干燥方法對歐薄荷精油化學(xué)成分及生物活性的影響

白小慧， 艾米拉·奧肯， 努爾波拉提·阿依達(dá)爾汗，林國棟， 買吾蘭江·買提努爾,*

(1.中國科學(xué)院 新疆理化技術(shù)研究所 干旱地區(qū)植物資源與化學(xué)重點實驗室/新疆特有藥用資源利用重點實驗室， 新疆 烏魯木齊 830011； 2.中國科學(xué)院大學(xué) 化學(xué)科學(xué)學(xué)院， 北京 100039)

歐薄荷(MenthalongifoliaL.)是唇形科(Labiatae)薄荷屬(Mentha)多年生草本植物，喜歡在溫暖潮濕的地方生長，多生長在河溝邊或山野潮濕地，起源于歐洲，目前在我國除西藏外各省均有分布。歐薄荷是一種重要的藥食同源的植物，作為食物，歐薄荷有著悠久的使用歷史，其嫩葉不僅可以直接作為菜品食用，還可以在烹飪時作為調(diào)味香料，亦或是作為代茶泡水[1]。歐薄荷藥用時具有散氣、發(fā)汗、消炎、安神等功能[2]。此外，歐薄荷精油在抗氧化、抑菌[3-4]、止腹瀉[5]和肝保護(hù)[6]等方面也有很好的生物活性。

歐薄荷含有的薄荷油，是歐薄荷具有多種藥理作用的原因之一。作為精油制備的第一步，干燥方法是影響精油產(chǎn)率、組成成分和生物活性的主要因素之一[7]。Rodrigo等[8]研究了不同干燥方法對苦橙皮精油產(chǎn)率、化學(xué)組成成分及抗氧化和抑菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥是保持苦橙皮精油生物活性最有效的干燥方法?？碉@杰等[9]研究了曬干、鼓風(fēng)干燥和微波干燥對片姜黃精油的影響，發(fā)現(xiàn)鼓風(fēng)干燥和微波干燥，可能會使其精油成分中的莪術(shù)二酮和新莪術(shù)二酮發(fā)生異構(gòu)化反應(yīng)，使其相對含量發(fā)生變化。Guo等[7]研究了不同干燥方法對孜然籽精油化學(xué)成分和生物活性的影響，發(fā)現(xiàn)干燥方法使孜然籽精油在得率、化學(xué)成分、抗氧化和抑菌活性以及細(xì)菌DNA損傷保護(hù)作用方面均有差異。可見，選擇合適的干燥方法對精油的質(zhì)量有著重要影響。

先后有季節(jié)、生長環(huán)境及不同提取方法對歐薄荷精油成分差異影響的研究[10-13]。但有關(guān)干燥方法的研究較少，本研究以陰干、曬干、40 ℃烘干等3種不同方法對新疆阿克蘇地區(qū)生長期野生歐薄荷地上部分進(jìn)行干燥處理，以新鮮歐薄荷為對比，用水蒸氣蒸餾法提取精油，研究了干燥方法對歐薄荷精油產(chǎn)率的影響。通過氣相色譜- 四極桿- 飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-quadrupole-time-of-flight mass spectrometry，GC-Q-TOF/MS)定性分析精油化學(xué)成分，氣相色譜- 氫火焰離子檢測器(gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID)分析各成分相對含量，研究了干燥方法對精油化學(xué)成分及含量的影響。并通過DPPH自由基清除實驗及ABTS陽離子自由基清除實驗研究了干燥方法對歐薄荷精油抗氧化活性的影響，并用紙片擴(kuò)散法研究了干燥方法對精油抑菌活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

歐薄荷采摘于新疆阿克蘇地區(qū)庫車縣，經(jīng)中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所魯春芳副研究員鑒別為唇形科(Labiatae)薄荷屬(Mentha)歐薄荷(MenthalongifoliaL.)，標(biāo)本編號為：WY02663，引證標(biāo)本存放于中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所。正己烷，分析純，天津益力化學(xué)試劑有限公司；水解酪蛋白胨瓊脂(MHA)、水解酪蛋白胨肉湯(MHB)、沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB)，青島海博生物技術(shù)有限公司。

2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH自由基)，2,2-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS陽離子自由基)，過硫酸鉀，正構(gòu)烷烴(C7～C40)，Sigma-Aldrich公司； DMSO，天津永晟精細(xì)化工有限公司；無水硫酸鈉，合肥巴斯夫生物科技有限公司；藥敏紙片(直徑6 mm)，杭州微生物公司；白色念珠菌(CandidaAlbicans；ATCC 10231)、大腸桿菌(Escherichiacoli；ATCC 11229)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus；ATCC 6538)標(biāo)準(zhǔn)菌株，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B型氣相色譜- 四極桿- 飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-Q-TOF/MS)[配有電子轟擊離子源(EI)及Qualitative Analysis B.07.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]，美國安捷倫公司；7890B型氣相色譜系統(tǒng) (配有氫火焰離子檢測器和Agilent Open LAB control panel色譜工作站)，美國安捷倫公司；Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；細(xì)菌濁度儀，杭州齊威儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1歐薄荷干燥方法

新采摘的歐薄荷地上部分分別采用陰干、曬干和40 ℃烘干等3種方法干燥。

陰干方法是將新鮮歐薄荷晾在自然通風(fēng)和無陽光直射的房間[(21±6)℃]，持續(xù)干燥14 d。曬干方法是將新鮮歐薄荷平鋪在無遮擋物，陽光可直射的地面上，持續(xù)干燥兩天(氣溫：20～28 ℃，北風(fēng)3至4級)。烘干方法是將樣品在烘箱(徑體尺寸為55 cm×45 cm×55 cm)的托盤上單層鋪開，干燥溫度為40 ℃，持續(xù)干燥8 h。

1.3.2歐薄荷精油提取方法

參照Sousa等[14]的提取方法稍做修改，準(zhǔn)確稱量新鮮、陰干、曬干、歐薄荷、烘干歐薄荷4種樣品各100 g，隔水蒸餾提取4 h，收集精油并用無水硫酸鈉干燥，4 ℃保存。每組實驗重復(fù)3次，精油產(chǎn)率按式(1)計算。

(1)

式(1)中，m1為精油質(zhì)量，g；m2為樣品質(zhì)量，g。

1.3.3GC-FID分析方法

將50 μL精油溶解于1.45 mL正己烷中，進(jìn)行GC-FID檢測。

色譜柱為HP-5石英毛細(xì)柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。升溫程序為60 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。載氣為氮氣，流速1.0 mL/min。進(jìn)樣量0.3 μL，分流比為30∶1。使用峰面積歸一化法進(jìn)行精油中各成分相對含量的計算。

1.3.4GC-Q-TOF/MS分析方法

將50 μL精油溶解于1.45 mL正己烷中，進(jìn)行GC-Q-TOF/MS檢測。

色譜柱為HP-5石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序為60 ℃保持5 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。進(jìn)樣量0.3 μL，分流比為30∶1。

電子轟擊離子源，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，采樣頻率50 Hz，采樣模式為全掃描，激活電壓1.5 V，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500。以正構(gòu)烷烴為參照計算保留指數(shù)用于未知化合物的定性[15]。

1.3.5抗氧化活性測定方法

DPPH自由基清除能力測定。DPPH自由基清除率的測定參照Reis等[16]的方法并稍做修改。將100 μL不同濃度的精油- 乙醇溶液與等體積DPPH-乙醇溶液(0.2 mmol/L)混合。在室溫下避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀于517 nm波長處測量吸光度,并以維生素E的抗氧化活性作為對照。

ABTS陽離子自由基清除能力測定。ABTS陽離子自由基清除率的測定參照Re等[17]的方法并稍做修改。ABTS陽離子溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀溶液(2.45 mmol/L)等比例混合，室溫黑暗條件下反應(yīng)16 h，用無水乙醇稀釋至在734 nm波長處吸光度為0.700±0.05，制備得到ABTS陽離子儲備液。取100 μL不同質(zhì)量濃度梯度精油- 乙醇溶液與等體積ABTS陽離子儲備液混合，室溫下避光反應(yīng)5 min，于734 nm波長處測定吸光度，并以維生素E的抗氧化活性作為對照。

1.3.6抑菌活性測定方法

在Meriem等[18]的方法上做改進(jìn)，檢測4種精油樣品對白色念珠菌(Candidaalbicans)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用。具體操作為：SDB用于活化白色念珠菌，MHB用于活化大腸桿菌和金黃色葡萄球菌?；罨蟮陌咨钪榫?、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌用麥?zhǔn)媳葷醿x將其濃度分別調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞舛?。MHA用于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)，SDA用于白色念珠菌培養(yǎng)，取100 μL活化好的菌液于平板上，均勻涂布并干燥，等間距放置4個空白藥敏紙片(直徑6 mm)，依次滴加10 μL精油-DMSO溶液(25 mg/mL)。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量記錄抑菌圈直徑的大小，以mm為單位，每組實驗重復(fù)3次。氨芐青霉素及兩性霉素B為陽性對照，DMSO為陰性對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復(fù)測定3次，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Origin 8.5及Excel 用于圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥方法對歐薄荷精油產(chǎn)率的影響

不同干燥方法對歐薄荷精油產(chǎn)率影響見圖1。由圖1可知，在不同干燥方法下精油的產(chǎn)率有顯著差異(P< 0.05)。陰干歐薄荷精油產(chǎn)率最高(0.49%±0.01%)，其次是烘干(0.42%±0.03%)和曬干(0.19%±0.02%)。這與先前的研究結(jié)果相似[19-20]，經(jīng)曬干處理過的歐薄荷都有著較低精油產(chǎn)率，可能與在陽光的高溫暴曬下導(dǎo)致精油的大量流失有關(guān)[21]。

圖1 不同干燥方法對歐薄荷精油產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of different drying methods on yield of essential oil from Mentha longifolia L.

2.2 干燥方法對歐薄荷精油化學(xué)成分的影響

不同干燥方法制備的歐薄荷精油成分及含量變化分析結(jié)果見表1。因GC-Q-TOF/MS線性范圍窄，故采用GC-FID檢測各組分相對含量。通過保留指數(shù)(RI)及MS圖譜，共確定了44種化合物。陰干歐薄荷精油成分40種、烘干38種、曬干44種、新鮮歐薄荷精油35種，其中31種化合物為共有峰，包括14種烯烴類、7種醇類、8種醛酮、1種酯類及1種烷烴類化合物。精油以醛酮(56.73%～58.82%)和烯烴類(35.44%～38.63%)為主。主成分均為香芹酮(46.58%～50.75%)、檸檬烯(24.01%～29.71%)、E-薄荷酮(4.03%～5.13%)、E-石竹烯(4.5%～6.75%)和Z-二氫香芹酮(1.9%～14.6%)，這與Younis等[22]對蘇丹地區(qū)及Koliopoulos 等[23]對希臘地區(qū)歐薄荷精油主成分的研究結(jié)果相似，但含量上有差異，說明精油成分及含量同樣也受生長環(huán)境影響。與新鮮歐薄荷精油相比較，經(jīng)陰干和曬干法處理過的歐薄荷，其精油主成分檸檬烯和E-石竹烯含量有顯著性變化(P< 0.05)，檸檬烯含量不同程度上有所減少，而E-石竹烯含量有所增加，烘干藥材精油中，兩者含量變化差異不顯著。此外，3種干燥方法對香芹酮、E-薄荷酮和Z-二氫香芹酮的含量均有顯著性影響。香芹酮、E-薄荷酮及Z-二氫香芹酮含量均不同程度降低，陰干和烘干中Z-二氫香芹酮含量增加。

表1 不同干燥方法制得的歐薄荷精油化學(xué)成分組成Tab.1 Chemical compositions of essential oil from Mentha longifolia L. with different drying methods

續(xù)表1

干燥后的歐薄荷精油中的化合物的種類數(shù)較干燥前均有所增加，其中2-苯基-2-丁烯醛、丁香酚、β-波旁烯、E-石竹烯、石竹烯氧化物和3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-醇等6種成分，在新鮮歐薄荷精油中未檢測出，但在經(jīng)陰干、烘干和曬干處理后的歐薄荷精油中均有檢測出。表面上看，持續(xù)的干燥對這些化合物的合成和積累有促進(jìn)作用。

2.3 干燥方法對歐薄荷精油抗氧化活性的影響

DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除實驗結(jié)果表明：4種歐薄荷精油具有一定的抗氧化活性，4種精油在兩種測定方法下均呈現(xiàn)一致的結(jié)果，表現(xiàn)為經(jīng)陰干、40 ℃烘干及曬干3種干燥處理的歐薄荷，其精油對ABTS陽離子和DPPH自由基清除能力無顯著差異，但都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于新鮮歐薄荷精油。精油抗氧化活性是其多種組成成分協(xié)同作用的結(jié)果，精油中的微量成分與主要成分間的協(xié)同作用，也可有效加強抗氧化活性[24]。干燥后的3種歐薄荷精油抗氧化活性均有所增強，可能與干燥后精油中化合物種類增加有關(guān)。

表2 不同干燥方法歐薄荷精油的抗氧化活性Tab.2 Antioxidant activities of essential oil from Mentha longifolia L. with different drying methods mg/mL

2.4 干燥方法對歐薄荷精油抑菌活性的影響

通過白色念珠菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌3種菌，評估了干燥方法對精油抑菌活性的影響，結(jié)果見圖2。

不同字母代表組間顯著性差異，P<0.05。圖2 不同干燥方法歐薄荷精油的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activities of essential oil from Menthalongifolia L. with different drying methods

精油的抗菌活性也主要取決于其化學(xué)組成及含量，其中酚類、萜醇、酮、醛以及甾醇類等均為抗菌活性成分的重要組成[25-27]。抑菌結(jié)果顯示，陰干歐薄荷精油對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯高于經(jīng)40 ℃烘干、曬干及新鮮歐薄荷精油，其中新鮮歐薄荷精油對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用最弱。4種精油對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用由高到低則依次為陰干、曬干、烘干和新鮮。此外，4種精油樣品對大腸桿菌的抑制作用無顯著性差異。

3 結(jié) 論

不同干燥方法對歐薄荷精油的產(chǎn)率、組成成分、含量以及其抗氧化、抗菌活性均有影響。在3種不同的干燥條件下，其精油產(chǎn)率從高到低依次是陰干、烘干、曬干和新鮮。4種樣品中共檢測出44個化合物，陰干歐薄荷精油40種，烘干38種，曬干44種，新鮮35種，其中31種化合物為共有峰。包括14種烯烴類、7種醇類、8種醛酮、1種酯類及1種烷烴類化合物?？寡趸鸵志鷮嶒灡砻鳎?種歐薄荷精油對ABTS陽離子自由基和DPPH自由基均具有一定的清除作用，且經(jīng)陰干、40 ℃烘干及曬干等3種干燥處理后的歐薄荷，其精油對ABTS陽離子自由基和DPPH自由基的清除能力顯著強于新鮮歐薄荷精油。同時，4種精油均對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有一定的抑制作用。但陰干精油對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯高于其他3種精油。因此，結(jié)合精油產(chǎn)率及抑菌活性，陰干法是歐薄荷較佳的干燥方式。