大果山楂發(fā)酵液改善高脂飲食小鼠肥胖指標(biāo)和腸道菌群多樣性

程天德，黃自通，葉秋瑩，游麗君，鐘 南

（1.清遠(yuǎn)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，廣東 清遠(yuǎn) 511510；2.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510642）

肥胖癥是全球最普遍的健康問題之一，是導(dǎo)致死亡的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[1]。肥胖與腸道菌群的結(jié)構(gòu)及功能變化有關(guān)，越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群在肥胖、肥胖相關(guān)炎癥和胰島素抵抗的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[2-3]，腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生[4]。益生菌發(fā)酵的功能食品可以通過改善腸道菌群紊亂進(jìn)而改善健康[5]，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosusGorbach-Goldin，LGG）是人類研究最廣泛的一種益生菌，具有平衡腸道菌群、改善腸道健康、增強(qiáng)腸粘膜屏障、預(yù)防和治療腹瀉、預(yù)防與促進(jìn)過敏恢復(fù)、預(yù)防齲齒等功效[6-7]。

大果山楂（Malus domeri（Bois）Chev.）是一種有著悠久歷史的藥食兩用水果，在世界各地均有種植[8]。研究表明，大果山楂提取物可以有效預(yù)防或治療Ⅱ型糖尿病[9]，能夠通過誘導(dǎo)腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）磷酸化來降低葡萄糖的產(chǎn)生和甘油三酯的合成[10]，可以作為抗糖尿病和抗高脂血癥植物營養(yǎng)素因子的候選來源[11]。大果山楂中的多酚類化合物含量豐富，具有抗氧化、抑制自由基和降低高脂血癥的效果[12-13]。山楂果膠多酚能顯著降低高脂小鼠的肝臟質(zhì)量、血清總膽固醇、肝臟甘油三酯、低密度脂蛋白和總脂質(zhì)水平[14-15]，可以作為膳食補(bǔ)充劑用于預(yù)防脂肪肝和氧化損傷，在開發(fā)功能性食品方面具有很大潛力[16-17]。越來越多的研究表明，天然產(chǎn)物發(fā)酵制品可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群改善肥胖及相關(guān)的代謝綜合癥[18-19]，但大果山楂發(fā)酵制品對腸道菌群的影響尚未見報(bào)道。大果山楂味道酸澀，不宜直接食用，益生菌發(fā)酵可有效改善大果山楂的澀味[20]。因此，本研究采用鼠李糖乳桿菌（LGG）發(fā)酵新鮮大果山楂所得的大果山楂發(fā)酵液來飼喂高脂小鼠，旨在探討其對高脂飲食小鼠肥胖指標(biāo)及腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂：采自廣東省連山縣某大果山楂種植基地。

小鼠：6周齡雄性C57BL/6小鼠體質(zhì)量（20±2 g），飼料由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。小鼠被置于控溫和光照條件下（25 ℃，光照-暗循環(huán)12 h）飼養(yǎng)，自由獲取食物和水。

沒食子酸、兒茶素等標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）：美國Sigma公司；表兒茶素、原花青素、咖啡酸、金絲桃苷、異槲皮苷、肉桂酸、綠原酸、根皮苷、熊果酸、齊墩果酸、山楂酸、科羅索酸等標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥98%）：上海純晶生化科技有限公司；戊巴比妥鈉（批號：F20190816）、抗凝劑EDTA-K2：國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和肝甘油三酯（triglyceride，TG）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號：20190718）：南京建成生物工程研究所；糞便脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）分離試劑盒：廣州IGE生物技術(shù)有限公司；MRS培養(yǎng)基、鼠李糖乳桿菌（LGG）CBS98073：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大果山楂20%、葡萄糖5%、蛋白胨2%、酵母膏1%，自然pH值，115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；LDZF-50L-III高壓滅菌鍋：上海申安有限公司；ZY-800發(fā)酵罐：上海紫裕生物科技有限公司；TGL-20M離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Waters1525高效液相色譜儀、二級陣列管檢測器、Waters2707自動(dòng)進(jìn)樣器、反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國Waters公司；Illumina Miseq測序儀PE2500：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 大果山楂發(fā)酵液制備的工藝流程及操作要點(diǎn)

大果山楂→洗凈→去核→打漿→調(diào)配→滅菌→接種→發(fā)酵→離心→滅菌→大果山楂發(fā)酵液

操作要點(diǎn)：將鼠李糖乳桿菌（LGG）CBS98073接入裝有MRS培養(yǎng)基的搖瓶中，于28 ℃培養(yǎng)7 d，然后按5×106CFU/mL接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，28 ℃、120 r/min發(fā)酵21 d。發(fā)酵結(jié)束后離心收集上清液于115 ℃滅菌20 min即得大果山楂發(fā)酵液，4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大果山楂發(fā)酵液中主要活性成分含量測定

參考溫玲蓉[21]的方法進(jìn)行測定，采用反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法鑒定大果山楂發(fā)酵液中的主要活性成分，根據(jù)保留時(shí)間確定化合物種類，并對其主要化合物進(jìn)行定量分析[22]。色譜條件如下：反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸（A），甲醇（B）；流速1.00 mL/min；檢測波長280 nm、340 nm、217 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為大果山楂發(fā)酵液中所含的化合物含量（mg/L）。

1.3.3 動(dòng)物試驗(yàn)

32只6周齡雄性小鼠被隨機(jī)分為4組（對照組（ND）、高脂飲食組（HFD）、低濃度大果山楂發(fā)酵液組（HFD+LFB）、高濃度大果山楂發(fā)酵液組（HFD+HFB）），每組8只。對照組（ND）和高脂飲食組（HFD）分別允許自由進(jìn)食正常飲食和高脂飼料，灌胃生理鹽水；低濃度大果山楂發(fā)酵液組（HFD+LFB）自由進(jìn)食高脂飼料，灌胃低濃度大果山楂發(fā)酵液；高濃度大果山楂發(fā)酵液組（HFD+HFB）自由進(jìn)食高脂飼料，灌胃高濃度大果山楂發(fā)酵液。處理12周后所有小鼠經(jīng)歷12 h禁食后測定體質(zhì)量，采用1%戊巴比妥鈉（50 mg/（kg·體質(zhì)量））對小鼠進(jìn)行深度麻醉后處死。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019-083）。小鼠飲食成分見表1。

表1 小鼠飲食成分Table 1 Dietary components of mice

1.3.4 肝臟指數(shù)和內(nèi)臟脂肪指數(shù)測定[23]

處死小鼠后，分離肝臟和內(nèi)臟脂肪并分別稱質(zhì)量，按下式計(jì)算肝臟指數(shù)與內(nèi)臟脂肪指數(shù)：

1.3.5 組織學(xué)分析

解剖小鼠后，取出肝臟浸于-80 ℃液氮中保存，在低溫條件下送往武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行油紅O（切片）染色。

1.3.6 生化分析

解剖小鼠后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取出全血，置于含抗凝劑EDTA-K2的小試管中。血樣于4 ℃、4 000 r/min離心10 min后取上清液，采用ELISA試劑盒測定血漿總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和肝甘油三酯（TG）。

1.3.7 腸道菌群分析

小鼠飼養(yǎng)12周后，采集糞便標(biāo)本進(jìn)行16S rRNA基因測序。首先利用糞便DNA分離試劑盒提取糞便DNA，然后用特異性引物對16S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物至相同的DNA濃度，使用Illumina Miseq測序儀PE2500進(jìn)行測序，基于相似度99%對所有樣品的全部non_chimeras序列聚類（聚類軟件為Qiime調(diào)用Uclust），將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），去除所有樣本中只出現(xiàn)一次的OTUs。利用GreenGene數(shù)據(jù)庫通過核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）Classifier（Version 2.2）對每個(gè)OTU進(jìn)行物種注釋confidence cutoff 0.8，同時(shí)基于各個(gè)樣本在不同分類水平上的物種組成及豐度信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 7.0版軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，多組間差異比較采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大果山楂發(fā)酵液中的主要活性成分

大果山楂發(fā)酵液中的主要活性成分含量見表2。由表2可知，大果山楂發(fā)酵液中主要含有多酚類（咖啡酸、肉桂酸、綠原酸）、黃酮類（表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素、木樨草素、根皮苷和根皮素-2'-木糖苷）和叁萜類（山楂酸、熊果酸、齊墩果酸和科羅索酸）化合物，其中多酚類和黃酮類物質(zhì)與腸道菌群調(diào)節(jié)、改善肥胖及其并發(fā)癥密切相關(guān)[24]。

表2 山楂發(fā)酵液中的主要活性成分含量Table 2 Content of main active components in fermented hawthorn broth

2.2 大果山楂發(fā)酵液對高脂飲食小鼠體質(zhì)量和脂肪積累量的影響

由圖1（A）可知，與ND組相比，HFD組小鼠體質(zhì)量增加極顯著（P＜0.01），說明高脂飲食導(dǎo)致了小鼠肥胖；與HFD組相比，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)下降，但HFD+LFB組小鼠體質(zhì)量下降不顯著（P＞0.05），HFD+HFB組小鼠體質(zhì)量下降顯著（P＜0.05），說明大果山楂發(fā)酵液可以抑制由高脂飲食導(dǎo)致的肥胖，且這種抑制作用與大果山楂發(fā)酵液的攝入量有關(guān)。

圖1 山楂發(fā)酵液對高脂飲食小鼠體質(zhì)量和脂肪積累量的影響Fig.1 Effects of fermented hawthorn broth on body mass and fat accumulation of high-fat diet mice

內(nèi)臟脂肪指數(shù)是反映動(dòng)物肥胖程度的重要指標(biāo)[25]，由圖1（B）可知，與ND組相比，HFD組小鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)增加極顯著（P＜0.01），說明高脂飲食會(huì)促進(jìn)脂肪在小鼠體內(nèi)堆積；與HFD組相比，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)均出現(xiàn)下降，但HFD+LFB組小鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)下降不顯著（P＞0.05），HFD+HFB組小鼠內(nèi)臟脂肪指數(shù)顯著下降（P＜0.05），說明大果山楂發(fā)酵液能抑制小鼠體內(nèi)脂肪的積累。

肝臟指數(shù)是反映動(dòng)物肝臟質(zhì)量隨體質(zhì)量變化的常用指標(biāo)[26]，由圖1（C）可知，各組小鼠的肝臟指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05），說明高脂飼料和大果山楂發(fā)酵液的攝入并未明顯促進(jìn)小鼠肝臟指數(shù)的改變，這與相關(guān)報(bào)道不一致[27]。

由圖1（D）可知，各組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)基本正常，與ND組相比，HFD組小鼠肝臟組織油紅O染色面積明顯增大，說明高脂飲食會(huì)導(dǎo)致小鼠肝臟脂肪數(shù)目增多；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠肝臟組織油紅O染色面積明顯減小，較為稀疏，說明大果山楂發(fā)酵液的攝入減緩了小鼠肝細(xì)胞中脂肪的堆積。

2.3 大果山楂發(fā)酵液對高脂飲食小鼠血脂含量的影響

由圖2可知，與ND組相比，HFD組小鼠出現(xiàn)高血脂癥狀，高密度脂蛋白（HDL）濃度顯著下降（P＜0.05）（圖2C），總膽固醇（TC）（圖2A）、肝甘油三酯（TG）（圖2B）和低密度脂蛋白（LDL）（圖2D）濃度均有不同程度的上升，其中TG濃度上升極顯著（P＜0.01），TC濃度上升顯著（P＜0.05），LDL濃度上升但不顯著（P＞0.05），說明高脂飲食小鼠肥胖模型比較成功。經(jīng)過大果山楂發(fā)酵液干預(yù)后，各組小鼠的高血脂癥狀均有不同程度的減輕，與HFD組相比，HDL濃度上升，TG、TC和LDL濃度均有不同程度的下降，由圖2（B）可以看出，HFD+HFB組的TG濃度相對HFD組顯著降低（P＜0.05），說明大果山楂發(fā)酵液可改善由高脂飲食造成的血脂升高現(xiàn)象。

圖2 山楂發(fā)酵液對高脂飲食小鼠血脂含量的影響Fig.2 Effect of fermented hawthorn broth on blood lipid content in high-fat diet mice

2.4 大果山楂發(fā)酵液對高脂飲食小鼠腸道菌群豐度和多樣性的影響

從各分類層級獲得注釋OTUs數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖3A）可以看出，與ND組比較，HFD組小鼠腸道菌群豐度明顯降低，差異極顯著（P＜0.01），說明高脂飲食會(huì)顯著降低小鼠腸道菌群的豐富度，這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[28]；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠腸道菌群豐度均有不同程度的上升，但HFD+LFB組上升不顯著（P＞0.05），HFD+HFB組上升極顯著（P＜0.01），說明大果山楂發(fā)酵液的干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)由高脂飲食導(dǎo)致的小鼠腸道菌群豐度降低，且這種效應(yīng)與大果山楂發(fā)酵液的攝入量呈正相關(guān)。Alpha多樣性分析可用于分析樣品內(nèi)群落的豐富度和均勻度，Chao1指數(shù)是Alpha多樣性分析中最常用的指標(biāo)之一，Chao1指數(shù)越大，說明樣品中的物種越豐富[29]，物種豐富度相同的情況下，菌落中各物種均勻度越大，菌落多樣性越大[30]。從圖3B可知，與ND組比較，HFD組的Chao1指數(shù)出現(xiàn)下降；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組的Chao1指數(shù)出現(xiàn)回升，而且HFD+HFB組與HFD組有顯著性差異（P＜0.05），說明高脂飲食會(huì)降低小鼠腸道菌群的豐富度和均勻度，大果山楂發(fā)酵液可逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，而且這種逆轉(zhuǎn)能力與大果山楂發(fā)酵液攝入量正相關(guān)。從各樣品對應(yīng)的物種注釋結(jié)果在門水平上的相對豐度柱形圖（圖3C）可以看出，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是小鼠腸道中的優(yōu)勢菌群，這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[31]。高脂飲食和大果山楂發(fā)酵液的干預(yù)改變了小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，與ND組比較，HFD組小鼠腸道Bacteroidetes（B）的相對豐度下降，F(xiàn)irmicutes（F）的相對豐度上升，F(xiàn)/B值上升；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠腸道Bacteroidetes的相對豐度上升，F(xiàn)irmicutes的相對豐度下降，F(xiàn)/B值降低，說明高脂飲食導(dǎo)致了小鼠腸道菌群失調(diào)，大果山楂發(fā)酵液可以調(diào)節(jié)高脂飲食導(dǎo)致的肥胖小鼠腸道菌群在門水平上的組成，且這種調(diào)節(jié)能力與大果山楂發(fā)酵液的攝入量正相關(guān)。

圖3 山楂發(fā)酵液對高脂飲食小鼠腸道菌群豐度和多樣性的影響Fig.3 Effects of fermented hawthorn broth on the abundance and diversity of intestinal flora in high-fat diet mice

2.5 大果山楂發(fā)酵液對高脂飲食小鼠腸道特定菌群的影響

進(jìn)一步分析了各組小鼠腸道菌群在屬和種水平上的差異菌，在屬水平上各組小鼠腸道菌群能夠注釋到的物種主要包括薩特菌（Sutterella）、Flexispira、普雷沃氏菌（Prevotella）、副擬桿菌（Parabacteroides）等，在種水平上各組小鼠腸道菌群能夠注釋到的物種主要包括隱藏梭菌（Clostridium celatum）、類腐敗梭菌（Clostridium paraputrificum）、高山姬鼠螺桿菌（Helicobacter apodemus）和產(chǎn)酸擬桿菌（Bacteroides acidifaciens）等。由圖4可知，與ND組相比，HFD組小鼠腸道的Sutterella、Flexispira、Clostridiumcelatum、Clostridium paraputrificum和Helicobacter apodemus相對豐度升高，Prevotella、Parabacteroides和Bacteroides acidifaciens的相對豐度降低；與HFD組比較，HFD+LFB組和HFD+HFB組小鼠腸道的Sutterella、Flexispira、Clostridium celatum、Clostridium paraputrificum和Helicobacter apodemus相對豐度降低，Prevotella、Parabacteroides和Bacteroides acidifaciens的相對豐度升高。高脂飲食改變了小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)，大果山楂發(fā)酵液干預(yù)增加了高脂飲食小鼠腸道菌群的豐度和多樣性，特別是與肥胖及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的菌群，其中Sutterella是短鏈脂肪酸的主要生產(chǎn)微生物，短鏈脂肪酸是結(jié)腸上皮細(xì)胞營養(yǎng)的主要來源，具有抗炎和調(diào)節(jié)腸道免疫等作用[32]，Parabacteroides具有改善炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）、非酒精性脂肪肝和肥胖的作用[33]，Prevotella可以通過影響腸道通透性來調(diào)節(jié)宿主機(jī)體免疫力[34]，腸道內(nèi)Bacteroides相對豐度升高可能通過介導(dǎo)炎癥效應(yīng)參與胰島素抵抗、肥胖等疾病的發(fā)生[35]，Bacteroides acidifaciens可能具有治療糖尿病和肥胖癥等代謝性疾病的潛力[36]。結(jié)合大果山楂發(fā)酵液中主要活性成分檢測結(jié)果和肥胖指標(biāo)檢測結(jié)果，推測大果山楂發(fā)酵液中的黃酮類、多酚類等化合物可能通過調(diào)節(jié)小鼠腸道中的上述菌群豐度抑制由高脂飲食導(dǎo)致的脂肪堆積，進(jìn)而改善血脂異常。

圖4 山楂發(fā)酵液對高脂飲食小鼠腸道特定菌群的影響Fig.4 Effects of fermented hawthorn broth on specific intestinal flora of high-fat diet mice

3 結(jié)論

通過研究大果山楂發(fā)酵液對高脂飲食誘導(dǎo)小鼠肥胖指標(biāo)及腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果表明，攝入大果山楂發(fā)酵液可以抑制小鼠體質(zhì)量的增加，促進(jìn)肥胖小鼠的脂肪積累量和血脂水平向正常化恢復(fù)，從而降低肥胖的風(fēng)險(xiǎn)；大果山楂發(fā)酵液還可以顯著提升高脂小鼠腸道菌群的豐度和多樣性，在門水平上提升高脂小鼠腸道擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度，降低厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度，從而降低F/B值，改善高脂小鼠腸道菌群失調(diào)；在屬和種水平上通過調(diào)節(jié)特定菌群（如Sutterella、Flexispira、Prevotella、Parabacteroides、Clostridium celatum、Clostridium paraputrificum、Helicobacter apodemus和Bacteroides acidifaciens等）的相對豐度使高脂小鼠的腸道菌群向正?；D(zhuǎn)變，調(diào)節(jié)腸道屏障，改善肥胖引起的代謝紊亂。因此，大果山楂發(fā)酵液在腸道菌群的調(diào)節(jié)中呈現(xiàn)良好的益生作用，可作為功能性食品成分預(yù)防腸道微生態(tài)失調(diào)，通過調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)減脂的目的。