草莓根腐病病原真菌Ilyonectria novozelandica的鑒定

史芳芳 褚繼萍

（新疆生產建設兵團第十二師農業(yè)科學研究所，新疆烏魯木齊 830088）

近年來，我國草莓的種植面積不斷擴大，草莓病害造成的危害也逐年加重（陳道 等，2021），其中根部病害最為嚴重，造成巨大經濟損失，成為草莓產業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。草莓根腐?。╯trawberry root rot）是草莓根部重要病害之一（趙秀娟 等，2006），在世界草莓主產區(qū)均有發(fā)生，主要由土傳病原真菌引起，草莓發(fā)病后植株矮小，最后全株萎蔫枯死，嚴重時可造成整個草莓生產園區(qū)毀滅。因此準確鑒定引起草莓根腐病的病原菌，對該病害的防治及抗病育種工作具有重要意義。

草莓根腐病是由多種病原物和環(huán)境相互作用引起的一大類病害的總稱。常見的病原菌：引起草莓黑根腐病的主要有、sp、sp（Minegish，1989；Paulus，1990）、sp（徐淑華等，2004）；引起草莓紅心（中柱）根腐病的主要有、P.E.Nelson et K.Wilhelm；引起草莓白根腐病的主要有Prill、（裘維蕃，2001；Zveibil &Freeman，2005）；引起草莓鞋帶冠根腐病的主要有（Vahl ex Fr.）Kummer（Fox，2003）等。

土赤殼屬真菌廣泛分布在木本和草本植物的根內以及土壤中（Chaverri et al.，2011），屬于腐生真菌或弱寄生真菌。該屬大多數種類為植物病原菌，可引起植物根腐病和黑腐病等。土赤殼屬的模式種是，目前，該屬已知26 個種，包括從復合群中分出的14 個新種（Chaverri et al.，2011；Cabral et al.，2012a，2012b；Zeng &Zhuang，2013）。我國僅報道4 個種（Zhuang，2013；王玉君 等，2015），分別為、、、，都是從健康植株中分離得到的內生菌，目前沒有從發(fā)病植株分離到土赤殼屬的致病菌。

查閱相關文獻發(fā)現前人對草莓病害病原菌的鑒定多基于形態(tài)特征和ITS 序列，有時不能鑒定到種水平。本試驗采用形態(tài)學與多基因序列特異引物分析相結合的方法對引起草莓根腐病的病原菌進行鑒定。從草莓根部分離到該屬1 個中國新記錄種，結合形態(tài)鑒定和rDNA-ITS、-、（HIS）序列分析，對其進行形態(tài)描述和種類歸屬，明確草莓根腐病致病菌的新種類，為該病害的準確識別及綜合防治和草莓抗病育種提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

病原菌分離純化培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基。儀器及試劑：水浴鍋，生工生物工程（上海）股份有限公司；離心機，美國賽默飛世爾公司；PCR 擴增儀和凝膠成像儀，美國BIO-RAD 公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司等。PCR 擴增試劑購自廣州東盛生物科技有限公司，普通植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；引物合成及測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)病植株采集 2020 年9 月在新疆第十二師農業(yè)科學研究所草莓育苗網室采集紅顏草莓脫毒原原種苗發(fā)病植株，癥狀表現為萎蔫，坍塌在栽培基質表面，其葉片、葉柄未表現發(fā)病癥狀，從形態(tài)學特征不能判斷其病原菌，需要進行實驗室病原菌培養(yǎng)進而確定其發(fā)病原因。用小鏟子從基質槽中挖取約10 cm 帶有根系的病株，將其放入自封袋中，做好標記。后期通過人工致病性試驗和溫室中自然感病狀態(tài)進行癥狀綜合對比。

1.2.2 病原菌的分離純化 真菌的分離采用常規(guī)的組織分離法。將根部短縮莖切去表皮層，流水沖洗30 min，晾干；短縮莖用75%酒精消毒30 s，接著用無菌超純水沖洗3～5 遍；再用10%次氯酸鈉溶液消毒8～10 min，無菌超純水沖洗3～5 遍，用滅菌的無菌濾紙將短縮莖上的水吸干，將短縮莖切割成小薄片，接種于已滅菌的PDA 平板上，每個平板中放3 片，28 ℃下培養(yǎng)3～4 d。待組織邊緣部位有菌絲長出時，用接種環(huán)挑取單一菌絲轉接到PDA 平板上繼續(xù)培養(yǎng)純化，同時接種5 個平板，觀察來自5 個不同部位的菌絲生長狀態(tài)的差異性。純化3～4 次后可以得到純化的病原分離物。

1.2.3 致病性測定 12 月將紅顏草莓健康小苗種植在日光溫室營養(yǎng)缽中，種植30 d 后用無菌接種針在健康草莓植株的根部短縮莖、葉部分別扎1 個小洞，然后將另一無菌針沾取分離純化的病原菌孢子懸浮液（含孢子5 × 10個 · mL）接種到傷口處，接種后的植株置于溫室中保濕培養(yǎng)，以健康草莓植株為對照，每個處理接種2 株，對照2 株，接種7 d 后對草莓植株進行觀察。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學鑒定 按照魏景超（1979）的真菌鑒定方法進行病原菌鑒定。將長滿病原菌的PDA 平板置于4 ℃冰箱中處理1 周后，取出平板室溫放置30 min。用無菌接種針挑取PDA 平板上的少量菌絲，懸浮于滴加無菌水的載玻片上，用高倍鏡觀察病原菌分生孢子形態(tài)。從病原菌的菌絲、菌絲分枝、孢子等形態(tài)特征來進行分類鑒定。

1.2.5 病原菌的分子生物學鑒定 用PD 液體培養(yǎng)基將純化得到的單一菌株在28 ℃下搖菌振蕩培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)得到的菌球用鑷子取出置于研缽中，加液氮研磨成粉末，轉入1.5 mL 離心管中，利用普通植物基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）提取DNA。首先采用真菌ITS 區(qū)域通用引物ITS1 和ITS4 對分離得到的菌株的ITS DNA 序列進行擴增，獲得1 條大小約500 bp 的DNA 片段，然后利用-基因和基因特異引物（表1）分別對DNA 進行PCR 擴增。

表1 擴增草莓根腐病病原菌不同序列的引物

25 μL 的PCR 擴增反應體系包括：1 μL（約50 ng）模板DNA、12.5 μL PCR buffer mix（含Mg）、0.4 μmol · L引物各1 μL、DNA 聚合酶0.4 μL、ddHO 9.1 μL。

PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳40 min，DNA 核酸染料染色，凝膠成像儀觀察，擴增產物送由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果登陸GenBank 進行在線BLAST 核酸同源性比對，分別下載與-和序列最相近的土赤殼屬序列以及柱孢屬和新叢赤殼屬序列共48 條（表2），以土赤殼相近種屬菌種為外類群，利用MEGA 6.0 軟件，采用NJ 鄰接法進行進化樹分析，以驗證形態(tài)學特征鑒定結果的準確性及可靠性。

表2 構建系統進化樹所用24 個菌株及48 個序列號

2 結果與分析

2.1 根腐病發(fā)病癥狀

用分離純化的菌株接種后，草莓短縮莖、根部均染病。病原菌先侵染須根，須根呈水漬狀，2～3 d 后葉片褪綠呈暗綠色并萎蔫，由外圍葉片向內部葉片發(fā)展。隨著病菌進一步侵染根部，根部變黑，莖基紅褐色，直至全株枯死。近地果實亦發(fā)病，初呈水漬狀，后變褐色至微紫色，果實軟腐，潮濕時長滿白色的濃密棉絮狀菌絲。

2.2 致病性測定

通過對不同部位接種的致病性測定結果觀察可知，在接種病原菌的健康草莓根部產生了病原菌菌絲，沾取菌絲進行病原菌培養(yǎng)，挑取菌絲置于顯微鏡下觀察，發(fā)現重新培養(yǎng)的病原菌與原感染根腐病植株分離培養(yǎng)的病原菌菌落、菌絲等形態(tài)相同，根據柯赫氏法則判斷，確定該病原菌為草莓根腐病的致病菌。

2.3 病原菌的形態(tài)學鑒定

病菌在PDA 培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d，菌落直徑達3.5～4.5 cm，質地棉毛狀，橘黃色，氣生菌絲發(fā)達，淺黃色到黃褐色，邊緣金黃色，質地致密，邊緣規(guī)則，產生同心圓環(huán)帶，無滲出液。菌落背面淺黑棕色、邊緣黃褐色（圖1）。用高倍鏡（10 × 20 倍鏡）觀察病原菌孢子形態(tài)。分生孢子梗簡單或復雜，40～160 μm，通常著生于氣生菌絲側面或頂端，單一，不分枝或少分枝（圖2）。分生孢子有大小兩種，大型分生孢子豐富，圓柱形或棍棒狀，直或稍彎，（19～38）μm ×（3～7）μm。初步判斷為土赤殼屬病原菌。

圖1 病原菌菌落特征（7 d，PDA）

圖2 病原菌分生孢子梗

2.4 病原菌的分子生物學鑒定

首先采用真菌ITS 區(qū)域通用引物ITS1 和ITS4對分離得到的菌株的ITS DNA 序列進行擴增，獲得1 條大小約500 bp 的DNA 片段。對該片段進行測序，并在GenBank 上進行Blast 分析，比對結果表明該病原菌菌株與土赤殼屬具有同源性。再基于-和基因特異引物進一步進行PCR擴增，獲得800 bp 和500 bp 左右的條帶（圖3）。對擴增產物進行測序，片段大小為843 bp 和505 bp，將測序結果登陸GenBank 進行在線BLAST 核酸同源性比對，分別下載與-和序列最相近的土赤殼屬序列以及柱孢屬和新叢赤殼屬序列共48 條，將該待測菌株-基因測序結果序列編號為ZJ16-1，基因測序結果序列編號為ZJ16-2，分別以為外類群利用系統發(fā)育分析軟件對2 個不同基因測序序列進行分析，采用鄰接法構建系統進化樹；系統進化樹顯示（圖4），基于-和基因的兩個進化樹分析結果一致，具有特征條帶的菌 株 與的CBS 112593 菌株的自展支持率均為100%，據此可以進一步確定待測病原菌菌株為。

圖3 基于EF-1α 和Histone H3 基因引物序列的PCR擴增結果

圖4 基于EF-1α 和Histone H3 基因的系統進化樹分析

3 討論與結論

國外近兩年有關于土赤殼屬的4 個菌種、、、能 夠引起厄瓜多爾地區(qū)的安第斯黑莓黑根腐病的報道（Jessica et al.，2019）。國內關于土赤殼屬菌種的研究均集中在健康植株上（Zhuang，2013；王玉君等，2015），未見在發(fā)病植株上發(fā)現該屬病原菌的報道，筆者首次在新疆地區(qū)發(fā)病植株上發(fā)現土赤殼屬病原菌菌種，并通過篩選特異分子序列的方法，運用分子生物學手段對草莓根腐病病原菌進行鑒定，鑒定方法快速、準確。目前，對草莓病害病原菌的判斷多基于形態(tài)特征和單一序列鑒定，而形態(tài)學鑒定耗時較長，有些類群缺乏足夠的鑒定特征。同時，使用1 個單一DNA 序列也難以成功鑒定菌種。目前常用的多基因序列分析，可實現對病原菌進行相對快捷、準確的菌種鑒定。但多基因序列分析需要較繁雜的分子檢測程序，對操作人員的技術水平和試驗條件的要求較高。

傳統檢測方法中基于形態(tài)學特征難以判斷病原菌種類，而傳統病原菌分子生物學鑒定引物為ITS 序列，其保守性過高，對病原菌分類結果判斷不準確，且不易將病原菌確定到某個種。本試驗選擇組蛋白H3 基因（）結合延長因子1（-）基因進行鑒定，在草莓根腐病病原菌2個特異區(qū)段的基礎上設計引物，獲得草莓根腐病病原菌一組特異分子檢測引物序列。一般情況下，通過PCR 擴增產物的電泳特征條帶即可判斷是否感染了目標菌，無需進行后續(xù)的基因測序和系統進化樹分析，引物特異性高，檢測準確，使得檢測程序大大簡化，方便快捷。

本試驗為首次從發(fā)病草莓根部短縮莖分離到根腐病致病菌種，在此之前未見關于該菌種在我國草莓及其他作物上致病的報道。本試驗提示并驗證了該菌種為草莓根腐病致病菌，擴寬了草莓根部病害病原菌檢測范圍，對于綜合防治草莓根腐病具有重要意義，且為該病害的準確識別及草莓抗病育種提供了理論依據。針對草莓根腐病新病原菌的發(fā)現，在病菌生物學特性方面尚需全面深入研究，病菌寄主范圍尚待測定，病菌侵染特性及其機制有待深入研究，以便為生產上病害防治提供系統的理論依據。