的免疫原性來提升疫苗的性能，其含有的油劑和乳化劑類型及穩(wěn)定性影響著油乳佐劑的活性.商品化油乳佐劑的成分差別和親水親油的平衡值決定了乳化后疫苗的黏度和穩(wěn)定性，這也直接影響了疫苗的安全性和有效性[12].乳化后的疫苗黏度過高不利于使用時(shí)疫苗的抽吸，并可導(dǎo)致其在注射部位不易被吸收，殘留量高，影響其安全性.三種佐劑制備的疫苗均為較穩(wěn)定的油包水劑型，黏度低于200 Pa.s，其中佐劑3制備的疫苗黏度(29.3 Pa.s)顯著低于其它兩種佐劑疫苗.此外，佐劑3制備的疫苗注射部位的組織吸收效果優(yōu)于佐劑1和佐劑2組，因此為更適合的候選佐劑.礦物油佐劑疫苗的安全性及效力高低，與乳化工藝、乳劑成分的內(nèi)在質(zhì)量密切相關(guān)[12-13]，從而導(dǎo)致注射部位的抗原吸收和體內(nèi)釋放產(chǎn)生差異.佐劑3以特定的濃縮輕質(zhì)礦物油為油相，包含甘露醇和油酸高度精煉的非離子型表面活性劑，可能比佐劑1和佐劑2(以長鏈礦物油為油相)的吸收代謝性要好.因此，其副反應(yīng)更小，安全性也更高.

鑒于副雞禽桿菌的特性及雞的個(gè)體差異，攻毒保護(hù)組并未實(shí)現(xiàn)100%保護(hù)，這可能與不同疫苗候選株的生物學(xué)特性以及所選佐劑的活性有關(guān)[15-16].本研究中佐劑2和佐劑3組對(duì)三個(gè)血清型菌株的攻毒保護(hù)率(不低于90%)高于佐劑1組(70%～80%)，這與疫苗在注射部位的吸收情況相關(guān).三個(gè)血清型Apg之間無交叉保護(hù)，而同一血清型不同菌株間存在部分交叉保護(hù)[17].已有研究表明血凝素(HA)與副雞禽桿菌的致病性及免疫原性密切相關(guān)[18].本研究所用的B型北京株(BJ-05)制備的疫苗可以對(duì)四川眉山(XN株)和江蘇安徽(HN株)B型分離株形成良好的交叉保護(hù)，推測可能與菌株間保護(hù)性抗原同源性高有關(guān).而根據(jù)盧冷軼等人的研究報(bào)道，B型天津分離株(TJ-1)制備的油佐劑疫苗對(duì)大連DL-1(91.7%)和北京BJ-1(63.6%)株的攻毒保護(hù)率存在明顯差異[19].Yang Xu等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，北京BJ-26株制備的疫苗對(duì)湖南(HuN22)和北京(BJ-26)株的攻毒保護(hù)率要高于現(xiàn)有商品化疫苗的保護(hù)率[15]，表明不同地區(qū)分離株制備疫苗的免疫保護(hù)仍存在差異.因此在后續(xù)研究中我們需要持續(xù)驗(yàn)證疫苗對(duì)不同地區(qū)分離株的攻毒保護(hù)效果，以對(duì)疫苗未來的臨床使用給予數(shù)據(jù)支持.

4 結(jié)論

經(jīng)試驗(yàn)對(duì)比表明，三種不同廠家的佐劑中，佐劑3為制備雞傳染性鼻炎(A型+B型+C型)三價(jià)滅活疫苗的最適佐劑，其制備的疫苗具有較好的安全性及免疫效力.