響應(yīng)面法優(yōu)化刺五加果酒的釀造工藝

賈金輝，柴虹宇，程貴蘭，蔡智軍，張海濤，田曉玲，梁文珍

（遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧 營口 115009）

刺五加主要于分布東北、華北等地區(qū)，尤其在東北山區(qū)及半山區(qū)儲(chǔ)量豐富，其根莖和根為名貴中藥材，又稱五加參[1-2]。刺五加的葉和果實(shí)既可以食用也可以藥用，刺五加果營養(yǎng)豐富，其果實(shí)含有人體全部的必需氨基酸和Fe、Se等多種微量元素以及蔗糖、果糖、多糖等可發(fā)酵性糖，其中刺五加果實(shí)中的多糖和根莖的多糖類似，具有提高免疫力的功能[3]；同時(shí)刺五加果具有鎮(zhèn)定安神以及抗疲勞的作用，能夠緩解乏力、健忘、心悸等癥狀[4-6]。由于刺五加野生資源豐富，且耐寒、耐貧瘠，種植簡(jiǎn)單易行，推廣刺五加的種植，能在一定程度上提高山區(qū)農(nóng)民的收入[7-9]。

目前刺五加資源的利用主要是在刺五加根莖的提取入藥方面，而刺五加果的利用方面研究較少[10]。刺五加果含有蔗糖等可發(fā)酵性糖、豐富的果香、較高的出汁率以及氮源，能夠釀制果酒[11-13]。釀造刺五加果酒可以充分利用營養(yǎng)豐富的刺五加果實(shí)，增加刺五加的附加值，對(duì)刺五加果的深加工和野生資源的多方面利用具有重要意義。本文以刺五加果為原料，研究釀造刺五加果酒，以酒精度和感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行料水比、果膠酶添加量、發(fā)酵溫度和接種量4個(gè)單因素試驗(yàn)，在確定發(fā)酵溫度的基礎(chǔ)上，進(jìn)行其他3個(gè)因素的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定刺五加果酒的最佳釀造工藝，為刺五加果酒開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺五加（新鮮）：市售；釀酒酵母、果膠酶（10000U/mL）、焦亞硫酸鉀（食品級(jí)）：意大利英納帝斯公司；白砂糖（食品級(jí)）：中糧糖業(yè)遼寧有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RHB-02手持糖度計(jì)：上海奮業(yè)光電儀器有限公司；JH-03S電子稱、JH120-3電子天平：北京京衡偉業(yè)科技有限公司；HH-M4恒溫水浴鍋：上海赫田科學(xué)儀器有限公司；JCP-5除梗破碎機(jī)：新鄉(xiāng)市領(lǐng)先輕工機(jī)械有限公司；BIOQ-6009MINIQ生物發(fā)酵罐：匯和堂生物工程設(shè)備（上海）有限公司；JLM-02膜過濾機(jī)：煙臺(tái)帝伯仕自釀?dòng)邢薰?；GDP12-9灌裝機(jī)：青州市鵬程包裝機(jī)械有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 刺五加果酒釀造工藝流程

刺五加鮮果→分選→清洗→除梗破碎→加水→加果膠酶→加硫→調(diào)糖→浸漬→接種酵母→酒精發(fā)酵→過濾→灌裝→刺五加果酒。

1.3.2 操作要點(diǎn)

刺五加果預(yù)處理：除去腐爛發(fā)霉的刺五加果，清洗選好的刺五加果實(shí)，洗凈控水后，將其倒入除梗破碎機(jī)中，先去除刺五加果梗再將果實(shí)進(jìn)行破碎，這樣避免果梗中的不良物質(zhì)進(jìn)入果酒[14]，將得到刺五加果醪導(dǎo)入浸漬罐中待用。

加水：向浸漬罐中加入純水，刺五加果與純水的比例為3∶2（kg/L），因?yàn)榇涛寮庸廖侗容^重，添加適量的水有利于減少辛味，并保持刺五加果中營養(yǎng)功效[15]。

加果膠酶和硫：向刺五加果醪中加入果膠酶，操作步驟是稱量果膠酶調(diào)節(jié)濃度至80 mg/L左右，然后加入20℃純水，攪拌均勻?qū)⑵淙芙?，加入刺五加果醪中，再進(jìn)行充分?jǐn)嚢?，使其混合均勻。因?yàn)榇涛寮庸泄z物質(zhì)含量較高[16]，加入適量的果膠酶有利于提高刺五加果的出汁率以及提高果酒產(chǎn)品的穩(wěn)定性[17]。加入果膠酶12 h后向刺五加果醪中繼續(xù)添加焦亞硫酸鉀，操作步驟是稱取80 mg/L的焦亞硫酸鉀，向其中加入純水并攪拌溶解，待沒有焦亞硫酸鉀顆粒即溶解充分后，倒入刺五加果醪中，攪拌均勻。添加焦亞硫酸鉀的目的是殺死有害細(xì)菌并且抑制非釀酒酵母的活力，從而防止刺五加果酒染菌破敗，使發(fā)酵順利進(jìn)行[18]。

調(diào)糖及浸漬：刺五加果加水稀釋后，果醪的糖度隨之降低，為了達(dá)到發(fā)酵所需的酒精度，需要額外添加白砂糖。加糖量計(jì)算方法為1%vol的酒精度可由18 g/L的蔗糖可轉(zhuǎn)化而成，按計(jì)算結(jié)果稱取白砂糖調(diào)節(jié)濃度至80g/L，并用果汁充分溶解糖，然后將溶解好的糖汁混合液導(dǎo)入刺五加果醪中，并進(jìn)行充分的攪拌。調(diào)好糖后，果醪在浸漬罐浸漬一段時(shí)間，再啟動(dòng)發(fā)酵，目的是讓刺五加果中的營養(yǎng)物質(zhì)充分的浸漬出來以及讓果膠酶充分的分解刺五加果中的果膠物質(zhì)，克服果膠的高黏度[17，19]，確保發(fā)酵的順利進(jìn)行。具體操作為浸漬的溫度20℃保持48 h。

酵母接種及酒精發(fā)酵：稱取200 mg/L的釀酒酵母，將其加入適量的35℃左右的刺五加果汁中攪拌均勻，并在35℃的水浴鍋中保溫度25 min，待酵母升起高泡后即為活化成功，再將酵母菌液從水浴鍋中冷卻至室溫（20℃），導(dǎo)入果醪中并攪拌均勻[19-20]。接種成功后，控制24℃的溫度進(jìn)行酒精發(fā)酵，發(fā)酵期間刺五加酒帽需壓入發(fā)酵液中3次/d，并測(cè)定相對(duì)密度，當(dāng)相對(duì)密度為0.995以下時(shí)說明發(fā)酵結(jié)束，大概用時(shí)8 d左右，接種量取決于發(fā)酵溫度，溫度越高發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)越短[21-22]。

過濾及灌裝：發(fā)酵結(jié)束后，需要立即分離皮渣，防止皮渣下沉與酒液混合渾濁，為了獲取澄清的刺五加果酒，還需要過濾處理，先將酒液經(jīng)過20 μm澄清紙板進(jìn)行粗濾，然后再經(jīng)過0.22 μm除菌膜進(jìn)行精濾，從而達(dá)到無菌的狀態(tài)，最后在無菌車間進(jìn)行灌裝。

1.3.3 單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)

在料水比 3∶2（kg/L）、果膠酶添加量 80 mg/L、發(fā)酵溫度24℃、接種量200 mg/L的初始發(fā)酵條件基礎(chǔ)上，分別改變料水比[1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、5∶2（kg/L）]、果膠酶添加量（40、60、80、100、120 mg/L）、發(fā)酵溫度（20、22、24、26、28 ℃）、接種量（100、150、200 、250、300 mg/L），進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各個(gè)指標(biāo)對(duì)刺五加果酒的酒精度及感官評(píng)價(jià)的影響。

通過單因素試驗(yàn)，選取顯著性強(qiáng)的料水比（A）、果膠酶（B）和接種量（C）為考察變量，以刺五加果酒的酒精度（Y）為響應(yīng)值，通過Design Expert 12軟件進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化刺五加果酒釀造工藝的因素和水平Table 1 Optimization of factors and levels in brewing process of Acanthopanax senticosus wine by response surface methodology

1.3.4 分析檢測(cè)

酒精度：參考GB 5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》中酒精計(jì)法；揮發(fā)酸：參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法[23]；總二氧化硫：參照GB/T 15038—2006中直接碘量法；微生物指標(biāo)：參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》測(cè)定菌落總數(shù)[24]，參考GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》測(cè)定大腸菌群數(shù)[25]。

感官評(píng)判：參照GB/T 15038—2006中葡萄酒感官要求，設(shè)立20人的專家小組，建立刺五加果酒的評(píng)價(jià)體系[23]，感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 刺五加果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of Acanthopanax senticosus wine

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制作圖表，采用Design-Expert 12進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化刺五加果酒釀造工藝的單因素試驗(yàn)

2.1.1 料水比對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響

由于刺五加果辛味比較重，添加適量的水有利于減少辛味，并保持刺五加果中營養(yǎng)成分的功效[15-16]，料水比對(duì)刺五加果酒的品質(zhì)起著十分重要的作用。料水比對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響如圖1所示。

圖1 料水比對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of material water ratio on the quality of Acanthopanax senticosus wine

圖1結(jié)果表明，隨著原料比例的增加，刺五加果酒的酒精度逐步升高，原因是刺五加果實(shí)含有可發(fā)酵性糖，隨著原料比例的增加，可發(fā)酵性糖也越多，產(chǎn)生的酒精度也越高；感官評(píng)分卻隨著料水比的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，且在料水比3∶2（kg/L）時(shí)達(dá)到最高值，因?yàn)榇涛寮庸廖侗容^重，加入少量的水可以稀釋這種味道，從而使感官評(píng)分增加，但過量的水會(huì)使刺五加果酒變得寡淡、顏色及營養(yǎng)物質(zhì)降低，導(dǎo)致感官評(píng)分降低。

2.1.2 果膠酶對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響

刺五加果中果膠物質(zhì)含量較高[16]，加入適量的果膠酶有利于提高刺五加果的出汁率以及提高果酒產(chǎn)品的穩(wěn)定性[17]，如圖2所示。

圖2結(jié)果表明，果膠酶在40 mg/L～60 mg/L時(shí)，酒精度逐漸增高，原因是果膠酶分解刺五加果中的果膠物質(zhì)，提高出汁率，從而發(fā)酵變得順利和徹底，但果膠酶達(dá)到80 mg/L后效果不再明顯；隨著果膠酶的增加，感官評(píng)分先升高后降低，原因是適量的果膠酶使得刺五加果酒變得澄清及穩(wěn)定，但是果膠酶超過100 mg/L后其因過量殘留在刺五加果酒中，影響酒液的澄清度及口感。

圖2 果膠酶對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of pectinase on the quality of Acanthopanax senticosus wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)刺五加果酒的酒精產(chǎn)率和香氣口感有重要影響，如圖3所示。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of Acanthopanax senticosus wine

圖3結(jié)果表明，隨著發(fā)酵溫度的升高，酒精度和感官評(píng)分都呈先升高后降低的趨勢(shì)，且在24℃都達(dá)到最高值，原因是適宜的溫度有利于酵母的繁殖和發(fā)酵。溫度低于22℃，酵母啟動(dòng)慢，發(fā)酵遲緩，酒精產(chǎn)率較低，且較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間會(huì)造成微生物侵染，導(dǎo)致酒體渾濁甚至破敗。溫度高于24℃，酵母菌的活動(dòng)開始受到影響，可能引起發(fā)酵的中止，導(dǎo)致?lián)]發(fā)酸含量上升、酒體質(zhì)量下降。由此可知發(fā)酵溫度為24℃左右為宜。

2.1.4 酵母接種量對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響

酵母接種量直接影響刺五加果酒的發(fā)酵進(jìn)程及感官品質(zhì)，如圖4所示。

圖4結(jié)果表明，當(dāng)酵母接種量低于150 mg/L時(shí)，酒精度和感官評(píng)分都較低，可能由于接種量不足，導(dǎo)致發(fā)酵不完全，產(chǎn)酒率較低，同時(shí)由于發(fā)酵緩慢，致使刺五加果汁容易氧化、甚至受到微生物侵染，影響口感。但當(dāng)接種量超過250 mg/L時(shí)，酒精度增加不再明顯，同時(shí)大量的酵母菌會(huì)使刺五加果酒產(chǎn)生酵母味，影響香氣和口感[26]。

圖4 接種量對(duì)刺五加果酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of inoculation amount on the quality of Acanthopanax senticosus wine

2.2 優(yōu)化刺五加果酒釀造工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 模型建立與方差分析

通過單因素試驗(yàn)，確定發(fā)酵溫度為24℃最佳，選取另外三個(gè)更為顯著性因素，按照表1進(jìn)行優(yōu)化釀造工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

表3 刺五加果酒釀造工藝Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Box Behnken experimental design and results of Acanthopanax senticosus wine technology

利用Design Expert 12軟件對(duì)表3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)作回歸分析，以刺五加果酒的酒精度為響應(yīng)值，構(gòu)建刺五加果酒釀造工藝參數(shù)的回歸方程：Y=11.66+0.312 5A-0.137 5B+0.1C-0.1AB-0.125AC-0.175BC-0.63A2-0.08B2-0.805C2。

對(duì)該方程進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型的方差分析，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of response surface regression model

由表 4可知，模型呈極顯著（P＜0.000 1），說明刺五加果酒的酒精度與料水比、果膠酶添加量和接種量關(guān)系顯著；失擬項(xiàng)P值為0.090 8＞0.05，不顯著，說明構(gòu)建的回歸模型不失擬，成功；離散系數(shù)=1.29%，說明試驗(yàn)的精確度高且可靠性強(qiáng)；刺五加果酒釀造工藝相關(guān)系數(shù)R2=0.977 2，說明該模型試驗(yàn)誤差小，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.947 9，表示該模型能夠解釋94.79%的響應(yīng)值變化；信噪比=18.218 1＞4，說明該模型很適合刺五加果酒釀造工藝試驗(yàn)的預(yù)測(cè)。通過顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、C2呈極顯著性，一次項(xiàng)B和二次項(xiàng)BC呈顯著性，其他項(xiàng)則呈不顯著性。因?yàn)镕值越大，表示該因素影響力越強(qiáng)，由表4可知對(duì)刺五加果酒釀造工藝影響的強(qiáng)弱順序：料水比＞果膠酶添加量＞接種量。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析與討論

對(duì)刺五加果酒的酒精度有顯著影響的三個(gè)因素的響應(yīng)面及等高線見圖5。

圖5 各因素兩兩交互作用對(duì)刺五加果酒酒精度影響Fig.5 The effect of pairwise interaction of various factors on the alcohol content of Acanthopanax senticosus wine

兩兩因素交互作用的強(qiáng)弱可通過等高線得出，如果等高線呈橢圓形則表明兩個(gè)因素的交互作用顯著，如果等高線呈圓形則表明兩個(gè)因素的交互作用不顯著[27]。由圖5可知，接種量和果膠酶添加量?jī)蓚€(gè)因素的交互作用等高線趨于橢圓，故對(duì)刺五加果酒的酒精度影響顯著；料水比和果膠酶添加量交互作用以及料水比和接種量的交互作用等高線趨于圓形，故對(duì)刺五加果酒感官評(píng)分影響不顯著。

根據(jù)所建模型的回歸方程求出最優(yōu)解，得到刺五加果酒釀造工藝的最佳條件：料水比為1.656∶1（kg/L），果膠酶添加量為60 mg/L，接種量為207.336 mg/L，得到刺五加果酒的酒精度為11.802%vol。

2.2.3 最優(yōu)釀造工藝驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)際操作將料水比修改為1.7∶1（kg/L）、接種量修改為207 mg/L，果膠酶添加量不變?nèi)詾?0 mg/L，按照此工藝參數(shù)得到實(shí)際刺五加果酒的酒精度為11.9%vol，與試驗(yàn)最優(yōu)解的酒精度十分接近，說明為刺五加果酒釀造工藝所構(gòu)建的響應(yīng)面模型真實(shí)準(zhǔn)確，有很強(qiáng)的參考價(jià)值[28]。

2.2.4 刺五加果酒質(zhì)量指標(biāo)及微生物指標(biāo)

在最佳釀造工藝條件下釀造出的刺五加果酒，顏色呈紅色、果香濃郁、酒體豐滿、風(fēng)格獨(dú)特，感官評(píng)分高達(dá)94，酒精度為11.9%vol，揮發(fā)酸為0.3 g/L，總硫?yàn)?2 mg/L；進(jìn)行微生物指標(biāo)檢驗(yàn)得到大腸菌群＜3個(gè)，菌落總數(shù)為12個(gè)，刺五加果酒的質(zhì)量指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合果酒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)確定刺五加果酒釀造工藝影響顯著性較強(qiáng)的因素，然后采用響應(yīng)面分析法對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。確定最佳工藝為料水比1.7∶1（kg/L），果膠酶添加量60 mg/L，接種量207 mg/L，發(fā)酵溫度24℃。得到刺五加果酒顏色呈紅色、果香濃郁、酒體豐滿、風(fēng)格獨(dú)特，酒精度為11.9%vol，感官評(píng)分為94，揮發(fā)酸為0.3 g/L，總硫?yàn)?2 mg/L，進(jìn)行微生物指標(biāo)檢驗(yàn)得到大腸菌群＜3個(gè)，菌落總數(shù)為12個(gè)，符合果酒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。