雞體內(nèi)小腸液和模擬小腸液對(duì)飼料蛋白質(zhì)消化的比較研究

徐藹宣 于 耀 王鈺明 解競(jìng)靜 鄒 軼 譚會(huì)澤 黃艷玲 趙 峰*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610041；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；3.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，云浮527400)

在體外模擬雞對(duì)蛋白質(zhì)的消化試驗(yàn)中，模擬小腸液(simulated small intestinal fluid，SSIF)相對(duì)于體內(nèi)小腸液(endogenous small intestinal fluid，ESIF)的仿真程度對(duì)整個(gè)胃-小腸的仿生消化有著重要的影響。比較2種小腸液在體外對(duì)飼料消化后蛋白質(zhì)分子量分布的差異是檢驗(yàn)SSIF是否接近ESIF的重要基礎(chǔ)。在體外模擬蛋白質(zhì)的消化試驗(yàn)中，SSIF通常采用試劑級(jí)胰液素配制[1-3]，體外模擬消化的效果通過(guò)其氨基酸消化率與體內(nèi)法測(cè)值的接近程度或相關(guān)性判斷[1-4]。然而，僅從氨基酸消化率的差異仍難以說(shuō)明體外消化對(duì)蛋白質(zhì)的水解程度與體內(nèi)消化程度的相似性。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是分離、鑒定蛋白質(zhì)的通用方法[5]。在飼料蛋白質(zhì)、消化酶與植酸的互作[6]，瘤胃液對(duì)不同保護(hù)處理豆粕蛋白質(zhì)的降解[7]，酶菌復(fù)合處理對(duì)麩皮蛋白質(zhì)降解的影響[8]等研究中，SDS-PAGE可以清晰地分辨試驗(yàn)處理對(duì)蛋白質(zhì)分子量變化的影響。多個(gè)實(shí)驗(yàn)室間同時(shí)采用SDS-PAGE分析胃蛋白酶體外消化食品后產(chǎn)物的分子量分布，獲得測(cè)定結(jié)果的一致性最高達(dá)91%[9]。近年來(lái)，在體外模擬飼料或食品蛋白質(zhì)的消化中，消化液水解蛋白質(zhì)后的上清液采用凝膠電泳可以進(jìn)一步分析不同處理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)降解后的分子量大小分布，并可根據(jù)分子量鑒定蛋白質(zhì)片段的性質(zhì)[10-12]。因此，通過(guò)凝膠電泳鑒別體外模擬消化后未消化物中蛋白質(zhì)片段大小的相似性，可以用于比較模擬消化液與體內(nèi)消化液對(duì)蛋白質(zhì)水解特性的差異。為此，本試驗(yàn)采用雞ESIF和SSIF分別對(duì)5種常用蛋白質(zhì)飼料原料進(jìn)行仿生消化后，通過(guò)SDS-PAGE分析殘?jiān)械鞍踪|(zhì)片段分布的差異，以明確SSIF對(duì)ESIF水解蛋白質(zhì)程度的代表性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用兩樣本比較試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即小腸液設(shè)2個(gè)處理，分別為雞ESIF和SSIF。ESIF為在卵黃囊憩室附近安裝空腸套管的成年京星黃羽肉雞(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所育成品種)收集食糜后在4 ℃、1 250×g下離心10 min獲得的上清小腸液；SSIF是將成年京星黃羽肉雞的小腸液根據(jù)黨方坤[13]的方法純化消化酶蛋白質(zhì)，經(jīng)凍干成粉劑后，加入少量的胰蛋白酶(Amresco 0785)和糜蛋白酶(Amresco 0164)制備而成。按Dahlqvist[14]、Rick等[15-16]描述的方法分別測(cè)定淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，然后，根據(jù)與雞體內(nèi)空腸液消化酶的活性相等的原則，配制SSIF。ESIF和SSIF中淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性分別為401、26和14 U/mL。以豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉(由溫氏食品集團(tuán)股份有限公司提供)和酪蛋白(由甘肅華羚乳品股份有限公司提供)為蛋白質(zhì)飼料原料的代表性底物。在SDS-Ⅱ單胃動(dòng)物仿生消化系統(tǒng)(湖南中本智能科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))中以2種小腸液對(duì)每個(gè)飼料原料進(jìn)行仿生消化，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1根消化管。

1.2 飼料原料及其營(yíng)養(yǎng)水平

采集飼用豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉及食品級(jí)酪蛋白作為小腸液仿生消化的底物。按GB/T 6435—2014[17]測(cè)定樣品中水分含量并計(jì)算其干物質(zhì)含量，分別按GB/T 6432—2018[18]、GB/T 6433—2006[19]、GB/T 20806—2006[20]和NY/T 1459—2007[21]測(cè)定樣品中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量；飼料原料總能(GE)的測(cè)定根據(jù)ISO 9831∶19982[22]的方法進(jìn)行。5種飼料原料的營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼料原料的營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 雞小腸仿生消化

雞仿生消化過(guò)程參照Z(yǔ)hao等[23]的描述進(jìn)行。將1 g蛋白質(zhì)飼料原料裝入透析袋中，然后加入20 mL小腸液。在仿生消化系統(tǒng)中，溫度設(shè)置為41 ℃，小腸前段消化4 h，小腸后段消化4 h。其中小腸前段緩沖液為0.2 mol/L、pH為6.50的磷酸鹽溶液，小腸后段緩沖液為0.2 mol/L、pH為7.99的磷酸鹽溶液。消化結(jié)束后，將透析袋殘?jiān)D(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥后制備成樣品，裝入15 mL離心管中-20 ℃保存。

1.4 仿生消化殘?jiān)鞍踪|(zhì)SDS-PAGE分析

仿生消化殘?jiān)械鞍踪|(zhì)的提?。簠⒄崭凳绾甑萚24]的方法，從每個(gè)仿生消化的殘?jiān)鼧悠分腥?.2 mg加入5 mL 0.15 mol/L的生理鹽水，在室溫下回旋混合30 min后，以1 000×g離心10 min，取上清液再以2 700×g離心10 min，得到上清液，用于凝膠電泳。

SDS-PAGE分析：將160 μL蛋白質(zhì)提取液與40 μL SDS-PAGE Loading buffer(CWBIO，貨號(hào)：CW0027S)混合成200 μL，95 ℃金屬浴加熱裂解5 min，恢復(fù)至室溫后取30 μL注入膠孔。將凝膠(GenScript，4%～20% Mops分離膠)保持在110 mA的恒定電流下，直到buffer染料到達(dá)凝膠底部為止。使用考馬斯亮藍(lán)溶液完成蛋白質(zhì)染色。使用500 mL脫色液(50 mL甲醇+50 mL乙酸+400 mL蒸餾水)溶液脫色，然后使用GS-900 Calibrated Densitometer(Bio-Red Laboratories，Inc)圖像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像。通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白(BiostepTMPrestained Protain Marker,Tanon,180-6003)SDS-PAGE的結(jié)果進(jìn)行比較，即可獲得仿生消化殘?jiān)械鞍踪|(zhì)分子量的分布情況。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Quantity One 4.2軟件對(duì)小腸液消化的飼料殘?jiān)鞍踪|(zhì)提取液進(jìn)行SDS-PAGE后的蛋白質(zhì)分子量分布的相似性進(jìn)行比較(Dice相似性系數(shù))。使用Image Lab 5.2.1(Bio-Red Laboratories，Inc)軟件獲得不同分子量蛋白質(zhì)的占比，采用SAS 9.2的MEANS模塊計(jì)算基本統(tǒng)計(jì)量，t檢驗(yàn)?zāi)K對(duì)每一個(gè)飼料原料用2種小腸液消化后殘?jiān)鞍踪|(zhì)分子量分布的占比進(jìn)行兩樣本比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞ESIF和SSFI對(duì)飼料仿生消化殘?jiān)鞍踪|(zhì)片段的相似性比較

由圖1可知，在雞ESIF和SSIF淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性都一致的條件下，對(duì)豆粕消化殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)提取液通過(guò)SDS-PAGE后，蛋白質(zhì)片段均分布在132 ku以下，其中ESIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了10個(gè)條帶[5個(gè)重復(fù)相似性變異系數(shù)(CV)=6.92%]，SSIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了11個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=4.94%)，兩者的相似性為69.9%；棉籽粕消化殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)提取液通過(guò)SDS-PAGE后，蛋白質(zhì)片段均分布在190 ku以下，其中ESIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了8個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=7.72%)，SSIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了9個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=6.57%)，兩者的相似性為30.8%；菜籽粕消化殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)提取液通過(guò)SDS-PAGE后，蛋白質(zhì)片段均分布在126 ku以下，其中ESIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了10個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=4.84%)，SSIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了12個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=1.96%)，兩者的相似性為90.1%；玉米蛋白粉消化殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)提取液通過(guò)SDS-PAGE后，蛋白質(zhì)片段均分布在122 ku以下，其中ESIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了7個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=5.01%)，SSIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了8個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=4.03%)，兩者相似性為77.7%；酪蛋白消化殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)提取液通過(guò)SDS-PAGE后，蛋白質(zhì)片段均分布在118 ku以下，其中ESIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了9個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=10.91%)，SSIF的消化殘?jiān)灿?jì)分布了10個(gè)條帶(5個(gè)重復(fù)相似性CV=1.61%)，兩者的相似性為74.2%。

2.2 雞ESIF和SSFI對(duì)飼料仿生消化殘?jiān)鞍踪|(zhì)分子量分布的差異比較

由表2可知，在小腸液對(duì)飼料仿生消化后的殘?jiān)鞍踪|(zhì)提取液中，ESIF消化豆粕殘?jiān)蟹肿恿繛?1～22 ku、24～25 ku和63～74 ku的蛋白質(zhì)片段占比極顯著高于SSIF(P<0.01)，而為118～132 ku的蛋白質(zhì)片段占比極顯著低于SSIF(P<0.01)；ESIF消化棉籽粕殘?jiān)蟹肿恿繛?18～132 ku的蛋白質(zhì)片段占比極顯著低于SSIF(P<0.01)；ESIF消化菜籽粕殘?jiān)蟹肿恿繛?9～43 ku和63～74 ku的蛋白質(zhì)片段占比顯著或極顯著高于SSIF(P<0.05或P<0.01)，而為104～117 ku和118～132 ku的蛋白質(zhì)片段占比極顯著或顯著低于SSIF(P<0.01或P<0.05)；ESIF消化玉米蛋白粉殘?jiān)蟹肿恿繛?3～15 ku和24～25 ku的蛋白質(zhì)片段占比極顯著或顯著高于SSIF(P<0.01或P<0.05)；ESIF消化酪蛋白殘?jiān)蟹肿恿繛?3～15 ku和24～25 ku的蛋白質(zhì)片段占比顯著或極顯著高于SSIF(P<0.05或P<0.01)，而為17～20 ku、53～57 ku和84～94 ku的蛋白質(zhì)片段占比顯著或極顯著低于SSIF(P<0.05或P<0.01)。

3 討 論

3.1 利用SDS-PAGE分析小腸液對(duì)飼料消化后殘?jiān)械鞍踪|(zhì)片段分布的可行性

在比較雞SSIF與ESIF對(duì)飼料消化能力的差異上，傳統(tǒng)的方法是在體外模擬消化下比較兩者對(duì)同一個(gè)飼料樣品能量[25-27]或蛋白質(zhì)[28]水解率的差異。然而，飼料中的供能物質(zhì)或蛋白質(zhì)均是由不同組分的有機(jī)物組成，SSIF相對(duì)于ESIF消化能力的差異僅從對(duì)飼料養(yǎng)分的水解率來(lái)比較仍難以說(shuō)明水解后底物分子變化的差異。在飼料蛋白質(zhì)的消化中，分子量由大變小，通過(guò)SDS-PAGE可以較好地檢測(cè)蛋白質(zhì)分子量的分布情況。由于凝膠中十二烷基硫酸鈉使蛋白質(zhì)樣品帶上了大量的負(fù)電荷，從而掩蓋了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因此，通過(guò)SDS-PAGE可以使不同分子量的蛋白質(zhì)分離。Rosa-Sibakov等[11]、Duodu等[29]、Collier等[30]和Nurfaidah等[31]就利用SDS-PAGE鑒別生化反應(yīng)途徑中蛋白質(zhì)的釋放量、加工工藝對(duì)飼料蛋白質(zhì)變化的影響以及動(dòng)物糞便中不同分子量蛋白質(zhì)排泄量的變化。由此可見(jiàn)，在飼料蛋白質(zhì)的消化過(guò)程研究中，SDS-PAGE正成為鑒別不同大小蛋白質(zhì)的手段。在SDS-PAGE分離飼料來(lái)源的蛋白質(zhì)分子中，如何提取蛋白質(zhì)非常關(guān)鍵。從植物性飼料原料或食物中提取蛋白質(zhì)的處理因樣品的特性不同可能需要采用不同的方式，如Sousa等[12]從小麥麩、高粱、花生、木豆和乳清中提取蛋白質(zhì)的方法在溶劑的選擇、蛋白質(zhì)的沉淀等步驟上各不相同。本試驗(yàn)也曾采用Elkin等[32]的方法，對(duì)仿生消化殘?jiān)械牡鞍踪|(zhì)用緩沖液(0.012 5 mol/L硼酸鈉、1%十二烷基硫酸鈉、10 mmol/L苯甲基磺酰氟、2%β-巰基乙醇，pH=10)在室溫下震蕩提取2 h，再10 000×g離心20 min后取上清液。然而，SDS-PAGE染色后未出現(xiàn)任何蛋白質(zhì)條帶，而采用傅淑宏等[24]的方法以生理鹽水溶液提取仿生消化殘?jiān)鼊t能顯示蛋白質(zhì)條帶?？紤]到本試驗(yàn)比較2種小腸液對(duì)飼料樣品進(jìn)行消化后殘?jiān)械鞍踪|(zhì)片段的差異，雖然生理鹽水沒(méi)有提取殘?jiān)兴械牡鞍踪|(zhì)，但在相同的提取條件下，可以說(shuō)明2種小腸液對(duì)飼料消化后殘?jiān)腥芙庥谏睇}水的蛋白質(zhì)分子量大小的差異。

圖中第1條和第12條泳道為參照標(biāo)記(marker)，第2、3、4、5和6泳道為雞ESIF消化殘?jiān)?、8、9、10和11泳道為雞SSIF消化殘?jiān)?。圖1-1a、圖1-2a、圖1-3a、圖1-4a和圖1-5a分別為豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉和酪蛋白消化殘?jiān)鞍踪|(zhì)的電泳條帶。圖1-1b、圖1-2b、圖1-3b、圖1-4b和圖1-5b分別為豆粕、棉籽粕、菜籽粕、玉米蛋白粉和酪蛋白消化殘?jiān)鞍踪|(zhì)的電泳條帶通過(guò)Quantity One軟件進(jìn)行相似性分析。No.:條帶總數(shù)；Mw：分子量。

表2 雞ESIF和SSFI對(duì)飼料仿生消化殘?jiān)鞍踪|(zhì)分子量分布的差異比較

3.2 SSIF對(duì)ESIF的仿真程度

在動(dòng)物體內(nèi)消化中，小腸是飼料養(yǎng)分消化吸收的主要場(chǎng)所。目前，研究人員通常采用胰液素[33-34]或幾種單一消化酶試劑[23]混合后制備SSIF，而對(duì)SSIF與ESIF在酶學(xué)特性及消化能力的差異鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。Zhang等[35]采用從鴨空腸液提取消化酶制備SSIF，相對(duì)于鴨ESIF對(duì)玉米、小麥、豆粕和棉籽粕能量消化率的比值為96%～101%，其中2種腸液對(duì)棉籽粕的能量消化率相差稍大(比值為96%～98%)。任立芹[36]研究表明，采用淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶制備的SSIF對(duì)16個(gè)雞飼料樣品進(jìn)行胃-小腸2階段模擬消化后的氨基酸消化率比體內(nèi)消化率約低8.5%。而SSIF相對(duì)于ESIF對(duì)飼料水解后蛋白質(zhì)分子量變化的差異，尚顯見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究中，SSIF與ESIF對(duì)5個(gè)飼料樣品進(jìn)行水解后，豆粕、菜籽粕、玉米蛋白粉和酪蛋白消化殘?jiān)械鞍踪|(zhì)分子量分布的相似性為69.9%～90.1%，而棉籽粕殘?jiān)械鞍踪|(zhì)分子量分布的相似性僅為30.8%。這主要是由于ESIF水解飼料后殘?jiān)蟹肿恿肯鄬?duì)低的蛋白質(zhì)占比高，而SSIF水解殘?jiān)蟹肿恿肯鄬?duì)高的蛋白質(zhì)占比高，這一現(xiàn)象在棉籽粕中尤為明顯。上述結(jié)果表明，SSIF與ESIF對(duì)飼料蛋白質(zhì)水解后分子量分布的差異可能遠(yuǎn)大于仿生消化法測(cè)定蛋白質(zhì)消化率的差異。ESIF水解飼料后殘?jiān)牡鞍踪|(zhì)分子量比SSIF更低，且對(duì)不同的飼料原料表現(xiàn)的差異不一致，這也部分說(shuō)明了Zhang等[35]的試驗(yàn)中SSIF與ESIF在棉籽粕的消化率上差異大于其他飼料，以及任立芹[36]的試驗(yàn)中模擬消化測(cè)定的雞飼料氨基酸消化率低于體內(nèi)法測(cè)值。在本研究的關(guān)聯(lián)試驗(yàn)中，雖然SSIF與ESIF在消化液蛋白質(zhì)的分子量分布相似性高，對(duì)玉米淀粉和小麥淀粉中淀粉水解動(dòng)力學(xué)及大豆?jié)饪s蛋白和酪蛋白的蛋白質(zhì)水解動(dòng)力學(xué)也比較接近，但對(duì)飼料粗蛋白質(zhì)的消化率的差異仍因飼料不同而異(豆粕，3.87%；棉籽粕，3.35%；菜籽粕，-0.32%；玉米蛋白粉，-0.70%；酪蛋白，-1.01%)，且消化率的差異程度與本試驗(yàn)中消化殘?jiān)鞍踪|(zhì)分子量分布的相似性高低相對(duì)應(yīng)，但粗蛋白質(zhì)消化率的差異程度遠(yuǎn)低于消化殘?jiān)鞍踪|(zhì)分子量分布的相似性。這也表明制備SSIF的消化酶來(lái)源及酶學(xué)特性與ESIF的細(xì)微差異可能會(huì)引起蛋白質(zhì)水解程度較大的差異。

4 結(jié) 論

ESIF與SSIF水解飼料后殘?jiān)械鞍踪|(zhì)分子量分布的相似性因飼料來(lái)源的不同而呈現(xiàn)較大的差異。ESIF水解飼料后殘?jiān)蟹肿恿肯鄬?duì)低的蛋白質(zhì)占比高，而SSIF水解殘?jiān)蟹肿恿肯鄬?duì)高的蛋白質(zhì)占比高。