鐵皮石斛配制酒制備工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究

汪江波，蔣祥瑞，葉成玉，饒建軍，蔡鳳嬌，張瑞景，王鄭榮，何 超，徐 健*

（1.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院 發(fā)酵工程教育部重點實驗室 工業(yè)微生物湖北省重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；2.壹源堂健康科技（武漢）有限公司，湖北 武漢 430068；3.湖北畢圣泉酒業(yè)有限公司，湖北 黃岡 438700）

石斛作為傳統(tǒng)的中藥材，種類繁多，分布廣泛，具有抗氧化、增強免疫力、抗腫瘤、降血糖以及養(yǎng)陰生津等功效。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）被譽為石斛中的極品，2015年收錄于《中國藥典》，2018年被國家衛(wèi)健委列入藥食同源名單，有著“救命仙草”的美譽。研究結果表明，石斛多糖具有抗氧化[1]、降血糖[2]等有益作用；石斛多酚具有抗氧化[3]、抑制腸炎[4]功能；石斛總黃酮具有抗氧化、提高免疫力以及預防心腦血管疾病的作用[5]；石斛中的生物堿可清除氧化物質(zhì)以抑制氧化應激[6]，同時石斛堿還具有抗腫瘤作用[7]。

傳統(tǒng)的中草材提取方法包括煎煮法、浸提法、回流提取法等。煎煮法可不同程度提取中藥材中大部分功效成分，但不適用于非水溶性、熱敏性以及易揮發(fā)成分的提取[8]；浸提法依靠溶質(zhì)分子的擴散作用進行提取，該提取過程耗時長且效率低；回流提取法提取效率高，但提取過程中需要較高溫度，部分功效成分會在高溫下被破壞[9]。超聲破碎提取技術具有以下優(yōu)勢：提取溫度低，特別適用于熱敏物質(zhì)的提取，有效防止功效成分在高溫下被破壞；適用性廣，對功效成分的性質(zhì)無特殊要求，大部分中草藥功效成分的提取均可采用超聲破碎提取技術；功效成分浸出率高，提取時間短[10]。因此，本研究采用超聲波細胞破碎技術對鐵皮石斛中的功效成分進行提取。

氧化應激與糖尿病、心血管疾病、高血壓和阿爾茨海默癥等疾病有關[11-14]。持續(xù)和漸進的氧化損傷會對衰老和生理功能產(chǎn)生負面影響，并增加疾病的發(fā)病率[15]。目前，對石斛酒健康益處的認識仍然是基于對石斛的傳統(tǒng)認識，而不是試驗結果，石斛酒的抗氧化活性尚未得到很好的評價。

本試驗以鐵皮石斛中最重要的四種功效成分（石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮、石斛堿）含量的加權得分為評價指標，對鐵皮石斛配制酒的制備工藝進行優(yōu)化。根據(jù)自由基清除能力，對制備的鐵皮石斛配制酒（Dendrobium officinaleblended liquor，DBL）和鐵皮石斛配制酒提取物（Dendrobium officinaleblended liquor extract，DBLE）進行體外抗氧化活性評價，旨在為石斛功能性食品的保健功效提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小曲清香型白酒（40%vol、45%vol、50%vol、55%vol、60%vol）：勁牌有限公司；鐵皮石斛莖：安徽霍仙堂石斛開發(fā)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）diammonium salt，ABTS）、鐵氰化鉀：上海麥克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈、三乙胺（均為色譜純）：美國Fisher有限公司；蘆丁標準品（純度98.0%）：英國LGC公司；石斛堿標準品（純度98.0%）：上海源葉生物科技有限公司；無水葡萄糖、維生素C（vitamin C，VC）：國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸（純度99.0%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

XM-1200T超聲波細胞破碎儀：小美超聲儀器有限公司；EV201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；LGJ18-A真空冷凍干燥機：上海舜制儀器制造有限公司；VWR UV-1600PC紫外/可見分光光度計：美國VWR公司；UltiMate 3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石斛酒原液的制備

鐵皮石斛莖于50 ℃條件下干燥至含水量低于8%，粉碎過80目篩后置于密封袋中，4 ℃保存、備用。稱取一定量的鐵皮石斛粉于250 mL燒杯中，加入200 mL不同酒精度（40%vol、45%vol、50%vol、55%vol、60%vol）的小曲清香型白酒。使用超聲波細胞破碎儀處理，設置超聲功率（240 W、360 W、480 W、600 W、720 W、840 W），采用間歇式超聲，超聲5 s，間歇5 s。

將盛有鐵皮石斛粉和未超聲小曲清香型白酒的燒杯置于冰浴中，處理過程控制混合液溫度保持在40 ℃以下，使用食品級保鮮膜密封燒杯口，只留出一個可以放進超聲探頭的孔隙，以減少酒中低沸點微量成分的揮發(fā)。設置提取時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）。提取完畢后，待混合液恢復至室溫，在8 000 r/min條件下離心5 min，收集上清液放于4 ℃冰箱冷沉3 d，冷沉后的上清液即為石斛酒原液。對石斛酒原液中四種功效成分（多糖、多酚、總黃酮和生物堿）進行含量測定。以石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿的含量的加權得分為評價指標[16]，加權得分計算公式如下：

式中：W為加權得分，分；c1、c2、c3和c4（本次實驗條件下，測得的石斛酒原液中功效成分的含量）分別為石斛酒原液中的石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿的含量，mg/mL、μg/mL、μg/mL和μg/mL；A1、A2、A3和A4（在整個試驗周期中，測得的石斛酒原液中功效成分的最大含量，視為在石斛酒原液中的最大溶解量）分別為前期預試驗中測得石斛酒原液中的最大石斛多糖含量（27.18 mg/mL）、最大石斛多酚含量（490 μg/mL）、最大石斛總黃酮含量（274 μg/mL）和最大石斛堿含量（13 μg/mL）。

1.3.2 功效成分含量檢測方法

（1）石斛多糖的測定

參照2015版藥典[17]中的苯酚-硫酸法，以葡萄糖含量（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線并對石斛酒原液中的石斛多糖含量進行測定。得到葡萄糖標準曲線線性回歸方程為：Y=0.007 9X-0.006 3，相關系數(shù)R2=0.998 9，在質(zhì)量濃度10～80 μg/mL范圍線性相關性良好。

（2）石斛多酚的測定

參照雷竹[18]的方法并稍作修改，采用福林酚比色法，以沒食子酸含量（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線并對石斛酒原液中的石斛多酚含量進行測定。得到?jīng)]食子酸標準曲線線性回歸方程為：Y=0.008 9X+0.012 6，相關系數(shù)R2=0.999 2，在質(zhì)量濃度10～90 μg/mL范圍線性相關性良好。

（3）石斛總黃酮的測定

參照繆園欣等[19]的分光光度法并稍作修改以蘆丁含量（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線并對石斛酒原液中的石斛總黃酮含量進行測定。得到蘆丁標準曲線線性回歸方程為：Y=0.006 5X+0.004 9，相關系數(shù)R2=0.999 5，在質(zhì)量濃度40～140 μg/mL范圍線性相關性良好。

（4）石斛堿的測定

石斛堿的測定采用高效液相色譜法，HPLC分析條件：Prosphere C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流動相A：水（含0.000 5%三乙胺）和B：乙腈，50%A，50%B；流速：1.0 mL/min，檢測波長205 nm，樣品進樣量為20 μL。以石斛堿含量（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得到石斛堿標準曲線回歸方程為：Y=0.101 1X-0.001 6，相關系數(shù)R2=0.999 5，在質(zhì)量濃度0.5～20 μg/mL范圍線性相關性良好。

1.3.3 制備工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

分別以超聲時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h）、超聲功率（240 W、360 W、480 W、600 W、720 W、840 W）、石斛粉添加量（2g/100mL、5g/100mL、8g/100mL、10g/100mL、12 g/100 mL、15 g/100 mL）、酒精度（40%vol、45%vol、50%vol、55%vol、60%vol）為影響因素進行單因素試驗，研究各個因素對石斛酒原液中四種功效成分含量的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，固定鐵皮石斛粉添加量為10 g/100 mL，以超聲時間（A）、超聲功率（B）和酒精度（C）為影響因素，四種功效成分的加權得分（Y）為響應值，采用Design Expert 10.0進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設計。

1.3.4 DBL及DBLE的制備

為使制備的鐵皮石斛配制酒的澄清度和穩(wěn)定性更加接近于市售配制酒，對上述響應面優(yōu)化條件下得到的石斛酒原液，使用0.45 μm濾膜進行過濾處理，獲得鐵皮石斛配制酒（DBL）。DBL經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45 ℃濃縮，并采用真空冷凍干燥機進行干燥，最終獲得鐵皮石斛配制酒的功效成分提取物（DBLE）。

1.3.5 DBL感官品評及理化指標

對獲得的DBL進行感官品評并進行打分。感官品評方法參照安徽省國韻酒業(yè)有限公司食品安全企業(yè)標準Q/GYJ0001S—2020《配制酒（石斛酒）》進行打分[20]。品評人員為湖北工業(yè)大學釀酒中試基地的8名經(jīng)過專業(yè)培訓的品評員，包括5男3女。在收集品評人員的打分結果后，去掉一個最高分和一個最低分以降低試驗誤差，并將剩下的評分取平均值作為樣品的最終得分。DBL中的酒精度、總酸和總糖參照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定[21]，甲醇和雜醇油參照國標GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標準的分析方法》進行測定[22]。

1.3.6 DBL及DBLE體外抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定參照LUO A X等[23]的方法并稍作修改。將DBL倍半稀釋后的溶液或一定濃度范圍（50～2 000 μg/mL）的DBLE水溶液（0.6 mL）與0.1 mmol/L DPPH的甲醇溶液（1.8 mL）混合。溶液在室溫下保持30 min，然后測量波長517 nm處吸光度值，以維生素C為對照品。DPPH清除率計算公式如下：

式中：A0為DPPH無樣品吸光度值；As為在各種樣品存在下的DPPH吸光度值。

（2）ABTS自由基清除能力測定

ABTS自由基清除能力測定參照RE R等[24]的方法并稍作修改。ABTS用0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffersolution，PBS）溶解至7mmol/L。ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液體積比為1∶1反應生成ABTS自由基，使混合物在室溫下黑暗放置16 h。使用前，ABTS+溶液用0.01 mol/L，pH 7.4的PBS稀釋至734 nm處吸光度值為0.70±0.02。將DBL倍半稀釋后的溶液或一定濃度范圍（50～2 000 μg/mL）的DBLE水溶液（0.2 mL）與稀釋的ABTS+溶液（2.0 mL）混合。在室溫下保持20 min，然后測量734 nm的吸光度值，以維生素C為對照品。ABTS自由基清除率計算公式如下：

式中：A0為ABTS無樣品吸光度值；As為在各種樣品存在下的ABTS吸光度值。

（3）鐵氰化鉀還原力測定

鐵氰化鉀還原力測定參照BARROS L等[25]的方法并稍作修改。將DBL倍半稀釋后的溶液或一定濃度范圍（50～2 000 μg/mL）的DBLE水溶液（0.2 mL），與0.2 mol/L、pH 6.6的PBS（1.0 mL）和30 mmol/L的鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6）水溶液（1.0 mL）混合。將溶液在50 ℃水浴20 min，加入0.6 mol/L的三氯乙酸（CCl3COOH）（1.0 mL）。然后將每種溶液的1.0 mL轉(zhuǎn)移到新試管中，在新試管中加入1.0 mL去離子水和6 mmol/L的FeCl3（0.2 mL），充分混勻后在700 nm處測量吸光度值（A700nm），以維生素C為對照品。鐵還原抗氧化能力=As-A0，其中A0為無樣品時的吸光度值；As為樣品存在時的吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3次，結果用“平均值±標準差”表示。采用Origin 9.0制圖，Design-Expert 10.0軟件進行響應面試驗設計和結果分析，其他數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲提取時間對石斛配制酒原液中四種功效成分含量及加權得分的影響

該單因素試驗設為6個水平，超聲提取時間分別為0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h和4.0 h。設定超聲提取功率為600 W、石斛粉添加量為2%、酒精度為50%vol。由圖1A可知，隨著超聲時間的延長，石斛多糖含量增加；當超聲時間為2.0 h時，多糖已經(jīng)基本溶出，此時石斛多糖含量為6.42 mg/mL；超聲2.0 h后，溶解于酒液中的石斛多糖含量增速放緩，石斛總黃酮呈現(xiàn)類似的趨勢，而石斛堿的含量略有下降。石斛多酚含量的變化趨勢明顯不同，隨著超聲時間的延長，石斛多酚含量呈下降趨勢。這可能是因為超聲波對石斛多酚具有剪切作用，會破壞酚類物質(zhì)的結構[26]。由圖1B可知，四種功效成分的加權得分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最佳超聲提取時間為2.0 h。綜合石斛酒原液中四種功效成分含量及加權得分，選擇最佳超聲提取時間為2.0 h。

圖1 超聲提取時間對石斛配制酒原液中四種功效成分含量（A）和加權得分（B）的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on 4 functional components contents (A) and weighted score (B) of Dendrobium officinale blended original liquor

2.1.2 超聲功率對石斛配制酒原液中四種功效成分含量及加權得分的影響

該單因素試驗設為6個水平，超聲功率分別為240 W、360 W、480 W、600 W、720 W和840 W。設定超聲提取時間為2.0 h、石斛粉添加量為2%、酒精度為50%vol。由圖2A可知，隨著超聲功率的增大，酒液中的石斛多糖含量不斷增加，這是因為超聲對石斛粉破壁效果明顯，有利于胞內(nèi)多糖的溶出[27]。石斛多酚總體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在360 W達到最高值，這可能是因為超聲波功率過高，過強的空化效應會破壞多酚物質(zhì)的結構，導致提取量的持續(xù)降低[28]。石斛總黃酮含量變化相對穩(wěn)定，呈現(xiàn)先略微上升，后緩慢下降的趨勢；石斛堿含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在超聲功率為480 W時達到最大值。如圖2B所示，四種功效成分的加權得分先上升后下降，因此最佳超聲功率為480 W。綜合石斛酒原液中四種功效成分含量及加權得分，選擇最佳超聲功率為480 W。

圖2 超聲提取功率對石斛配制酒原液中四種功效成分含量（A)和加權得分（B）的影響Fig.2 Effect of ultrasonic extraction power on four functional components contents (A) and weighted score (B) of Dendrobium officinale blended original liquor

2.1.3 石斛粉添加量對石斛配制酒原液中四種功效成分含量及加權得分的影響

該單因素試驗設為6個水平，石斛粉添加量分別為2g/100mL、5g/100mL、8g/100mL、10g/100mL、12g/100mL和15 g/100 mL。設定超聲提取時間為2.0 h、超聲提取功率480 W、酒精度為50%vol。由圖3A可知，隨著石斛粉添加量的增大，酒液粘稠度增大，酒液對超聲波能量吸收增多導致鐵皮石斛粉末對超聲波能量吸收減小，從而造成細胞壁破碎不完全，多糖未能完全溶出[29]。因此，酒液中鐵皮石斛多糖含量先迅速增加后增加緩慢。石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿因為同樣的原因，呈現(xiàn)了類似的增長趨勢。由圖3B可知，隨著石斛粉添加量的增加，加權得分先明顯提高，后呈現(xiàn)較緩增長的趨勢，考慮到鐵皮石斛成本昂貴，且酒液粘稠度逐漸變大會加速超聲過程中溫度的上升，對后期石斛酒的生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響，故選取石斛粉添加量為10 g/100 mL，這也與中醫(yī)推薦的常用藥酒配方比例相吻合[30]。綜合石斛酒原液中四種功效成分含量及加權得分，選擇最佳石斛粉添加量為10 g/100 mL。

圖3 鐵皮石斛粉添加量對石斛配制酒原液中四種功效成分含量（A）和加權得分（B）的影響Fig.3 Effect of Dendrobium officinale powder addition on four functional components contents (A) and weighted score(B) of D.officinale blended original liquor

2.1.4 酒精度對石斛配制酒原液中四種功效成分含量及加權得分的影響

該單因素試驗設為5個水平，酒精度分別為40%vol、45%vol、50%vol、55%vol和60%vol。設定超聲提取時間為2.0 h、超聲提取功率480 W、石斛粉添加量為10 g/100 mL。由圖4A可知，酒液中石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿含量均呈現(xiàn)明顯的先上升后下降趨勢。根據(jù)相似相溶原理，隨著酒精度的提高，酒液的極性逐漸減小，酒精度為50%vol時，四種功效物質(zhì)的極性與酒液的極性相似，所以溶解性較好，含量均達到最大值。當酒精度過高時，會導致極性顯著降低，從而抑制功效物質(zhì)從石斛中溶出，且酒精度越高，成本越高。由圖4B可知，在酒精度40%vol～60%vol范圍內(nèi)，加權得分呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，最適的酒精度為50%vol。綜合石斛酒原液中四種功效成分含量及加權得分，選擇最佳酒精度為50%vol。

圖4 酒精度對石斛配制酒原液中四種功效成分含量（A）和加權得分（B）的影響Fig.4 Effect of alcohol content on four functional components contents (A) and weighted score (B) of Dendrobium officinale blended original liquor

2.2 響應面試驗結果與分析

在單因素試驗結果的基礎上，固定鐵皮石斛粉添加量為10 g/100 mL，以酒精度（A）、超聲時間（B）和超聲功率（C）為影響因素，四種功效成分的加權得分（Y）為響應值，采用Design Expert 10.0進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設計，對其制備工藝進行優(yōu)化。共包括17組試驗方案，Box-Behnken試驗方案及結果見表1。

由表1可知，不同組別試驗所得石斛酒原液中四種功效成分的加權得分與預測值基本一致，證明了本次試驗設計的合理性。利用Design-Expert 10.0軟件對試驗結果進行統(tǒng)計分析，對所建立的超聲制備工藝參數(shù)回歸模型進行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗，結果見表2。由表2可知，響應面模型F值為81.16，P值＜0.000 1，說明模型極顯著；失擬項P=0.988 0＞0.05，不顯著，表明該回歸模型合理且模型擬合度高，可以很好的反映出試驗真實值，因此該回歸方程可用于對試驗結果進行分析。由P值可以看出，一次項A、C，二次項A2、C2對結果影響極顯著（P＜0.001）；交互項AB、二次項B2對結果影響高度顯著（P＜0.01）；一次項B對結果影響顯著（P＜0.05）。三個因素對鐵皮石斛多糖、多酚、總黃酮和石斛堿的加權得分影響程度由高到低依次為酒精度＞超聲功率＞超聲時間。

表1 制備工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗設計結果Table 1 Results of Box-Behnken experiments design for preparation technology optimization

表2 回歸模型的方差分析結果Table 2 Variance analysis results of regression model

利用Design-Expert 10.0軟件進行分析可知，加權得分的二元擬合回歸方程為：Y=87.51+1.39A+0.54B+0.98C-1.02AB-0.55AC-0.11BC-4.83A2-1.22B2-2.13C2

各因素相互作用對石斛酒原液中四種功效成分加權得分的響應面與等高線見圖5。由圖5a可知，超聲時間和酒精度的兩因素交互作用對加權得分影響極顯著（P＜0.01）；由圖5b、圖5c可知，超聲功率和酒精度、超聲功率和超聲時間交互作用不顯著，這與方差分析結果一致。

圖5 各因素相互作用對石斛酒原液中四種功效成分加權得分影響的響應面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on the weighted scores of four functional components in Dendrobium officinale blended original liquor

根據(jù)回歸擬合方程可確定DBL的最佳制備工藝條件為：酒精度50.57%vol、超聲時間2.08 h、超聲功率505.36 W，加權得分預測值為87.7分?？紤]到實際情況，修正制備工藝條件為：酒精度51%vol、超聲時間2 h、超聲功率504 W。按照此工藝條件進行三次平行驗證試驗，所得石斛酒原液中，石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿的含量分別為22.15 mg/mL、432.4 μg/mL、218.8 μg/mL和12.8 μg/mL，經(jīng)過計算其加權得分實際值為87.8分。此外，在該工藝條件下制備的DBL中石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿的含量分別為20.71 mg/mL、391.8 μg/mL、205.9 μg/mL和11.5 μg/mL，經(jīng)過計算其加權得分為80.6分，石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿過膜損耗分別為6.5%、9.4%、5.9%和10.1%。DBL感官得分為81.4分，測得酒精度、總酸、總糖、甲醇和雜醇油含量分別為46.2%vol、1.1 g/L、21.6 g/L、0.009 7 g/100mL和0.088 g/100 mL。

2.3 DBL及DBLE體外抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定

由圖6可知，DBLE與DBL均具有對DPPH自由基的清除能力，且清除效果和溶液濃度呈正相關，但均低于VC。DBLE在質(zhì)量濃度50～2 000 μg/mL時，對DPPH自由基清除能力隨之逐漸增強，且DBLE在質(zhì)量濃度2 000 μg/mL時，對DPPH的清除率達到66.47%。DBL質(zhì)量濃度為2 477 μg/mL時，對DPPH自由基清除率達到70.55%，高于2 000 μg/mL時DBLE的DPPH自由基清除率；之后，隨著DBL稀釋倍數(shù)減小，對DPPH的清除率逐漸提高，這主要是因為DBL中抗氧化功效成分的濃度更高引起的。DBLE對DPPH自由基的IC50值為1 239 μg/mL，DBL對DPPH自由基的IC50值為944 μg/mL，DBLE的IC50值偏大可能是由于其在水溶液中的溶解性較差所導致的，但兩者的IC50值均小于10 mg/mL，說明DBLE具有較好的抗氧化效果。DBL在未稀釋的情況下，對DPPH自由基清除能力最強，達到84.15%。

圖6 DBLE（A）和DBL（B）對DPPH自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of DBLE (A) and DBL (B) to DPPH radicals

2.3.2 ABTS自由基清除能力測定

由圖7可知，DBLE、DBL均具有對ABTS自由基的清除能力，且清除效果和溶液濃度呈正相關。DBL對ABTS自由基的清除能力更加顯著，這可能是因為DBL中抗氧化功效成分的濃度更高引起的。DBLE質(zhì)量濃度在50～2 000 μg/mL之間時，ABTS自由基清除能力隨之逐漸增強，且DBLE質(zhì)量濃度在2 000 μg/mL時，對ABTS的清除率達到92.80%。DBLE對ABTS自由基的IC50值為642 μg/mL，而DBL對ABTS自由基的IC50為240 μg/mL，DBLE的IC50偏大可能是由于其在水溶液中的溶解性較差所導致的，但兩者的IC50值均小于10 mg/mL，說明DBLE具有較好的抗氧化效果。DBL在未稀釋的情況下，對ABTS自由基清除能力最強，達到94.05%。

圖7 DBLE（A）、DBL（B）對ABTS自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of DBLE (A) and DBL (B) to ABTS radicals

2.3.3 鐵氰化鉀還原能力測定

由圖8可知，DBLE、DBL均具有對鐵氰化鉀的還原能力（A700nm值），且還原能力和濃度呈正相關，兩者對鐵氰化鉀的還原能力（A700nm值）均低于VC，但是DBL對鐵氰化鉀的還原力更加顯著。DBLE質(zhì)量濃度在50～2 000 μg/mL時，對鐵氰化鉀的還原力隨之逐漸提高，且與濃度呈良好的線性關系。當DBL稀釋倍數(shù)為16倍，即酒體中提取物質(zhì)量濃度為1 238 μg/mL時，對鐵氰化鉀的還原能力（A700nm值）為0.178，高于高劑量2 000 μg/mL時DBLE的鐵氰化鉀還原能力；之后隨著DBL稀釋倍數(shù)減小，對鐵氰化鉀的還原力逐漸提高，這主要是因為DBL中抗氧化功效成分的濃度更高引起的。DBL在未稀釋的情況下，對鐵氰化鉀的還原力（A700nm值）最強，為1.367。

圖8 DBLE（A）、DBL（B）對鐵氰化鉀的還原能力Fig.8 Reducing ability of DBLE (A) and DBL (B) to potassium ferricyanide

3 結論

以鐵皮石斛為原料、小曲清香型白酒為酒基，四種功效成分（石斛多糖、石斛多酚、石斛總黃酮和石斛堿）含量的加權得分為指標，確定了超聲波破碎法制備DBL的最佳制備工藝參數(shù)為：超聲時間2.0 h，超聲功率504 W，石斛粉添加量為10 g/100 mL，酒精度為51%vol。體外抗氧化試驗結果表明DBL與DBLE均具有一定的抗氧化活性，且DBL體外抗氧化效果更加顯著，初步證明石斛酒是一種具有抗氧化功能的草本酒精飲品。該研究結果拓寬了人們對石斛酒健康益處的認識，為石斛酒新產(chǎn)品開發(fā)及后期組合勾兌提供了理論指導和數(shù)據(jù)支持，有利于推進石斛及石斛酒產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。