食用菌鮮味強度評價及鮮味氨基酸和核苷酸提取工藝優(yōu)化

律 詩， 代晹鑫， 劉 野， 張 雨， 鄒婷婷

(北京工商大學 食品與健康學院， 北京 100048)

食用菌作為具有良好營養(yǎng)和保健功能的優(yōu)良食品資源，其中的鮮味物質可以用于開發(fā)食用菌天然風味增強劑以及天然調味品[1-2]。天門冬氨酸和谷氨酸是鮮味的基本組成成分，使食用菌產生了獨特的味道。姜萍萍等[3]測定了5種食用菌的氨基酸，發(fā)現(xiàn)其中含有的18種游離氨基酸，促進了食用菌的口味鮮美。除了游離氨基酸，核苷酸也是重要的鮮味物質，其中5′-鳥苷酸(5′-GMP)和5′-肌苷酸(5′-IMP)是最主要的鮮味核苷酸[4]。Yamaguchi等[5]提出用等鮮濃度(EUC)值來表示樣品中鮮味物質含量，客觀評價樣品中的鮮味強度。Phat等[6]測定了17種食用菌的鮮味化合物，包括5種核苷酸和2種游離氨基酸，其中雙孢蘑菇5種核苷酸總含量最高[(36.90±1.50)mg/g]，EUC值為(1.51±0.42)～(3 890±833)mg/g，多數(shù)食用菌呈現(xiàn)較高的鮮味值。

食用菌味道鮮美，目前提取食用菌中鮮味物質的主要方法是酶解法[7-8]。Poojary等[9]用酶法提取6種不同蘑菇的總游離氨基酸，發(fā)現(xiàn)復合酶提取率高， pH值、溫度和酶濃度的增加也能增加提取率。邴芳玲[10]利用食用菌水解酶對杏鮑菇進行酶解,通過單因素和響應面法對酶解條件進行優(yōu)化，結果表明：復合酶酶解得到更多的氨基酸，實際氨基酸含量為83.12 mg/g,與預測值相對誤差為4.89%。目前，食用菌鮮味評價主要是通過電子舌與感官評價相結合，缺少與EUC值結合的系統(tǒng)評價方法。

本研究通過電子舌、化學分析和感官評價對9種食用菌的鮮味強度進行評價，選定鹿茸菇為原料，以EUC值為指標，通過單因素和響應面法對鹿茸菇中鮮味氨基酸和核苷酸的提取工藝進行優(yōu)化，獲得最佳提取條件，旨在為鹿茸菇的利用和深加工提供進一步的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香菇、杏鮑菇、花菇、茶樹菇、姬松茸、猴頭菇，福建省古菌農業(yè)發(fā)展有限公司；鹿茸菇、蟲草花、牛肝菌，麗江安盛外貿有限責任公司；纖維素酶、風味蛋白酶、木瓜蛋白酶，滄州夏盛酶生物技術有限公司；氨基酸混合標準試劑、鄰苯二甲醛(OPA)、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)、硼酸鹽緩沖溶液，美國 Agilent 公司；5′-肌苷酸二鈉(5′-IMP)、5′-鳥苷酸二鈉(5′-GMP)、5′-腺苷酸二鈉(5′-AMP)、5′-胞苷酸二鈉(CMP)，美國Sigma公司；5′-黃苷酸二鈉(5′-XMP)，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈、磷酸、正己烷，色譜純，美國 Fisher Scientific 公司；色譜純磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀及分析純氫氧化鈉，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BJ- 800A型拜杰多功能粉碎機，德清拜杰家居用品貿易有限公司；HH- 2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京天林恒泰科技有限公司；BSA124S型電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；CR22N型高速冷凍離心機，天美(中國)科學儀器有限公司；MP511型pH計，上海雙旭電子有限公司；DDSJ- 308F型電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司；DHG- 9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；0.22 μm有機過濾器，德國Membrana公司；Agilent 1200型高效液相色譜- 質譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；SA402B型電子舌，日本Insent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品制備

將9種食用菌干貨在粉碎機中粉碎，過100目篩，密封保存于干燥器中備用，以料液比(g/mL)1∶20于室溫下浸泡2 h，再用電磁爐進行熬煮，先用1 000 W大火熬至沸騰，再用200 W小火熬煮15 min，1 000 r/min下離心20 min，取上清液備用[10]。

1.3.2游離氨基酸的測定

采用高效液相色譜對9種菌菇湯中游離氨基酸進行測定。分析方法：OPAFMOC柱前衍生化。色譜條件：Zorbax Eclipse- AAA 色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫35 ℃[11]。流動相A： 40 mmol/L NaH2PO4，配置時需用10 mol/L NaOH溶液調至pH值7.8，過膜抽濾；流動相B：乙腈- 甲醇- 水(體積比45∶45∶10)。氨基酸標準品：用0.1 mol/L HCl將氨基酸混合標準試劑稀釋為12.5、25.0、50.0、75.0、100.0 mmol/L。

1.3.3核苷酸含量的測定

利用HPLC對核苷酸進行分離檢測，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB- C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，流動相為0.02 mol/L KH2PO4(pH值3.80)，流速為1 mL/min，進樣量為1 μL，二極管陣列檢測波長254 nm，柱溫35 ℃[9]。

定量采用外標定量方法，將CMP、IMP、GMP、AMP和XMP的標準品分別配置成400、200、100、50、25 mg/L的標準溶液進行測定，將已知的質量濃度與測定峰面積結果繪制成標準曲線，用0.22 μm的濾膜對一定量的菌湯過濾，過濾后進樣，利用外標法測定核苷酸的含量。

1.3.4等鮮濃度測定

Yamaguchi等[5]提出食物呈鮮作用的客觀評價用EUC值來表示，單位g/100 g。EUC值是指在100 g干物質中，用MSG(味精)的含量來表示呈鮮物質的總量，用式(1)計算。

EUC=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj) 。

(1)

式(1)中，ai為呈鮮氨基酸(Glu或Asp)的質量，aj為呈味核苷酸(5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP、5′-XMP)的質量，bi為呈鮮氨基酸相對谷氨酸的值(Glu=1.000、Asp=0.077)，bj為呈味核苷酸相對5′-IMP的值(5′-IMP=1.00、5′-AMP=0.18、5′-GMP=2.30、5′-XMP=0.61)，1 218為協(xié)同作用常數(shù)。

1.3.5感官評價

感官評價小組由6男6女組成，年齡在24～30歲，以食用菌的鮮味強度作為評價指標。在感官評價之前用不同質量濃度(0.08、0.12、0.17、0.24、0.34、0.49、0.70、1.00 g/L)的谷氨酸鈉溶液對評價員進行鮮味強度的培訓。所有成員的感官測試在特定的實驗室中進行，感官評價人員品嘗菌菇湯并記錄他們所嘗到的鮮味強度和味覺感官屬性，并采用定量描述分析法(QDA)對菌菇湯鮮味強度進行評分。評分采用10分制，0～2(不含2)，味覺強度很弱；2～4，弱；4～6，中等；6～8，強；8～10，非常強。感官評價之前，每個樣品分成3份，并隨機編號放置于恒溫水浴鍋中保持40 ℃，當感官人員評價完一個樣品后，用純凈水漱口再品評下一個樣品。

1.3.6電子舌分析

采用日本INSENT進口SA402B型電子舌，擬用同人舌頭味覺工作原理相類似的人工脂膜傳感器技術，客觀數(shù)字化的評價食品或藥品等樣品的苦味、澀味、酸味、咸味、鮮味、甜味等基本味覺感官指標，同時還可以分析苦的回味、澀的回味和鮮的回味(豐富度)。

在檢測之前需要對電子舌進行活化。樣品檢測4次，每次常溫檢測10 min，取后3次為實驗數(shù)據(jù)，利用電子舌自帶的數(shù)據(jù)處理軟件對味覺強度數(shù)據(jù)進行采集。

1.3.7單因素實驗

通過電子舌、化學分析和感官評價實驗，選取鮮味強度最高的鹿茸菇進一步分析，選用復合酶1[纖維素酶(酶活1.1×104U/g)和木瓜蛋白酶(酶活10×104U/g)]、復合酶2[纖維素酶(酶活1.1×104U/g)和風味蛋白酶(酶活5×104U/g)]、復合酶3[風味蛋白酶(酶活5×104U/g)和木瓜蛋白酶(酶活10×104U/g)]在50 ℃進行酶解，酶解后，水浴鍋90 ℃滅酶15 min，12 000 r/min離心15 min。改變纖維素酶和風味蛋白酶添加量(1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500 U/g)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、酶解時間(1、2、3、4、5、6、7 h)和酶解pH值(3、4、5、6、7、8)，測定上清液鮮味氨基酸和鮮味核苷酸的含量，計算EUC值，以確定最佳實驗條件。

1.3.8響應面試驗

根據(jù)單因素實驗結果，采用Design-Expert中Box-Behnken方法設計響應面試驗，尋找EUC值最高的酶解條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

表格制作由Microsoft Office Excel 2010 軟件完成，采用IMB SPSS Statistics 26進行單因素方差分析和顯著性分析，顯著性分析采用Duncan檢驗，利用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 9種食用菌鮮味強度分析

2.1.1游離氨基酸的檢測結果

對9種食用菌中游離氨基酸含量進行檢測，主要對其鮮味氨基酸含量進行分析，結果見表1。

表1 9種食用菌中天冬氨酸、谷氨酸和總氨基酸質量比Tab.1 Mass ratio of aspartic acid, glutamic acid and total amino acid in 9 kinds of edible fungi mg/g

從表1中可以看出，9種食用菌中天冬氨酸質量比較大的為蟲草花(9.08 mg/g)、茶樹菇(2.58 mg/g)、猴頭菇(2.07 mg/g)，花菇的天冬氨酸最低，只有0.23 mg/g；谷氨酸質量比較大的為蟲草花(32.87 mg/g)、鹿茸菇(13.36 mg/g)、茶樹菇(11.23 mg/g)，杏鮑菇的谷氨酸質量比最低，只有4.13 mg/g。鹿茸菇的天冬氨酸含量在9種食用菌中較低，但是谷氨酸含量和總氨基酸含量僅次于蟲草花。

2.1.25′-核苷酸的檢測結果

以核苷酸標準溶液的質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，5種核苷酸的線性回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍見表2。

表2 5′-核苷酸線性回歸方程Tab.2 Linear regression equation of 5′-nucleotide

從表2中可以看出，5種5′-核苷酸的線性關系良好。根據(jù)保留時間對樣品進行定性，用所得的標準曲線計算樣品中各種核苷酸的含量，結果見表3。

食用菌中風味核苷酸包括5′-IMP、5′-GMP和5′-XMP，其中5′-GMP是最主要的風味核苷酸[12]。

表3 9種食用菌5′-核苷酸質量比Tab.3 5′-nucleotide mass ratio of 9 kinds of edible fungi mg/g

從表3中可以看出，9種食用菌的5′-GMP質量比較大的為蟲草花(1.05 mg/g)、杏鮑菇(0.87 mg/g)、牛肝菌(0.84 mg/g)；5′-IMP質量比較大的為姬松茸(0.98 mg/g)、杏鮑菇(0.89 mg/g)、香菇(0.73 mg/g)；而5′-XMP僅在花菇(0.46 mg/g)、香菇(0.54 mg/g)和姬松茸(0.28 mg/g)中檢測到。

2.1.39種食用菌電子舌主成分和雷達指紋圖譜分析

采用電子舌技術對不同品種的食用菌進行檢測，將檢測結果進行主成分分析，結果見圖1。

圖1 9種食用菌電子舌測定結果Fig.1 Results of 9 kinds of edible fungi by electronic tongue technology

從圖1(a)可以看出，不同種類食用菌的3次重復數(shù)據(jù)點可以清晰地聚成一個獨立的族群，說明PCA得到的實驗數(shù)據(jù)重復性很好。PC1和PC2兩個主成分的貢獻率分別為51.7%、28.5%，累積方差貢獻率為87.5%，說明前兩個主成分包含了較多的樣品信息，樣品的整體信息和食用菌樣品的差異可以被很好地反映。圖1(b)顯示測試樣品的所有味覺指標情況，并在圖形中可以看出樣品之間味道的關系。從圖1(b)可以看出，9種食用菌非揮發(fā)性呈味成分在5根味覺傳感器上的響應信號差異不大，推測9種食用菌在非揮發(fā)性呈味成分上可能具有相似性。

2.1.49種食用菌的鮮味強度分析

本研究通過電子舌與感官評價結合檢測9種食用菌的鮮味強度，并依據(jù)9種食用菌的鮮味氨基酸和核苷酸計算EUC值，結果見表4。

從表4中可以看出，電子舌檢測到的9種食用菌的鮮味強度從11.22(姬松茸)到13.53(鹿茸菇)，鹿茸菇鮮味響應強度最高，姬松茸鮮味強度最低。有報道稱香菇在食用菌中鮮味性最強[13]，這可能是與樣品的前處理方式有關。9種食用菌的感官評分從2.85(猴頭菇)到5.55(鹿茸菇)，鹿茸菇的感官評價結果與電子舌檢測結果都表明它的鮮味性最強，EUC值為160.56 g/100g，在9種食用菌中的EUC值較高，因此，選用鹿茸菇作為原料進行酶解提取工藝研究。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1水解酶的確定

由于酶的作用位點具有專一性，不同的酶具有不同的選擇性和酶切位點，因此單一的酶不能將食用菌中的蛋白質和核酸等大分子物質完全水解，需所有數(shù)值均表示為平均值±標準偏差(n=3)；上標不同表示同列數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

表4 基于電子舌、感官評價和EUC值的9種食用菌 的鮮味強度Tab.4 Umami intensity of 9 kinds of edible fungi based on electronic tongue, sensory evaluation and EUC value

要復合酶進行酶解，參考相關文獻用不同組合的酶對鹿茸菇進行酶解，以EUC值為指標，選擇最適合的復合酶進行下一步實驗。不同復合酶酶解變化見圖2。

圖2 不同酶對鮮味氨基酸、呈味核苷酸和EUC值的影響Fig.2 Effects of different enzymes on umami amino acids, flavor nucleotides and EUC value

從圖2可以看出，添加不同的復合酶進行酶解后，EUC值都明顯增高，其中添加纖維素酶和風味蛋白酶后EUC值最高，可能是因為纖維素酶和風味蛋白酶組合而成的復合酶，對細胞壁的降解作用更強，酶解得到更多的呈鮮氨基酸和呈味核苷酸。因此，選用纖維素酶和風味蛋白酶組合對鹿茸菇進行酶解提取。

2.2.2料液比的確定

圖3 料液比對鮮味氨基酸、呈味核苷酸和EUC值的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on umami amino acid, flavor nucleotides and EUC value

不同料液比對鹿茸菇酶解效果的影響如圖3。從圖3可以看出，當料液比(g/mL)在1∶40時，酶解液中EUC值最高，為252.07 g/100 g。在較低的底物濃度下，隨著底物濃度的升高，酶的催化能力提高；而底物濃度過高時，底物分子會阻礙底物與酶分子的結合，從而使酶的活力受到限制導致酶的水解度下降，因此料液比過高或過低時氨基酸含量均會下降。因此，選擇料液比為1∶40作為酶解優(yōu)化料液比。

2.2.3纖維素酶添加量的確定

纖維素酶添加量對鹿茸菇酶解效果的影響如圖4。從圖4可以看出，當纖維素酶的用量較少時，EUC值隨著纖維素酶的增加而增大，當酶添加量1 500 U/g時，EUC值達到一個相對穩(wěn)定的最大值，為265.10 g/100 g，此時所用的酶可以使鹿茸菇中的鮮味較佳。當酶添加量繼續(xù)增加時，EUC值降低，不再繼續(xù)增大，因此選擇1 500 U/g為優(yōu)化纖維素酶添加量。

圖4 纖維素酶添加量對鮮味氨基酸、呈味核苷酸 和EUC值的影響Fig.4 Effects of cellulase addition on umami amino acids, flavor nucleotides and EUC value

2.2.4風味蛋白酶添加量的確定

圖5 風味蛋白酶添加量對鮮味氨基酸、呈味核苷酸 和EUC值的影響Fig.5 Effects of flavor protease addition on umami amino acids, flavor nucleotides and EUC value

風味蛋白酶添加量對鹿茸菇酶解效果的影響如圖5。從圖5可以看出，EUC值隨著風味蛋白酶添加量的增加而增大，當風味蛋白酶添加量為3 000 U/g時，EUC值達到一個相對穩(wěn)定的最大值，為309.07 g/100g，此時所用的酶可以使鹿茸菇中的鮮味最佳。當酶添加量繼續(xù)増加時，EUC值降低，因此選擇3 000 U/g為優(yōu)化風味蛋白酶添加量。

2.2.5酶解時間的確定

酶解時間對鹿茸菇酶解效果的影響如圖6。從圖6可以看出，隨著酶解時間的増加，EUC值逐漸增大，當酶解時間為6 h時，EUC值最大為265.10 g/100g，而后隨著酶解時間的增加，EUC值下降，因此選擇6 h作為優(yōu)化酶解時間。

圖6 酶解時間對鮮味氨基酸、呈味核苷酸和EUC值的影響Fig.6 Effects of enzymolysis time on umami amino acids, flavor nucleotides and EUC value

2.2.6酶解pH值的確定

圖7 pH值對鮮味氨基酸、呈味核苷酸和EUC值的影響Fig.7 Effects of pH on umami amino acids, flavor nucleotides and EUC value

pH值對鹿茸菇酶解效果的影響如圖7。從圖7 可以看出，當pH值為7時，EUC值最大，pH值低于或高于7時，EUC值均降低。因此，選擇pH值為7作為優(yōu)化酶解pH值。

單因素實驗得到優(yōu)化酶解方案為料液比(g/mL)1∶40、纖維素酶添加量1 500 U/g、風味蛋白酶添加量3 000 U/g、酶解時間6 h、pH值7、酶解溫度50 ℃。

2.3 響應面試驗優(yōu)化結果

2.3.1模型的建立及顯著性檢驗

根據(jù)單因素實驗，選取料液比、纖維素酶添加量、風味蛋白酶添加量、酶解時間和pH值這5個影響因子，采用五因素三水平的響應面分析方法對酶解條件進行優(yōu)化，以鹿茸菇酶解液中EUC值為響應值，響應面設計及結果見表5、表6。

表5 響應面法因素與水平Tab.5 Factors and levels of response surface method

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表5 的數(shù)據(jù)進行分析，得到料液比、纖維素酶添加量、風味蛋白酶添加量、酶解時間和pH值與EUC值之間的二次回歸方程為：

2.3.2響應曲面分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程，通過考察響應曲面的形狀，更好地分析料液比、纖維素酶添加量、風味蛋白酶添加量、酶解時間和pH值對EUC值的影響，如圖8。

表6 響應面試驗結果Tab.6 Results of response surface test

表7 回歸模型方差分析Tab.7 Analysis of variance of regression model

圖8 響應面法分析結果Fig.8 Results analysis of response surface method

用Design-Expert 8.0.6軟件分析得到的鹿茸菇酶解液中EUC值的優(yōu)化工藝條件為料液比(g/mL)1∶44.78、纖維素酶添加量1 607.52 U/g、風味蛋白酶添加量3 044 U/g、酶解時間6.14 h、pH值6.50。為了檢驗響應面法的可行性，在此條件下進行3次平行實驗得到EUC值406.74 g/100 g，與預測值相對誤差為6.12%，預測值與實際值基本相符。因此，實驗所得的優(yōu)化工藝參數(shù)可靠。

3 結 論

本研究通過電子舌技術結合感官分析和化學分析法對9種食用菌進行鮮味強度評價，篩選出鮮味較強的食用菌，再采用不同酶制劑對其進行酶解，得到酶解效果較好復合酶，以EUC值為考察指標，通過響應面法優(yōu)化食用菌中鮮味氨基酸和核苷酸提取工藝。

1)通過高效液相色譜檢測9種食用菌的鮮味氨基酸和核苷酸含量，再結合電子舌和感官評價分析9種食用菌的鮮味，結果表明：鹿茸菇的感官評價值與電子舌檢測值最高，EUC值較高，為160.56 g/100 g，因此選用鹿茸菇作為原料進行酶解提取工藝研究。

2)選用纖維素酶和風味蛋白酶組合酶，以EUC值為考察指標，通過響應面法優(yōu)化鹿茸菇中鮮味氨基酸和核苷酸提取工藝，得到食用菌的優(yōu)化酶解條件為料液比(g/mL)1∶44.78，纖維素酶添加量1 607.52 U/g，風味蛋白酶添加量3 044 U/g，酶解時間6.14 h，pH值6.50，得到EUC值406.74 g/100 g，與預測值相對誤差為6.12%。