德州驢盲結(jié)腸食糜液中纖維降解酶活性與揮發(fā)性脂肪酸含量的比較分析

張振威 周 倩 鄭 芮 王永輝 朱明霞 王長(zhǎng)法

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)研究院，聊城252000)

德州驢是中國(guó)大型驢品種，身材高大，結(jié)構(gòu)緊湊，肌肉發(fā)達(dá)，皮重性能好，具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)和抗病力高的特點(diǎn)[1]。驢具有特殊且發(fā)達(dá)的盲結(jié)腸結(jié)構(gòu)，棲息著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，能夠發(fā)酵降解飼料纖維生成揮發(fā)酸脂肪酸(VFA)而被機(jī)體吸收利用[2]。有研究表明，馬屬動(dòng)物的盲結(jié)腸微生物能夠供給宿主機(jī)體60%～70%的能量[3]。驢機(jī)體本身不能夠降解飼料纖維，而是依靠驢盲腸和結(jié)腸微生物分泌的一系列纖維素酶與半纖維素酶來(lái)消化利用飼料纖維[4]。

驢養(yǎng)殖業(yè)中使用較多的纖維粗飼料主要包括玉米秸稈、小麥秸稈、稻秸、花生秧和小麥糠等低質(zhì)高纖維含量的農(nóng)作物秸稈及副產(chǎn)品。上述粗飼料的細(xì)胞壁則主要由纖維素(40%～50%)、半纖維素(30%～35%)、木質(zhì)素和果膠等構(gòu)成[5]。驢盲結(jié)腸微生物對(duì)于飼料細(xì)胞壁的降解需要多種纖維素酶和半纖維素酶的協(xié)同參與[6-7]。其中，內(nèi)切(羧甲基)纖維素酶、外切(微晶)纖維素酶及β-葡萄糖苷酶是驢盲結(jié)腸中水解飼料細(xì)胞壁纖維素主鏈的降解酶[8]，木聚糖酶(xylanase, XYL)則是降解飼料細(xì)胞壁半纖維素結(jié)構(gòu)的主要水解酶。羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase, CMAase)是一類可以隨機(jī)切斷纖維素多糖鏈非結(jié)晶區(qū)(β-1，4糖苷鍵)的內(nèi)切纖維素酶[9]。微晶纖維素酶(avicelase, AVI)作用于纖維素多糖鏈的非還原末端，釋放纖維二糖[9]。β-葡萄糖苷酶能夠切開(kāi)纖維二糖的β-1，4糖苷鍵，進(jìn)而從纖維二糖和短的纖維寡糖鏈中釋放葡萄糖[9]。XYL負(fù)責(zé)將木聚糖分解為木二糖和低聚木糖，反映盲結(jié)腸微生物降解飼料半纖維素的能力[9]。此外，驢盲結(jié)腸微生物可能與反芻動(dòng)物瘤胃微生物相似，還能夠分泌木質(zhì)素降解酯酶[阿魏酸酯酶(ferulic acid esterase, FAE)、乙酰脂酶(acetyl esterase, AE)和對(duì)香豆酸酯酶]來(lái)催化水解飼料細(xì)胞壁的半纖維素與木質(zhì)素分子間的酯鍵連接，消除阻礙纖維素和半纖維素分子降解的致密網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)[10-11]。

目前，相關(guān)驢盲結(jié)腸微生物的纖維降解酶與半纖維素酶活性的研究報(bào)道很少。梁婷玉[12]測(cè)定了關(guān)中驢盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)容物的XYL活性達(dá)0.86～2.50 U/mL。劉利林[9]則測(cè)定了新疆驢盲腸液的CMAase和XYL活性，分別為0.21和0.46 U/mL。此外，有關(guān)驢盲結(jié)腸食糜液FAE、AE活性的研究更未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采集德州驢的盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液，比較分析其纖維素酶、半纖維素酶以及木質(zhì)素降解酯酶(FAE、AE)活性及VFA含量，以期為深入開(kāi)展驢內(nèi)源性纖維素酶學(xué)特性及其降解飼料細(xì)胞壁的作用機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步提高驢機(jī)體對(duì)纖維粗飼料的能量利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取24月齡左右、體重[(242±20) kg]相近的健康德州驢9頭，對(duì)比分析德州驢的盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中纖維素酶活性及VFA的生成。

1.2 飼養(yǎng)管理與試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)德州驢均散欄飼養(yǎng)，每天飼喂2次，飼喂時(shí)間分別為07:00和18:00，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼養(yǎng)周期60 d，德州驢自由采食、飲水與運(yùn)動(dòng)。試驗(yàn)期間驢只體重與采食量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

1.3 樣品采集

待9頭德州驢屠宰后，立即無(wú)菌操作采集德州驢的盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜，使用4層滅菌紗布過(guò)濾后得到液相樣品，分裝至滅菌的10 mL離心管，置于-20 ℃保存。

1.4 pH及纖維素酶活性的測(cè)定[13]

pH：采集德州驢的盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液后，使用pH計(jì)((Model BPP-7800，貝爾分析儀器有限公司)迅速測(cè)定其pH，并記錄。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

FAE活性：以阿魏酸甲酯為底物，使用分光光度計(jì)在340 nm檢測(cè)阿魏酸甲酯和阿魏酸的吸光值，根據(jù)二者消光系數(shù)差異計(jì)算FAE活性。

AE活性：以4-硝基苯乙酯為底物，使用分光光度計(jì)在415 nm檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物4-硝基酚的吸光值，根據(jù)4-硝基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，計(jì)算AE活性。

CMAase活性：以羧甲基纖維素為底物，使用分光光度計(jì)在540 nm檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖的吸光值，根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，計(jì)算CMAase活性。

AVI活性：以微晶纖維素溶液為底物，使用分光光度計(jì)在540 nm檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物葡萄糖的吸光值，根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算AVI活性。

XYL活性：以木聚糖為底物，使用分光光度計(jì)在540 nm檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物木糖的吸光值，根據(jù)木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，計(jì)算XYL活性。

圖1 4-硝基酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 VFA含量測(cè)定

取1 mL驢盲結(jié)腸食糜液，加入300 μL偏磷酸(25%)，充分混合后，置于10 000×g離心10 min。取上清液使用氣相色譜儀測(cè)定驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中VFA含量，計(jì)算乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸摩爾比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用SAS 9.4的一般線性模型(GLM)程序，通過(guò)方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用最小二乘法Lsmeans計(jì)算和校正標(biāo)準(zhǔn)誤差平均值(SEM)。所有測(cè)定指標(biāo)的平均值之間采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較分析。P<0.05代表差異顯著；0.05

2 結(jié) 果

2.1 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中纖維素酶活性

表2可知，驢背結(jié)腸食糜液中CMCase、AVI、Xylase和AE的活性均顯著高于驢盲腸和腹結(jié)腸(P<0.05)，但驢盲腸和腹結(jié)腸食糜液中纖維素酶活之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。此外，驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中FAE活性無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中VFA含量

由表3可知，德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中pH和總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)含量均無(wú)顯著差異(P>0.05)。驢盲結(jié)腸的VFA發(fā)酵模式存在差異：乙酸摩爾比例在盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中依次顯著增加(P<0.05)，而丙酸和丁酸摩爾比例在盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中依次顯著降低(P<0.05)，乙酸/丙酸在驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中依次顯著增加(P<0.05)。此外，驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中支鏈VFA(包括異丁酸和異戊酸)摩爾比例依次顯著增加(P<0.05)。

3 討 論

3.1 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中纖維素酶活性

驢是典型的單胃食草動(dòng)物，屬后腸發(fā)酵類型。后消化道主要包括盲腸和結(jié)腸，棲息著數(shù)量龐大、種類繁多的微生物，類似于反芻動(dòng)物瘤胃，對(duì)飼料纖維的降解利用具有重要作用。驢對(duì)飼料纖維具有較高的降解利用效率，驢對(duì)苜蓿干草和燕麥干草的中性洗滌纖維消化率高達(dá)2%～10%[14]。而且驢對(duì)低質(zhì)纖維粗飼料的消化率甚至與Bedouin黑山羊相當(dāng)。這歸根結(jié)底是由于驢胃腸道中較高的微生物活性，其中，驢盲結(jié)腸微生物分泌的纖維素酶可能在飼料纖維的降解消化過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。Glinsky等[3]指出，馬屬動(dòng)物后腸道微生物能夠降解羊草纖維素和半纖維素而釋放可溶性糖。驢機(jī)體本身并不能直接降解飼料纖維，而是依靠盲結(jié)腸微生物分泌的一系列纖維素酶來(lái)發(fā)揮作用。Miyaji等[15]研究發(fā)現(xiàn)，盲結(jié)腸對(duì)于干草飼料中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的消化率占全消化道飼料纖維消化率的90%，盲結(jié)腸微生物具有較高的CMAase和XYL活性。

表2 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中纖維素酶活性

表3 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中VFA含量

本研究明確了驢盲結(jié)腸微生物能夠分泌一系列的纖維素酶。其中，CMAase和AVI是驢盲結(jié)腸中水解飼料細(xì)胞壁纖維素主鏈的降解酶[8]，反映微生物降解飼料纖維的能力。XYL則是降解飼料細(xì)胞壁半纖維素結(jié)構(gòu)的主要水解酶，主要反映盲結(jié)腸微生物降解飼料半纖維素的能力[16]。FAE與AE協(xié)同作用能夠切斷飼料細(xì)胞壁內(nèi)的半纖維素與木質(zhì)素分子間的酯鍵連接，打破纖維分子間的網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)飼料纖維與酶之間的結(jié)合，增加飼料纖維的降解利用[10-11]。驢結(jié)腸食糜液中CMAase、AVI、XYL和AE的活性均高于驢盲腸，表明驢的結(jié)腸可能在飼料纖維的降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這可能是由于飼料物質(zhì)隨著在驢胃腸道中的后移，容易降解的可溶性淀粉、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在小腸降解，而飼料纖維的含量在盲腸和結(jié)腸中不斷增加，促進(jìn)了纖維降解菌的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而使得驢結(jié)腸成為飼料纖維的主要降解場(chǎng)所。

目前有關(guān)驢盲結(jié)腸食糜的纖維酶活性報(bào)道資料有限。梁玉婷[12]測(cè)定了關(guān)中驢盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)容物的XYL活性高達(dá)0.86～2.50 U/mL，而CMAase和AVI的活性較低[12]。劉利林[9]測(cè)定了新疆驢盲腸液的CMAase和XYL活性分別為0.21和0.46 U/mL。本研究中，驢的盲結(jié)腸食糜液中CMAase活性達(dá)0.12～0.42 U/mL；AVI活性達(dá)0.13～0.23 U/mL；XYL活性達(dá)2.27～6.82 U/mL，均與上述研究報(bào)道相似。此外，本研究測(cè)定了驢盲結(jié)腸食糜液中木質(zhì)素降解酯酶活性。其中，F(xiàn)AE活性高達(dá)4.2～4.8 mU/mL，高于荷斯坦公牛瘤胃液的FAE活性(3.7 mU/mL)[17]。

3.2 德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中VFA含量

飼料纖維經(jīng)驢盲結(jié)腸微生物的纖維素酶水解后可產(chǎn)生VFA，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和支鏈VFA。本研究中，驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中TVFA含量達(dá)96～110 mmol/L。Glinsky等[3]研究表明，馬屬動(dòng)物機(jī)體盲腸代謝生成的VFA能夠?yàn)闄C(jī)體供應(yīng)30%的能量。此外，結(jié)腸微生物代謝生成的VFA也可以為機(jī)體提供大量能量[18]。

乙酸摩爾比例在驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中依次顯著增加，與之相對(duì)應(yīng)，驢背結(jié)腸食糜液中CMCase、AVI、Xlyase和AE活性均高于盲結(jié)和腹結(jié)腸。這表明驢背結(jié)腸與盲腸相比具有更高的纖維降解活性，能夠降解飼料纖維生成更多的乙酸。與之相反，驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中丙酸摩爾比例依次顯著降低，說(shuō)明驢盲腸可能會(huì)降解相對(duì)較多的精飼料而生成丙酸。此外，BCVFA是纖維分解菌的生長(zhǎng)因子，在低質(zhì)飼糧中添加支鏈VFA能夠增加纖維分解菌的數(shù)量，提高微生物對(duì)飼料纖維的降解能力[19]。驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中支鏈VFA(包括異丁酸、異戊酸和戊酸)逐漸顯著增加，這進(jìn)一步表明，德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸微生物的纖維降解活性逐漸升高。驢結(jié)腸食糜液與盲腸相比，具有更高的纖維降解活性，這可能是由于盲腸和結(jié)腸食糜液中微生物群落組成不同造成的。梁玉婷[12]測(cè)定了驢盲腸和結(jié)腸的微生物群落組成，結(jié)果指出，驢盲腸液的厚壁菌門占比達(dá)39.7%，而結(jié)腸食糜液中厚壁菌門占比高達(dá)48.7%。厚壁菌門主要負(fù)責(zé)降解飼料纖維物質(zhì)，驢結(jié)腸食糜液比盲腸具有更高含量的厚壁菌門進(jìn)一步印證了我們的試驗(yàn)結(jié)果。

4 結(jié) 論

德州驢背結(jié)腸食糜液中CMAase、AVI、XYL和AE活性均高于腹結(jié)腸和盲腸。與之相對(duì)應(yīng)，乙酸和支鏈VAF的摩爾比例在德州驢盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中逐漸顯著增加，丙酸摩爾比例則依次在盲腸、腹結(jié)腸和背結(jié)腸食糜液中逐漸降低。此外，本研究明確了德州驢盲結(jié)腸具有較高的FAE和AE活性。