乳酸菌發(fā)酵紅茶飲料主要營(yíng)養(yǎng)成分變化

馮雪娜，李 嘯，2*，李建華，談亞麗，王慶宇，王帥靜

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 中國(guó)輕工業(yè)酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；3.安琪生物集團(tuán)有限公司，湖北 宜昌 443003）

乳酸菌是一類對(duì)人體健康有益的活性微生物，可以通過(guò)調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)功能和改善微生態(tài)平衡，達(dá)到提高宿主健康水平和健康狀態(tài)的作用[1-2]。它們可以直接作為食品添加劑使用，用來(lái)改善腸道營(yíng)養(yǎng)和維持腸道菌群的平衡[3-4]。茶是我國(guó)的傳統(tǒng)飲料，茶葉中含有茶多酚等許多生理活性物質(zhì)，賦予茶葉降血壓、降血脂、防輻射、抗衰老等功效[5-7]，是人們?nèi)粘Ｉ钪欣硐氲谋＝★嬈?。發(fā)酵茶飲料是指以茶水為主要基質(zhì)，利用微生物的代謝作用使茶水發(fā)生深度的生理生化反應(yīng)，從而使茶水的生化成分和外形發(fā)生改變[8-9]。這種通過(guò)微生物發(fā)酵制得的茶飲料不但可以保留茶葉本身的飲用價(jià)值，還可以帶入許多微生物代謝活性物質(zhì)，從而增加茶飲料的附加價(jià)值，豐富茶產(chǎn)品類型[10]。

目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有諸多利用益生菌發(fā)酵開發(fā)功能性茶飲料的報(bào)道，如CHO Y H等[11-12]開發(fā)的乳酸菌發(fā)酵飲料，具有蛋白質(zhì)、脂肪含量低，感官性狀良好等特性；劉佳奇等[12]利用植物乳桿菌發(fā)酵鐵觀音制得乳酸菌烏龍茶飲料，飲料成品口感醇厚，兼具茶香和乳香；陳萬(wàn)更[13]以枸杞、綠茶為原料，用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵菌株生產(chǎn)出了枸杞綠茶乳酸發(fā)酵飲料，但當(dāng)前研究主要集中在混菌發(fā)酵，也多以綠茶為發(fā)酵基質(zhì)，而針對(duì)乳酸菌單菌種發(fā)酵紅茶的工藝探索鮮見報(bào)道。因此，積極開發(fā)利用乳酸菌發(fā)酵紅茶飲料，將會(huì)為乳酸菌的利用和茶葉的深加工提供理論基礎(chǔ)，豐富乳酸菌飲料的品質(zhì)，促進(jìn)茶葉的綜合利用，推動(dòng)茶葉市場(chǎng)的發(fā)展。

該實(shí)驗(yàn)以紅茶浸提液為發(fā)酵基質(zhì)，接種植物乳桿菌種子液后進(jìn)行發(fā)酵，分析乳酸菌紅茶飲料發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)紅茶浸提液的pH值、酸度、氨基酸總量、茶多酚含量，以及采用分光光度法分析氨基酸種類的發(fā)酵前后的差異，并使用頂空固相微萃取法（head space solid phase microextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）結(jié)合較全面地分析比較紅茶發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分的差異，旨在為乳酸菌發(fā)酵紅茶飲料的研究奠定科學(xué)基礎(chǔ)，為后續(xù)的規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅茶葉：湖北五峰采花茶業(yè)科技園；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）B2：安琪酵母菌種保藏中心；蔗糖（食品級(jí)）：市售；酒石酸鉀鈉、硫酸亞鐵、茚三酮、谷氨酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

MRS液體培養(yǎng)基[14]：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，硫酸鎂0.1 g/L，醋酸鈉5.0 g/L，檸檬酸銨2.0g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L，硫酸錳0.05 g/L，吐溫-80 1.0 g/L。將pH調(diào)至6.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQZY-98CV振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；XCS-HJSG-3定制型恒溫?cái)嚢枞?lián)水浴鍋：陜西鑫昌實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；WG-0.25JDF脈動(dòng)真空滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-HeavyWax色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：安捷倫科技有限公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS（57328-U）萃取頭：美國(guó)Supelco公司；FE28 pH計(jì)、ME3002電子天平、AB104-N分析天平：梅特勒-托利多集團(tuán)；UV-2102C可見光分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及種子液制備

將保藏于甘油管的植物乳桿菌B2接入裝液量為20 mL/250mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中32℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，完成初次復(fù)壯。再將初次復(fù)壯后的菌液接入裝液量為45 mL/500 mL MRS液體培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中32 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h制成種子液，備用。

1.3.2 乳酸菌紅茶飲料的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

紅茶茶葉→浸提→過(guò)濾→濾液→調(diào)配（蔗糖）→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵→離心→上清液→無(wú)菌灌裝→成品

操作要點(diǎn)：將紅茶與蒸餾水比為8∶1 000（g∶mL）的混合液體置于85 ℃恒溫水浴鍋中浸提30 min后，用4層紗布濾去茶渣，然后向?yàn)V液中加入100 g/L的蔗糖，混勻后分裝至250 mL錐形瓶中，每瓶裝液量為150 mL。用透氣封口膜包扎后進(jìn)行高溫滅菌（121 ℃、20 min）。滅菌結(jié)束冷卻至室溫備用，即制成發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基中接入6%（V/V）植物乳桿菌B2的種子液。于36 ℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵5 d，每隔1 d取樣一次，將樣品5 000 r/min離心5 min制得上清液，用于相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)。直至pH值趨于平穩(wěn)，取樣結(jié)束。同時(shí)以未接種的原紅茶浸提液作為對(duì)照組。

1.3.3 測(cè)定方法

pH值：采用酸度計(jì)直接測(cè)定；蔗糖含量：參照文獻(xiàn)[15]采用生物傳感器測(cè)定；茶多酚含量：參照文獻(xiàn)[16]采用酒石酸亞鐵法測(cè)定；總酸（以乳酸計(jì)）：參照文獻(xiàn)[17]采用酸堿滴定法；游離氨基酸總量及組分：參照文獻(xiàn)[18]采用茚三酮比色法測(cè)定。

揮發(fā)性香氣成分含量的檢測(cè)方法：參照文獻(xiàn)[19]采用HS-SPME/GC-MS聯(lián)用法。

稱量樣品至頂空瓶中，用帶有硅橡膠墊的瓶蓋密封，放入旋轉(zhuǎn)振蕩器中，在水浴50℃中平衡30 min；用DVB/CAR/PDMS復(fù)合萃取頭插入樣品瓶頂空部分吸附30 min后；將吸附好的萃取頭取出快速插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，在250 ℃條件下解吸5 min。

氣相色譜條件：采用DB-Heavy WAX色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（He）（純度＞99.999%）；色譜柱升溫程序：起始柱溫40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min的速度升至200 ℃，再以10 ℃/min的速度升至250 ℃，保持3 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣方式：不分流。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃；掃描質(zhì)量范圍20～450 amu。

定性分析：使用Agilent Mass Hunter完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集和分析，并結(jié)合CAS號(hào)及配比度對(duì)化合物進(jìn)行定性。

定量分析：通過(guò)峰面積歸一化法，即計(jì)算出各組分峰面積占總峰面積的百分比就是各組分的相對(duì)含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019、Origin 9.0進(jìn)行處理及繪圖，采用SPSS（Version 17.0）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌紅茶飲料發(fā)酵過(guò)程中pH值、總酸、蔗糖含量的變化

由圖1可知，在乳酸菌紅茶飲料發(fā)酵過(guò)程中，pH值、總酸與蔗糖含量在前3天均發(fā)生了明顯的變化，之后趨于穩(wěn)定。其中pH值由4.97降至3.16；總酸由0.15 g/L升至2.38 g/L；蔗糖含量由0.90 g/L降至0.34 g/L。這可能與乳酸菌發(fā)酵利用蔗糖產(chǎn)生酸有關(guān)，導(dǎo)致總酸含量增加，pH值降低，蔗糖濃度減少。同時(shí)可知，乳酸菌發(fā)酵主要在前3 d完成，酸度增高，耗糖量大，代謝活動(dòng)旺盛；第3天后發(fā)酵過(guò)程逐步趨于平穩(wěn)，主要成分變化不明顯。

圖1 乳酸菌紅茶飲料發(fā)酵過(guò)程中總酸、pH值與蔗糖含量的變化趨勢(shì)Fig.1 Variation trend of total acid,pH and sucrose content during the fermentation of black tea beverage with lactic acid bacterium

2.2 發(fā)酵過(guò)程中茶多酚含量的變化

茶多酚是一類存在于茶葉中多種不同酚類及其衍生物的總稱，其含量的高低關(guān)乎茶葉品質(zhì)的好壞[20]。在發(fā)酵過(guò)程中茶多酚含量的變化如圖2所示，在發(fā)酵前期，茶多酚含量大量減少，后期減少的趨于平緩，總體上茶多酚含量由最初的15 100 mg/L減少至10 600 mg/L，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低有利于減少茶湯苦澀的口感，有益于茶葉品質(zhì)茶飲料風(fēng)味的提升。綜合茶多酚含量的變化可得，茶多酚含量減少幅度小，使發(fā)酵后茶湯的酚氨比有所降低，有助于形成茶湯鮮爽的口感，因此發(fā)酵后的茶湯更有豐富的營(yíng)養(yǎng)和新鮮的口感[21]。

圖2 乳酸菌紅茶飲料發(fā)酵過(guò)程中茶多酚的變化趨勢(shì)Fig.2 Variation trend of total tea polyphenols contents during the fermentation of black tea beverage with lactic acid bacterium

2.3 紅茶浸提液發(fā)酵前后游離氨基酸種類的變化

茶葉中氨基酸的組成成分與茶葉的風(fēng)味品質(zhì)、香氣及滋味的關(guān)系密切，氨基酸的種類、含量以及它們的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物或降解產(chǎn)物都直接或間接影響了茶葉的品質(zhì)，它們不僅是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是活性肽、酶和其他一些生物活性分子的重要組成成分[22]。因此，它們也是構(gòu)成茶葉品質(zhì)的重要成分之一。紅茶浸提液發(fā)酵前后游離氨基酸組分的變化差異見表1。

由表1可知，原茶湯中茶氨酸占游離氨基酸總量的78.2%，是茶葉中氨基酸的主要組成成分。在發(fā)酵過(guò)程中，茶氨酸含量大量降低，從0.718 g/100 g減少至0.367 g/100 g，降幅達(dá)48.88%，這與陳瑩玉[23]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；人體必需的9種氨基酸中只有賴氨酸和蛋氨酸的含量減少，其余7種必需氨基酸的含量均明顯增多；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸作為芳香族氨基酸在發(fā)酵后含量均有所提高，它們含量的增加為茶湯增強(qiáng)了甜味的口感，在茶滋味中起著重要地協(xié)調(diào)作用；天冬氨酸是構(gòu)成茶湯鮮爽滋味的重要成分，其含量由0.017 g/100 g增加至0.035 g/100 g。同時(shí)γ-氨基丁酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)[23]，參與多種神經(jīng)功能調(diào)節(jié)，是一類具有特殊生理活性的功能性物質(zhì)，其含量在發(fā)酵后增至0.017 g/100 g。由此得出，紅茶經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后營(yíng)養(yǎng)成分更加豐富，呈味物質(zhì)增多，有利于茶飲料風(fēng)味品質(zhì)的改善和保健作用的加強(qiáng)。

表1 紅茶浸提液發(fā)酵前后游離氨基酸組分的變化Table 1 Changes in free amino acid component in black tea extract before and after fermentation g/100 g

2.4 紅茶浸提液發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)差異

揮發(fā)性成分構(gòu)成了茶葉的香氣組成，因此鑒定茶葉中揮發(fā)性成分也是考察發(fā)酵型茶飲料品質(zhì)的重要因素之一[24]。使用HS-SPME/GC-MS法對(duì)茶湯發(fā)酵前與發(fā)酵結(jié)束時(shí)的揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定和對(duì)比。結(jié)果見表2。

表2 紅茶浸提液發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的含量及種類變化Table 2 Changes of contents and types of volatile components in black tea extract before and after fermentation

由表2可知，原茶湯主要的香氣組分是醇類和醛類，是相對(duì)含量最多的兩類化合物；而發(fā)酵后茶湯香氣的主要來(lái)源是醇類和酸類，分別占揮發(fā)性成分總量的54.85%和13.72%。醇類和酸類化合物在發(fā)酵后大量增加；而醛類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵后明顯地減少，可能是在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中發(fā)生了強(qiáng)烈的氧化作用，使得大量醛類物質(zhì)進(jìn)一步氧化成酸類物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了這些物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。

由表2可知，浸提液發(fā)酵前后香氣種類均為醇類、醛類、酮類、酯類、酸類、碳?xì)浠衔?、含氮化合物及其他物質(zhì)，其中以醇類為主要的香氣成分類型，占總量的40.10%～54.85%，說(shuō)明醇類化合物是賦予茶樣香氣的基礎(chǔ)。

紅茶浸提液在發(fā)酵前后香氣成分變化明顯，浸提液中共檢測(cè)出88種香氣物質(zhì)，主要的香氣成分類型為醇類、醛類和酮類，占香氣物質(zhì)總量的81.04%；發(fā)酵后共檢測(cè)出94種香氣物質(zhì)，主要的香氣成分類型為醇類、酸類和醛類，占香氣物質(zhì)總量的77.61%。發(fā)酵后較發(fā)酵前多6種香氣物質(zhì)，說(shuō)明發(fā)酵液中香氣成分更加豐富，在原有的紅茶風(fēng)味的基礎(chǔ)上增添了全新的發(fā)酵風(fēng)味，提高了茶湯整體香氣的層次感和濃郁感[25]。浸提液經(jīng)發(fā)酵后，醇類化合物、酸類化合物和含氮化合物均顯著增多，相對(duì)含量占比分別由浸提液中40.10%、3.71%、0.93%增加至54.85%、13.72%、5.46%，分別增加了14.75%、10.01%、4.53%，同時(shí)有8種醇類化合物、9種酸類化合物、6種含氮化合物生成。這些新物質(zhì)的生成是構(gòu)成發(fā)酵茶飲料獨(dú)特香氣的關(guān)鍵；醛類化合物種類及含量在發(fā)酵后顯著減少，相對(duì)含量占比從32.39%減少至9.04%，有14種醛類化合物在發(fā)酵后未被檢測(cè)到。酮類、酯類、碳?xì)浠衔锇l(fā)酵前后變化不明顯。

3 結(jié)論

紅茶經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后，茶多酚含量減少，氨基酸總量增加，蔗糖含量減少且pH值降低，酸度升高。這主要是由乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)利用蔗糖代謝產(chǎn)生有機(jī)酸所致，同時(shí)濕熱條件下也導(dǎo)致茶葉中茶多酚發(fā)生氧化使得茶多酚含量降低，因此，發(fā)酵后的紅茶飲料具有更低的酚氨比，利于降低茶本身的苦澀感，增強(qiáng)茶飲料的酸感和發(fā)酵風(fēng)味。

紅茶經(jīng)植物乳酸菌發(fā)酵后，三種芳香族氨基酸分別增加了43.16%、68.79%、83.18%；人體必需氨基酸中除賴氨酸和蛋氨酸含量減少外，其他7種必需氨基酸含量均有所提高；γ-氨基丁酸作為功能性氨基酸，含量從0.016 g/kg增加至0.165 g/kg。風(fēng)味品質(zhì)方面，醇類和醛類是浸提液的主要香氣物質(zhì)，分別占香氣物質(zhì)總量的40.10%、32.39%；發(fā)酵型茶飲料檢測(cè)出的香氣成分為94種，比浸提液多6種香氣物質(zhì)，新物質(zhì)以酸類、醇類和含氮化合物居多，而醛類物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程中大量減少，有14種醛類化合物在發(fā)酵后未被檢測(cè)到。發(fā)酵型茶飲料香氣成分更加豐富，在原浸提液的基礎(chǔ)上增添了乳酸菌發(fā)酵的風(fēng)味，融合出更協(xié)調(diào)細(xì)膩的味道，形成發(fā)酵型茶飲料的獨(dú)特風(fēng)味。