植物精油與環(huán)糊精包合物的制備及對柑橘綠霉病的抑制作用

譚元珍，張永華，朱向榮，蘇東林，李高陽，陶能國

植物精油與環(huán)糊精包合物的制備及對柑橘綠霉病的抑制作用

譚元珍1，張永華1，朱向榮2，蘇東林2，李高陽2，陶能國1※

（1. 湘潭大學(xué)化工學(xué)院生物與食品工程系，湘潭 411105；2. 湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，長沙 410125）

植物精油及其活性組分能降低柑橘采后病害且不影響果實品質(zhì)，是一種潛在的生物殺菌劑，但存在易揮發(fā)和不穩(wěn)定等問題，限制了其實際應(yīng)用。將植物精油與環(huán)糊精包合能有效克服上述缺陷，提高植物精油的應(yīng)用效果。為了提升植物精油組分反式-2-己烯醛對柑橘綠霉病菌的控制效果，該研究擬采用飽和水溶液法制備反式-2-己烯醛與-環(huán)糊精（-CD）、-環(huán)糊精（-CD）、-環(huán)糊精（-CD）和羥丙基--環(huán)糊精（HP--CD）包合物，并考察包合物對指狀青霉的離體和活體控制效果，在此基礎(chǔ)上解析效果較優(yōu)包合物的結(jié)構(gòu)特點和包合模式。結(jié)果顯示，通過飽和水溶液法成功制備了反式-2-己烯醛與-CD、-CD、-CD和HP--CD的4種包合物（-CDTH、-CDTH、-CDTH和HP--CDTH）。外觀形態(tài)結(jié)果顯示，-CDTH、-CDTH和-CDTH粉末細膩綿密，HP--CDTH粉末粗糙，顆粒分明。4種環(huán)糊精包合物均能有效抑制菌絲體的生長且具有濃度依賴性，-CDTH和-CDTH抑制菌絲體生長的最小殺菌濃度（Minimum Fugicide Concentration，MFC）為1.00 mg/mL。包合率結(jié)果顯示，-CDTH包合率最高，為75.36%。相溶解度結(jié)果表明，4種環(huán)糊精包合物的溶解性大小依次為HP--CD、-CD、-CD、-CD。綜合離體抑菌效果、包合率和溶解性可知，-CDTH綜合表現(xiàn)最佳。活體接種試驗結(jié)果表明，不同濃度-CDTH處理能不同程度降低柑橘果實綠霉病發(fā)病率（0.05），以8.00 mg/mL-CDTH處理效果最佳。此外，-CDTH處理能有效維持柑橘果實硬度，且對柑橘果實失重率、色澤、維生素C含量、可溶性固形物無不良影響。微觀結(jié)構(gòu)觀察表明，-CDTH與-CD、-CD與反式-2-己烯醛物理混合物的形狀和大小有明顯差異，表現(xiàn)在-CD形態(tài)大小不一，大部分呈無規(guī)則晶體，而物理混合物表面粗糙，-CDTH表面光滑，有類似片狀的形態(tài)；-CD的H-3′和H-5′與反式-2-己烯醛的H-6之間的氫鍵相互作用是-CDTH的形成基礎(chǔ)。研究結(jié)果可為-CDTH用于降低柑橘采后病害提供直接的依據(jù)，也為植物源天然防腐劑開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

農(nóng)產(chǎn)品；采后病害；-環(huán)糊精；反式-2-己烯醛；包合物；抑菌活性

0 引 言

柑橘因其口感好、營養(yǎng)價值高，廣受消費者歡迎，在全球100多個國家和地區(qū)均有種植[1]。柑橘果實貯藏運輸過程中，極易遭受多種致病真菌侵染，以指狀青霉（侵染引起的綠霉病危害最嚴重[2]。實際生產(chǎn)中，化學(xué)殺菌劑常被用來控制綠霉病等柑橘貯藏期病害，但化學(xué)殺菌劑會產(chǎn)生耐藥性菌株、造成食品安全和環(huán)境安全等問題，因而尋找安全高效、低毒低殘留的綠色防腐保鮮劑已成為一種新的發(fā)展趨勢[3-6]。

反式-2-己烯醛是由不飽和脂肪酸經(jīng)脂肪酸氧化酶和脂氫過氧化物裂解酶途徑催化形成的一種C6醛，存在于多種植物精油中，常被用作香精香料的食品添加劑，同時該物質(zhì)也具有顯著抑菌特性[7]。段騰飛等[8]研究發(fā)現(xiàn)，用量為100L/L反式-2-己烯醛對獼猴桃擴展青霉生長及展青霉素生成具有較好的抑制，極顯著降低了獼猴桃的發(fā)病率，同時不影響獼猴桃果實品質(zhì)。楊艷琴[9]發(fā)現(xiàn)反式-2-己烯醛對柑橘酸腐病菌菌絲體生長表現(xiàn)出較強的抑制作用，可降低柑橘果實酸腐病的發(fā)病率、減緩發(fā)病程度。需要指出的是，由于植物精油極易揮發(fā)、難溶于水和容易氧化等特點，阻礙了其在果蔬貯藏保鮮方面中的應(yīng)用[10-12]。

環(huán)糊精（Cyclodextrin，CD）也稱作環(huán)聚葡萄糖，為中空圓筒形結(jié)構(gòu)，其外側(cè)通過C2、C3形成仲羥基及C6形成伯羥基而具備高親水性，而內(nèi)層空腔因受到C-H鍵屏蔽作用同時具有疏水性[13]。因此，環(huán)糊精可以包合難溶于水的物質(zhì)，顯著提高水溶性。常見的環(huán)糊精種類包括-環(huán)糊精（-CD）、-環(huán)糊精（-CD）、-環(huán)糊精（-CD）和羥丙基--環(huán)糊精（HP--CD），其中、、-CD分別是由6、7、8個D(+)-吡喃型葡萄糖組成的環(huán)狀低聚物，而羥丙基--環(huán)糊精（HP--CD）是-CD分子上的2位或6位羥基上引入了羥丙基[14]。Yue等[15]成功將茶樹油封裝在環(huán)糊精微膠囊中以延緩其揮發(fā)，140 g/L TTO--CD 包合物完全抑制灰霉病菌的生長，5 g/LTTO--CD 包合物可有效抑制櫻桃番茄灰霉病的發(fā)生。Dong等[16]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)3 d時-環(huán)糊精反式-2-己烯醛包合物（-CTHM）對鏈格孢菌菌絲體生長抑制率為67.36%±2.45%，且保持了果實的硬度和可滴定酸含量。Dou等[17]研究發(fā)現(xiàn)，4.00和8.00 g/L-環(huán)糊精百里香酚包合物能顯著抑制柑橘果實酸腐病發(fā)生，處理8 d后接種酸腐病菌柑橘果實發(fā)病率分別為60%和47%，果實品質(zhì)基本不受影響。這些結(jié)果均表明環(huán)糊精與植物精油形成包合物后，不僅可以延緩植物精油釋放速度，還可以對果蔬進行防腐保鮮。盡管反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物的抑菌性能已有相關(guān)報道，但其對柑橘采后綠霉病的控制效果還不明確，且目前制備的植物精油包合物主要集中于-環(huán)糊精類型，對其他類型環(huán)糊精包合物的報道較少，需要進一步探討。

本文擬采用飽和水溶液法制備反式-2-己烯醛與環(huán)糊精包合物，并探討反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物對柑橘綠霉病的抑菌性能，在此基礎(chǔ)上確定包合作用方式，為尋找和開發(fā)植物源天然防腐劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指狀青霉（）菌株，分離于湘潭大學(xué)附近果園中自然發(fā)病的柑橘果實。

柑橘品種為椪柑（Blanco cv. Ponkan），2021年11月30日采摘于湘西，24 h內(nèi)運至實驗室，放置1 d釋放呼吸熱。挑選大小均一，成熟度一致且無病斑的果實備用。反式-2-己烯醛（純度98%）、-環(huán)糊精（-CD）、-環(huán)糊精（-CD）、-環(huán)糊精（-CD）、羥丙基--環(huán)糊精（HP--CD）等試劑均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機（丹麥Labo Gene公司，Cool Safe 110-4L）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義中天儀器科技有限公司，DF-101Z）；生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司，SPX-250B）；垂直流潔凈工作臺（蘇州安瑞凈化科技有限公司，SCW-CJ-1F）；紫外分光光度計（SHIMADZU公司，UV-2450）；掃描電鏡（日本SANYO電子有限公司，JSM-6610LV）；核磁共振譜儀（瑞士布魯克公司，AV400）。

1.3 試驗方法

1.3.1 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物的制備

采用飽和水溶液法[18]進行制備，稱取10 g的環(huán)糊精溶于100 mL的蒸餾水中，用磁力攪拌器加熱攪拌（45 ℃）使其完全溶解后，緩慢加入2 mL的反式-2-己烯醛無水乙醇溶液（1∶4，體積比）至環(huán)糊精溶液中，恒溫攪拌3 h在4 ℃放置24 h，抽濾，真空冷凍干燥24 h，研磨后得到固體粉末包合物。

1.3.2 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物包合率的測定

1）反式-2-己烯醛標準曲線的制作

取適量反式-2-己烯醛溶于無水乙醇溶液中，用紫外分光光度計在200～400 nm進行掃描，測定其最大吸收波長。精確配制反式-2-己烯醛系列的標準溶液，并在最大吸收波長（318 nm）處以體積濃度（L/mL）對吸光度進行線性回歸，得到回歸方程=0.484+0.031（2=0.999）。

2）包合率的測定

取包合物樣品0.1 g，置于10 mL的離心管中，加入10 mL無水乙醇，超聲振蕩30 min，靜置過夜，在4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL用無水乙醇定容至25 mL，在318 nm處測定吸光度值，根據(jù)式(1)計算包合物中包合率（%）[17]。

式中表示包合物中含反式-2-己烯醛的含量，L；為反式-2-己烯醛投入量，L。

1.3.3 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物相溶解度測定

包合物相溶解度的測定參照王娜等[19]方法進行。稱取適量-CD、-CD、-CD和HP--CD，配制成終濃度分別為0，5，10，15，20和25 mmol/L的環(huán)糊精溶液。取上述溶液各10 mL，分別加入0.1 mL反式-2-己烯醛，超聲30 min后放置一周，待到固液平衡后取上清液，0.45m微孔濾膜過濾。取適量濾液，用水稀釋通過紫外分光光度計測定濾液中反式-2-己烯醛的含量，然后以各環(huán)糊精的濃度為橫坐標，反式-2-己烯醛的溶解度為縱坐標，繪制反式-2-己烯醛的相溶解度曲線并根據(jù)式（2）計算包合平衡常數(shù)（K）[20]。

式中0表示在25 ℃的條件下不添加環(huán)糊精的反式-2-己烯醛的溶解度；Slope為相溶解度曲線的斜率。

1.3.4 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物對綠霉病菌抑菌性的測定

采用瓊脂稀釋法[21]測定-CDTH、-CDTH、-CDTH和HP--CDTH對指狀青霉菌絲體生長的影響。加入包合物配制成終濃度分別為0、0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mg/mL（根據(jù)包合物抑菌效果差異進行濃度調(diào)整）的培養(yǎng)基?；靹蚝?，倒入直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中心倒貼上一個直徑6 mm的菌餅，置于恒溫培養(yǎng)箱中（25±2）℃下培養(yǎng)5 d，每個濃度重復(fù)3次，用十字交叉法測定菌苔直徑。最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）為培養(yǎng)48 h時完全沒有生長的最低濃度，最小殺菌濃度（Minimum Fugicide Concentration，MFC）為生長96 h時完全沒有生長的最低濃度。

1.3.5-CDTH對接種綠霉病菌椪柑果實腐爛率的影響

參照文獻[22]進行，將-CDTH溶于蒸餾水，終濃度為0，4×MFC（4.00 mg/mL）和8×MFC（8.00 mg/mL）。將椪柑果實用蒸餾水洗凈后，用2%的NaClO溶液浸泡2 min，最后再用蒸餾水洗凈后自然晾干，用無菌手術(shù)刀在果實赤道處等距離劃2個3 mm×3 mm的“十”字傷口，每個傷口接種濃度1×105CFU/mL指狀青霉孢子菌懸液，接種后靜置4 h，將椪柑果實浸泡在相應(yīng)濃度的浸泡液中30 s，對照組為清水浸泡組。椪柑果實放置在環(huán)境溫度為（25±2）℃，相對濕度為85%～90%的環(huán)境下貯藏，每組10個果實，重復(fù)3次，每天測定椪柑腐爛率。定期取樣，測定分析失水率和硬度、色澤、維生素C（Vitamin C，Vc）含量、可溶性固形物等品質(zhì)指標。

1.3.6-CDTH結(jié)構(gòu)表征

1）掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscopy, SEM）分析

將-CD、環(huán)糊精與反式-2-己烯醛的物理混合物和-CDTH置于導(dǎo)電膠上，噴金后，放入掃描電子顯微鏡內(nèi)，在1 000×放大倍數(shù)下觀察樣品的形貌[23]。通過比較-CD、環(huán)糊精與反式-2-己烯醛物理混合物和-CDTH的微觀形貌之間的差異來判斷包合物的結(jié)構(gòu)特點。

2）核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）分析

準確稱取樣品約0.02 g置于離心管中，加入適量的D2O溶液中，超聲10 min后完全溶解，轉(zhuǎn)至核磁管中靜置待測[24]，采用AV400核磁共振光譜儀測定。溶劑D2O的參考化學(xué)位移值為4.7 ppm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Excel計算試驗3組平行數(shù)據(jù)的平均值和標準偏差，采用 SPSS 16.0 軟件的單因素方差（One-way ANOVA）分析顯著性差異（<0.05），并用Origin 8.0 軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物外觀形態(tài)

包合物外觀形態(tài)如圖1所示，反式-2-己烯醛客體分子與主體分子（-CD、-CD、-CD、HP--CD）制成包合物。其中，-CDTH、-CDTH和-CDTH粉末細膩綿密，HP--CDTH粉末粗糙，顆粒分明。

圖1 α-CDTH, β-CDTH,γ-CDTH和HP-β-CDTH的外觀形態(tài)圖

2.2 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物包合率的測定

包合率測定結(jié)果如表1所示，4種反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物的包合率大小依次為-CDTH、-CDTH、-CDTH、HP--CDTH，其中-CDTH、-CDTH、-CDTH和HP--CDTH對應(yīng)的包合率分別為49.00%±0.12%、62.18%±0.17%、75.36%±0.98%和38.63%±0.46%，這一結(jié)果與環(huán)糊精的多孔結(jié)構(gòu)間沒有完全對應(yīng)，說明不同客體分子的空間結(jié)構(gòu)可能對環(huán)糊精的包和率存在影響。

表1 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物的包和率

注：同列不同字母表示差異顯著（<0.05）。

Note: Different letters within the same column indicate significant difference (<0.05).

2.3 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物相溶解度試驗

-CD、-CD、-CD、HP--CD與反式-2-己烯醛的相溶解曲線如圖2所示。

圖2 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物的相溶解曲線圖

不同環(huán)糊精包合物中反式-2-己烯醛的溶解度存在較大差異，增溶效果由高到低依次為HP--CD、-CD、-CD和-CD。隨著環(huán)糊精濃度增加，反式-2-己烯醛在環(huán)糊精中溶解性呈線性上升趨勢。比較穩(wěn)定常數(shù)可知（表2），穩(wěn)定常數(shù)與溶解性呈正相關(guān)，-CDTH、-CDTH、-CDTH、HP--CDTH的穩(wěn)定常數(shù)分別為62.7、349.4、1 686.1、4 372.8，與相溶解曲線的測定結(jié)果保持一致。此外，-CDTH、-CDTH、-CDTH、HP--CDTH的相溶解度曲線均為A類型，以-CDTH的固有溶解度最高。

2.4 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物抑菌性對比研究

抑菌試驗結(jié)果（圖3）表明，各包合物對指狀青霉均表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性。培養(yǎng)2 d時，1.00 mg/mL-CDTH、-CDTH、-CDTH和2.00 mg/mL HP--CDTH可完全抑制指狀青霉菌絲體生長。隨著培養(yǎng)時間延長至4 d，1.00 mg/mL-CDTH和-CDTH仍可以完全抑制菌絲體生長，而-CDTH和HP--CDTH完全抑制菌絲體生長的濃度分別為2.00 mg/mL和4.00 mg/mL。因此，-CDTH、-CDTH、-CDTH、HP--CDTH最小抑菌濃度（MIC）分別為1.00、1.00、1.00和2.00 mg/mL，最小殺菌濃度（MFC）分別為2.00、1.00、1.00和4.00 mg/mL。綜合溶解度和抑菌等結(jié)果，后續(xù)試驗均采用-CDTH。

表2 反式-2-己烯醛環(huán)糊精包合物的相溶解度參數(shù)

注：上標不同字母表示同一時間不同處理間的差異顯著性（P<0.05）。

2.5 γ-CDTH對接種綠霉病菌的椪柑果實腐爛率的影響

圖4結(jié)果表明，-CDTH能有效降低果實綠霉病的發(fā)生。貯藏3 d時，對照組果實開始發(fā)病，發(fā)病率為18.3%，此時0.025%咪酰胺對照組發(fā)病率為3.3%，4×MFC-CDTH處理組發(fā)病率為6.7 %，8×MFC-CDTH處理組未發(fā)病。貯藏6 d時，對照組果實完全腐爛，此時4×MFC處理組果實發(fā)病率分別為75%，8×MFC-CDTH處理組和0.025%咪酰胺處理組果實發(fā)病率相當(dāng)，分別為58.3%和56.7%。

注：不同字母表示同一時間不同處理間的差異顯著性（P<0.05），4×MFC和8 × MFC濃度分別為4.00和8.00 mg·mL-1。

2.6 γ-CDTH對接種綠霉病菌的椪柑果實品質(zhì)影響

-CDTH對接種指狀青霉椪柑果實品質(zhì)的影響如表3所示。隨著貯藏時間延長，處理組和對照組果實失重率均逐漸增加。色澤是柑橘果實外觀的重要表現(xiàn)，維生素C含量、可溶性固形物和硬度在一定程度上反映柑橘果實的成熟度和新鮮度。在果實貯藏期間內(nèi)，色澤、維生素C含量、可溶性固形物緩慢升高，而硬度逐漸減小。貯藏5 d后，8 mg·mL-1-CDTH處理組硬度值（1.29 N）顯著高于對照組（1.23 N，<0.05），說明8×MFC-CDTH處理組可以保持果實硬度。在整個貯藏期間內(nèi)，不同處理對果實品質(zhì)（色澤、維生素C含量、可溶性固形物）影響差別不大。

2.7 γ-CDTH結(jié)構(gòu)表征

2.7.1 掃描電鏡觀察

-CD、-CD與反式-2-己烯醛的物理混合物和-CDTH的表面形態(tài)如圖5所示。-CD晶體為表面粗糙且規(guī)則的四方棱形，形狀較小[25]，反式-2-己烯醛與環(huán)糊精物理混合物和環(huán)糊精本身形態(tài)相同，說明兩者間不存在明顯的相互作用。-CDTH為表面光滑且規(guī)則的片狀，且尺寸相較于物理混合物而言明顯變小。推測可能是由于反式-2-己烯醛客體分子進入環(huán)糊精分子中，導(dǎo)致其形態(tài)結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。以上結(jié)果說明反式-2-己烯醛與-CD之間發(fā)生包合作用。

表3 γ-CDTH對接種指狀青霉椪柑果實采后品質(zhì)的影響

注：不同字母表示同一貯藏時間不同處理間的差異顯著性（<0.05）。

Note: Different lowercase letters within a column at each time point indicate the significance among different treatments（<0.05）.

圖5 γ-CDTH與γ-CD、反式-2-己烯醛與γ-CD物理混合物的掃描電鏡圖片

2.7.2 核磁共振分析

進一步通過核磁共振探討了包合物結(jié)構(gòu)的具體變化。反式-2-己烯醛、-CD和-CDTH均發(fā)生顯著化學(xué)位移，具體結(jié)果如表4所示，-CD的H-3?、H-5?和反式-2-己烯醛的H-6位移差發(fā)生了顯著變化，分別為0.08、0.06和0.12。以上結(jié)果表明，-CDTH是由反式-2-己烯醛的H-6從-CD的窄口端進入空腔內(nèi)，與-CD的H-3?、H-5?之間產(chǎn)生相互作用形成的。

3 討 論

植物精油是從植物花、果實和葉片等不同部位提取的一類揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物，因具有高效、安全無毒、可降解、不易誘導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，逐漸成為控制果蔬采后病害的替代方案[8,9,11,16,21]。反式-2-己烯醛是番茄、柑橘等多種植物精油典型揮發(fā)性組分，對細菌、真菌類病原菌具有很強的抑制作用[26-28]，但存在易揮發(fā)、不溶于水等缺點，阻礙了其實際應(yīng)用。本研究成功制備了-CDTH、-CDTH、-CDTH和HP--CDTH。并發(fā)現(xiàn)這些包合物能不同程度抑制指狀青霉菌絲體生長和柑橘果實綠霉病的發(fā)生，以-CDTH的效果較佳，且對果實品質(zhì)無明顯不利影響。這一結(jié)果可能與-CDTH包合率較好有關(guān)。包合率是衡量包合效果的重要指標，其決定了包合物在水中釋放客體物質(zhì)的量，從而影響包合物的抑菌效果[29]。在本研究中，-CDTH的包合率為75.36%±0.98%，高于-CDTH（49.00%±0.12 %）、-CDTH（62.18%±0.17%）和HP--CDTH（38.63%±0.46%），說明-CDTH是一種可有效控制柑橘采后病害的綠色防腐保鮮劑。

表4 反式-2-己烯醛、γ-CD和γ-CDTH核磁氫譜的化學(xué)位移（δ）及化學(xué)位移差Δδ

相溶解度可以反映主客體分子之間的結(jié)合能力，同時可以用來評價包合物的溶解性能[30]。研究表明，-CD包合植物精油可以顯著提高包合物的溶解性[25]。本研究也存在類似的現(xiàn)象。如表2所示，-CD包合反式-2-己烯醛的平衡穩(wěn)定常數(shù)為1 686.1，說明反式-2-己烯醛可能進入-CD的內(nèi)部并與之相互作用，這一現(xiàn)象與SEM觀察結(jié)果保持一致。SEM是通過觀察主客體分子、包合物及其物理混合物的表面形態(tài)差異來判斷包合物是否形成的方法[31]。Dou等[17]研究表明-CD與植物精油客體分子進行包合后會改變晶體形狀結(jié)構(gòu)，這與本研究有著相似結(jié)論。-CDTH與-CD和物理混合物相比較，-CDTH為表面光滑且規(guī)則的片狀，尺寸明顯變小。這可能是由于反式-2-己烯醛客體分子進入環(huán)糊精分子中，改變其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

核磁共振光譜法是目前研究環(huán)糊精包合物包和模式的最有效的技術(shù)手段之一，它能直接觀察到主客體分子中各原子的變化，從而解析不同原子之間的相互作用[32]。由1H NMR光譜可以得知，反式-2-己烯醛的H-6和-CD的H-3?、H-5?之間存在明顯的相互作用。與Zhang等[29]研究報道的反式-2-己烯醛通過從空腔寬口端嵌入-CD腔內(nèi)不同，本研究中反式-2-己烯醛的醛基主要通過-CD的窄口端嵌入-CD腔內(nèi)，從而完成包合過程。醛基是植物精油抑菌組分的主要活性基團之一，由于其化學(xué)性質(zhì)活躍，與空氣中氧原子接觸后極易被氧化而喪失抑菌活性[9]。通過環(huán)糊精與反式-2-己烯的包和，能對活性醛基進行有效保護，從而達到提高反式-2-己烯醛穩(wěn)定性、保持反式-2-己烯醛抑菌能力的目的。

4 結(jié) 論

1）通過飽和水溶液法成功制備了反式-2-己烯醛與-環(huán)糊精、-環(huán)糊精、-環(huán)糊精和羥苯基--環(huán)糊精的4種包合物，分別命名為-CDTH、-CDTH、-CDTH和HP--CDTH。離體抑菌試驗表明，-CDTH、-CDTH、-CDTH和HP--CDTH對指狀青霉MIC分別為1.00、1.00、1.00和2.00 mg/mL，MFC分別為2.00、1.00、1.00和4.00 mg/mL。-CDTH包合率為75.36%，遠高于其他3種包合物，其溶解度僅次于HP--CDTH。

2）-CDTH能顯著降低接種指狀青霉椪柑果實綠霉病發(fā)病率和發(fā)病進程（0.05），以8.00 g/L-CDTH處理效果較佳。當(dāng)對照果實全部腐爛時，8.00 g/L-CDTH處理組果實發(fā)病率僅為58.3%，效果與咪鮮胺相當(dāng)（56.7%）。此外，-CDTH處理對椪柑果實色澤、維生素C含量和可溶性固形物等果實品質(zhì)基本無影響。

3）-CDTH的外觀形態(tài)與TH和-CD之間存在明顯差別。核磁共振分析表明，-CD的H-3?和H-5?與TH的H-6之間的氫鍵相互作用是形成-CDTH的作用基礎(chǔ)。

[1] Singh B, Singh J P, Kaur A, et al. Insights into the chemical composition and bioactivities of citrus peel essential oils[J]. Food Research International, 2021, 143: 110231.

[2] 熊琪，楊書珍，曹正清，等. 毛霉誘導(dǎo)臍橙產(chǎn)抗病物質(zhì)對指狀青霉和酸腐菌的抑制[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2020，36(9)：315-322.

Xiong Qi, Yang Shuzhen, Cao Zhengqin, et al. Inhibition of induced citrus peel disease-resistant components againstand[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(9): 315-322.(in Chinese with English abstract)

[3] Chen Y, Pan H, Hao S, et al. Evaluation of phenolic composition and antioxidant properties of different varieties of Chinese citrus[J]. Food Chemistry, 2021, 364: 130413.

[4] 陳力維，張鴻雁，鄧麗莉，等. 桔梅奇酵母液體制劑的制備及其在柑橘果實上的應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2021，37(18)：299-306.

Chen Liwei, Zhang Hongyan, Deng Lili, et al. Preparation and application of liquid bioformulation ofon citrus fruits[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(18): 299-306. (in Chinese with English abstract)

[5] 張卓，聶德超，趙琛，等. 柑橘類植物精油的抗菌活性及其作用機制[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2022，34(2)：1-7.

Zhang Zhuo, Nie Dechao, Zhao Chen, et al. Antibacterial activity and mechanism of essential oils from citrus plants[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2022, 34(2): 1-7. (in Chinese with English abstract)

[6] 馬秋，章勇，王照國，等. 5種植物精油抑菌活性及其化學(xué)成分研究[J]. 植物保護，2020，46(4)：161-167.

Ma Qiu, Zhang Yong, Wang Zhaoguo, et al. Antimicrobial activity of the essential oils from five plants[J]. Plant Protection, 2020, 46(4): 161-167. (in Chinese with English abstract)

[7] Wang S, Hao X, Qu Y, et al. The Role of-2-hexenal in plant defense responses[J]. Chinese Bulletin of Botany, 2021, 56(2): 232.

[8] 段騰飛，李昭，岳田利，等. 反式-2-己烯醛對獼猴桃貯藏過程擴展青霉生長的抑制作用[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2019，35(2)：293-301.

Duan Tengfei, Li Zhao, Yue Tianli, et al. Study on inhibitory effect of-2-hexenal on growth ofat kiwi fruit storage[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2019, 35(2): 293-301. (in Chinese with English abstract)

[9] 楊艷琴. 兩種脂肪醛及其結(jié)構(gòu)類似物對柑橘酸腐病菌的抑制及構(gòu)效分析[D]. 湘潭：湘潭大學(xué)，2019.

Yang Yanqin. Inhibition and Structural-Activity Analysis of Two Fatty Aldehydes and Their Structural Analogues Against.[D]. Xiangtan: Xiangtan University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[10] da Silva B D, Bernardes P C, Pinheiro P F, et al. Chemical composition, extraction sources and action mechanisms of essential oils: Natural preservative and limitations of use in meat products[J]. Meat Science, 2021, 176: 108463.

[11] 歐陽秋麗，劉洋梅，陳悅，等. α-松油醇對指狀青霉抑霉唑抗性菌株P(guān)dw03的抑制作用[J]. 食品科學(xué)，2022，43(7)：8-13.

Ouyang Qiuli, Liu Yangmei, Chen Yue, et al. Antifungal action of-terpineol on imazalil-resistantPdw03[J]. Food Science, 2022, 43(7): 8-13.

[12] Guo Q, Du G, Jia H, et al. Essential oils encapsulated by biopolymers as antimicrobials in fruits and vegetables: A review[J]. Food Bioscience, 2021, 44: 101367.

[13] Petitjean M, García-Zubiri I X, Isasi J R. History of cyclodextrin-based polymers in food and pharmacy: A review[J]. Environmental Chemistry Letters, 2021, 19(4): 3465-3476.

[14] 鄭虎哲，Choi Jihye，Seong Giun，等. 蘋果多酚-殼寡糖微膠囊的制備表征及釋放特性[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2020，36(14)：281-289.

Zhen Huzhe, Choi Jihye, Seong Giun, et al. Preparation, characterization and health benefit functions of unripe apple polyphenols-chitooilgosaccharides microcapsule[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(14): 281-289. (in Chinese with English abstract)

[15] Yue Q, Shao X, Wei Y, et al. Optimized preparation of tea tree oil complexation and their antifungal activity against[J]. Postharvest Biology and Technology, 2020, 162: 111114.

[16] Dong Y, Li Y, Long H, et al. Preparation and use of-2-hexenal microcapsules to preserve ‘Zaosu’pears[J]. Scientia Horticulturae, 2021, 283: 110091.

[17] Dou S W, Ouyang Q L, You K Y, et al. An inclusion complex of thymol into β-cyclodextrin and its antifungal activity against[J]. Postharvest Biology and Technology, 2018, 138: 31-36.

[18] Arya P, Raghav N. In-vitro studies of Curcumin-- cyclodextrin inclusion complex as sustained release system[J]. Journal of Molecular Structure, 2021, 1228: 129774.

[19] 王娜，張抗懷，毛文彬，等. 相溶解度法研究不同環(huán)糊精對淫羊藿苷的增溶作用[J]. 中國藥師，2020，23(2)：260-263.

Wang Na, Zhang Kanghuai, Mao Wenbin, et al. Study on solubilization of different types of cyclodextrin for icariin by phase solubility method[J]. China Pharmacist, 2020, 23(2): 260-263. (in Chinese with English abstract)

[20] 李志英，劉麗瓊，張海容. 相溶解度法研究羥丙基--環(huán)糊精對肉桂酸的增溶作用[J]. 分子科學(xué)學(xué)報，2010，26(4)：294-296.

Li Zhiying, Liu Liqiong, Zhang Hairong. Study on the enhancing solubility of hydroxycinnami in hydroxypropyl--cyclodextrin by phase solubility method[J]. Journal of Molecular Science, 2010, 26(4): 294-296. (in Chinese with English abstract)

[21] 李路，李蔚，車金鑫，等.-茴香醛抑制柑橘酸腐病菌的作用機制[J]. 食品科學(xué)，2020，41(9)：133-138.

Li Lu, Li Wei, Che Jinxin, et al. Antifungal activity and mechanism ofanisaldehyde aganist[J]. Food Science, 2020, 41(9): 133-138. (in Chinese with English abstract)

[22] 荊佳伊，劉曉佳，鄧麗莉，等. 采收成熟度對晚熟W.默科特柑橘貯藏期品質(zhì)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2021，37(5)：303-309.

Jing Jiayi, Liu Xiaojia, Deng Lili, et al. Effects of harvesting maturity on the quality changes during storage of late maturing[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(5): 303-309. (in Chinese with English abstract)

[23] Jiang L, Wang P, Kou L, et al. Preparation and physicochemical properties of catechin/-cyclodextrin inclusion complex nanoparticles[J]. Food Biophysics, 2021, 16(3): 317-324.

[24] 薛松，潘繼飛，陳建英，等. 水楊酸羥丙基--環(huán)糊精包合物的制備及表征[J]. 食品與藥品，2021，23(6)：529-533.

Xue Song, Pan Jifei, Chen Jianying, et al. Preparation and characterization of salicylate hydroxypropyl--cyclodextrin inclusion complex[J]. Food and Drugs, 2021, 23(6): 529-533. (in Chinese with English abstract)

[25] 李進霞，王佳，康明麗，等. 芹菜素-環(huán)糊精包合物的表征和抗氧化活性研究[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床，2020，35(4)：647-651.

Li Jinxia, Wang Jia, Kang Mingli, et al. Characterization and antioxidant activity of apigenin--cyclodextrin inclusion complex[J]. Drugs & Clinic 2020, 35(4): 647-651. (in Chinese with English abstract)

[26] 王新策，朱莉莉，陳慶敏，等. 反式-2-己烯醛的生態(tài)生理功能及其在果蔬保鮮中的應(yīng)用[J]. 中國果菜，2020，40(12)：1-7.

Wang Xince, Zhu Lili, Chen Qingmin, et al. Eco-physiological function of-2-hexenal and its application in preservation of fruits and vegetables[J]. China Fruit & Vegetable, 2020, 40(12): 1-7. (in Chinese with English abstract)

[27] Youssef K, Hussien A. Electrolysed water and salt solutions can reduce green and blue molds while maintain the quality properties of ‘’ late oranges[J]. Postharvest Biology and Technology, 2020, 159: 1-11.

[28] 王姝瑤，郝鑫，曲悅，等. 反式-2-己烯醛在植物防御反應(yīng)中的作用[J]. 植物學(xué)報，2021，56(2)：232-240.

Wang Shuyao, Hao Xin, Qu Yue, et al. The role of-2-hexenal in plants defense responses[J]. Chinese Bulletin of Botany, 2021, 56(2): 232-240. (in Chinese with English abstract)

[29] Zhang Y H, OuYang Q L, Duan B, et al.-2-hexenal/-cyclodextrin effectively reduces green mold in citrus fruit[J]. Postharvest Biology and Technology, 2022, 187: 111871.

[30] 顧佳麗，趙恒，劉璐，等. 芬苯達唑與-環(huán)糊精包合物的制備及表征[J]. 化學(xué)研究與應(yīng)用，2020，32(5)：808-812.

Gu Jiali, Zhao Heng, Liu Lu, et al. Preparation and characterization of the fenbendazol--cyclodextrin inclusion[J]. Chemical Research and Application, 2020, 32(5): 808-812. (in Chinese with English abstract)

[31] 范珊珊，李鐵男，陸紀宏，等. 氯雷他定羥丙基--環(huán)糊精包合物的制備及工藝優(yōu)化[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué)，2021，11(11)：68-71.

Fan Shanshan, Li Tienan, Lu Jihong, et al. Optimization of preparation and process of inclusion complex of loratadine with hydroxypropyl--cyclodextrin[J]. China Medicine and Pharmacy, 2021, 11(11): 68-71. (in Chinese with English abstract)

[32] Zhao X, Qiu N, Ma Y, et al. Preparation, characterization and biological evaluation of β-cyclodextrin-biotin conjugate based podophyllotoxin complex[J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2021, 160: 105745.

Preparation of plant essential oils and cyclodextrin inclusion complexes and its inhibition effects on citrus green mold

Tan Yuanzhen1, Zhang Yonghua1, Zhu Xiangrong2, Su Donglin2, Li Gaoyang2, Tao Nengguo1※

(1.,,411105,; 2.,410125,)

Green mold caused byis one of the most destructive postharvest diseases in citrus fruit. Chemical fungicides (such as prochloraz) can be expected to effectively control this disease. But the widespread use of chemicals can easily lead to drug resistance of the pathogen, environmental pollution and food safety risks. Previous studies have shown that the plant essential oils and their bioactive components can be served as a type of potential biofungicide, due to the effective reduction of the postharvest disease in citrus fruit without impairing the fruit quality. However, the scale application can be largely limited by the volatility and easily oxidized property. Fortunately, the inclusion of cyclodextrins can be expected to improve the effectiveness of plant essential oils. In this study, the saturated aqueous solution was used to prepare the inclusion complexes of-2-hexenal, an active component in plant essential oils, particularly with four kinds of cyclodextrins including-cyclodextrin (-CD),-cyclodextrin (-CD),-cyclodextrin (-CD), and hydroxypropyl-- cyclodextrin (HP--CD). An effort was also made to improve the antifungal efficiency of-2-hexenal. At the same time, the antifungal activity of these inclusion complexes againstwas analyzed byassay, in order to determine the structure and the inclusion mode of the inclusion complex with the highest efficiency. As a result, four inclusion compounds designated as-CDTH,-CDTH,-CDTH, and HP--CDTH, respectively, were prepared by the saturated aqueous solution. The morphological results showed that the-CDTH,-CDTH, and-CDTH powders were fine and dense, while the HP--CDTH powder was rough with distinct particles. Theantifungal data demonstrated that these inclusion compounds were used to effectively inhibit the growth ofmycelium in a concentration-dependent manner. The minimum antifungal concentration (MFC) of-CDTH and-CDTH to the mycelial growth ofwas estimated to be both 1.00 mg/mL, while the MFCs of-CDTH and HP--CDTH were 2.00 and 4.00 mg/mL, respectively. The entrapment efficiency indicated that the highest entrapment efficiency (75.36%) was found in the-CDTH, whereas the HP--CDTH was the lowest entrapment efficiency (38.63%). The Atype was used to describe the phase solubility curves of the four cyclodextrin inclusion compounds. The solubility was also ranked in the descending order of HP--CD,-CD,-CD,-CD. The best overall performance was found in the-CDTH considering theantifungal efficiency, entrapment efficiency, and solubility. Thus, the-CDTH was selected as the material for the follow-up experiments.assay showed that the-CDTH at different concentrations reduced the incidence of green mold in citrus fruit at varying degrees (<0.05), with 8.00 g/L-CDTH as the most effective concentration. Once the control fruits were totally rotten after 6 d storage, the disease incidence in the samples of 8.00 g/L-CDTH treatment was only 58.3%, which was comparable to that of prochloraz (56.7%). In addition, the γ-CDTH treatment effectively maintained the citrus fruit firmness without any adverse effects on the weight loss rate, color, vitamin C, and total soluble solids contents of citrus fruit. The Scanning Electron Microscopy (SEM) observation revealed that the shapes and sizes of-CDTH were quite different from those of-CD and physical mixtures, the varying sizes and irregular crystals were found in-CD. In contrast, the physical mixtures presented a rough surface, whereas the-CDTH was a smooth surface with a flake-like morphology. The nuclear magnetic resonance (NMR) analysis demonstrated that the hydrogen bonding interactions between H-3? and H-5? of-CD and H-6 of-2-hexenal were attributed to the formation of-CDTH. In summary, four inclusion compounds of-2-hexenal with cyclodextrins were prepared to further verify the antifungal efficiency and structural characteristics of-CDTH. The findings can provide a direct basis for the-CDTH to control citrus postharvest diseases in the development of plant-derived natural preservatives.

agricultural products; postharvest disease;-cyclodextrin;-2-hexenal; inclusion complexes; antifungal activity

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.23.029

TS255.3

A

1002-6819(2022)-23-0276-08

譚元珍，張永華，朱向榮，等. 植物精油與環(huán)糊精包合物的制備及對柑橘綠霉病的抑制作用[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2022，38(23)：276-283.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.23.029 http://www.tcsae.org

Tan Yuanzhen, Zhang Yonghua, Zhu Xiangrong, et al. Preparation of plant essential oils and cyclodextrin inclusion complexes and its inhibition effects on citrus green mold[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(23): 276-283. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.23.029 http://www.tcsae.org

2022-06-11

2022-11-22

湖南省科技廳重點研發(fā)計劃項目（2021NK2014）

譚元珍，研究方向為果蔬貯藏與保鮮。Email：1329890006@qq.com

陶能國，博士，教授，研究方向為果蔬貯藏與保鮮。Email：nengguotao@126.com