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    咪鮮胺和咯菌腈復配劑對番茄枯萎病的防治效果及殘留檢測

    2022-03-10 09:18:26SIHOMCHANHBounpheng譚輝華李雪生吳海燕
    中國蔬菜 2022年2期
    關鍵詞:配劑菌腈單劑

    羅 嫚 SIHOMCHANH Bounpheng 何 瓊 譚輝華 李雪生 吳海燕*

    (1 廣西大學農學院,廣西農業(yè)環(huán)境與農產品安全重點實驗室,廣西南寧 530004;2 國家農林研究院園藝研究所,老撾萬象 7071)

    番茄()是廣泛種植的蔬菜作物,具有較高的營養(yǎng)價值,種植面積居世界第2 位,僅次于馬鈴薯,且居加工蔬菜第1 位(Lal et al.,2017)。近年來,隨著設施番茄的種植面積持續(xù)增加,經土壤傳播的番茄枯萎病亦發(fā)生嚴重,成為制約番茄設施生產的瓶頸問題(禇新培 等,2020)。番茄枯萎病是由尖孢鐮孢菌番茄?;停╢.sp.)侵染引起的,在番茄幼苗期到成株期均可發(fā)生(詹發(fā)強等,2013;賀宏偉 等,2018;Manikandan et al.,2018)。多年連作的地塊發(fā)病率高達20%~40%,并呈逐年加重的趨勢,番茄采收前期和中期發(fā)病均會出現(xiàn)嚴重的減產現(xiàn)象(Anitha &Rabeeth,2009;閆敏 等,2013)。

    廣西百色市田陽縣位于中國華南地區(qū),露地大面積冬種番茄。近年來,隨著番茄生產的規(guī)?;图s化,病害發(fā)生越來越嚴重,番茄枯萎病、灰霉病、細菌性斑點病等為害造成的損失逐年增加(李寶聚 等,2014;張靜潔 等,2021)。其中番茄枯萎病常與根結線蟲協(xié)同侵染,加重病情,是該地區(qū)的主要病害之一。生產上防治枯萎病最經濟有效的方法是選育抗病品種,但抗枯萎病的番茄種質資源有限,且抗枯萎病番茄品種因產量低而未被廣泛種植(Landa et al.,2004)。目前,化學防治仍是防治枯萎病的主要手段,但由于單一藥劑的長期使用或不合理使用,病原菌容易產生抗藥性。在草莓枯萎病菌對多菌靈和戊唑醇的抗性研究中發(fā)現(xiàn),利用含上述兩種藥劑的培養(yǎng)基分別繼代培養(yǎng)草莓枯萎病菌到45 代和36 代后,枯萎病菌對多菌靈和戊唑醇的抗藥性分別增加到53.91 倍和34.22 倍;對抗性菌株的遺傳穩(wěn)定性測定發(fā)現(xiàn),該病菌在連續(xù)轉代培養(yǎng)8 代后抗藥性穩(wěn)定性較強,對多菌靈和戊唑醇的抗性能夠通過無性繁殖遺傳(顧春波,2010)。因此,如何降低枯萎病菌對農藥的抗藥性仍是生產上亟待解決的問題。前人研究表明,通過相關藥劑復配可提高防病效果,延緩病原菌對單一藥劑的抗藥性。比如,田間使用1%申嗪霉素懸浮劑與40%咪鮮胺水乳劑復配,對小麥赤霉病的防效達84.65%,顯著高于單劑防效(侯昌亮 等,2014)。本試驗在前期獲得的咪鮮胺和咯菌腈最佳濃度(10 mg · L)和復配比(2∶8)基礎上(李丙雪 等,2021),進一步開展盆栽試驗和藥劑殘留檢測,以期為延緩枯萎病菌抗藥性產生,減少用藥量等提供理論依據。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試菌株是2018 年2 月分離于廣西百色市田陽縣番茄種植基地采集的番茄枯萎病病株,在廣西農業(yè)環(huán)境與農產品安全重點實驗室采用常規(guī)組織分離法對樣本進行病原菌的分離、培養(yǎng)和純化,經形態(tài)學及分子鑒定為(基因登錄號為:MN240928)。供試番茄品種為改良毛粉802 F,購自廣州亞蔬園藝種苗有限公司。采用的基質為全價育苗基質(有機質+腐殖酸≥50%),長春益農賽世泥炭開發(fā)有限責任公司生產。

    參試藥劑:96.8%咪鮮胺原藥,99.2%咯菌腈原藥,均為山東濰坊潤豐化工有限公司生產;復配劑為咪鮮胺原藥和咯菌腈原藥按照2∶8(體積比)配制,其中單劑的有效成分含量均為10 mg · L,前期試驗結果表明該復配劑對番茄枯萎病菌的抑菌率達91.1%(李丙雪 等,2021)。

    試驗儀器:GXZ 型恒溫培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠生產;Sigma 3K13 離心機,德國Sigma 公司生產;Agilent 7890A 氣相色譜儀,高效液相色譜串聯(lián)質譜,Eclipse Plus C18 液相色譜柱(50 mm × 2.1 mm,1.8 μm),美國Agilent 公司生產。

    1.2 方法

    1.2.1 枯萎病防治試驗 將10 g 大麥粒裝入250 mL 三角瓶,共裝15 瓶,加無菌蒸餾水過夜,高壓蒸汽滅菌30 min,冷卻后再次滅菌30 min。預先準備好PDA 平板培養(yǎng)7 d 的番茄枯萎病菌,用直徑6 mm 的打孔器在菌落邊緣打取菌餅,接種到大麥培養(yǎng)基上,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。在培養(yǎng)過程中,每天搖動2 次以確保菌絲體在大麥種子上均勻生長。

    2019 年5 月,將番茄種子播于規(guī)格為38 cm ×28 cm × 5 cm 的育苗盤中,在廣西大學農學院溫室中育苗;幼苗3~5 葉期移栽至裝有300 g 基質的花盆(直徑15 cm)中,每盆1 株。移栽5 d 后,用玻璃棒在距離番茄根莖2 cm 處打3 cm 深的孔,接種帶菌大麥種子,每株幼苗接種10 g,然后用基質覆蓋。接種枯萎病菌10 d 后,進行藥劑處理。設置5 個處理:①96.8%咪鮮胺和99.2%咯菌腈復配劑(2∶8);② 96.8%咪鮮胺單劑10 mg · L;③99.2%咯菌腈單劑10 mg · L;④ 清水對照;⑤以未接種枯萎病菌的植株為空白對照。采用完全隨機排列,2 次重復,每重復15 盆。采用灌根的方式施藥,每盆用量100 mL,未接種枯萎病菌的植株澆灌100 mL 清水。施藥后定期定量澆水,常規(guī)管理。分別在施藥后10、20、30、40、50 d 調查枯萎病發(fā)病情況,觀察植株長勢,并拍照記錄。

    番茄枯萎病分級標準參考馬欣等(2016)的方法:0 級,健康植株,葉片無癥狀;1 級,1 片或2片子葉明顯變黃,以致脫落;2 級,1 片或2 片真葉變黃或全株發(fā)黃,葉片萎蔫下垂;3 級:全株明顯萎蔫或真葉嚴重變黃,植株生長受抑制、矮化;4 級:全株嚴重萎蔫以致枯死。

    發(fā)病率=發(fā)病株數/總株數× 100%

    病情指數=∑(各級病株數×相應級值)/(調查總株數×最高級值)× 100

    防治效果=(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數× 100%

    施藥后50 d,每處理分別輕取感病植株15株,采用卷尺測量株高(莖基部到主莖頂部的距離)、根長、莖部病斑長度(根部最上面發(fā)根處到病斑延伸末端之間的距離)(Ndeve &Roberts,2019)。

    1.2.2 咪鮮胺殘留測定 施藥后50 d,每處理隨機選取15 盆,用剪刀剪取莖(莖基部5 cm)、葉片,并取土樣(即花盆中的基質),分別裝袋、記錄,置于-20 ℃冰箱中暫存。稱取莖、葉片以及土壤樣品各100 g,每處理3 次重復,分別用組織搗碎機粉碎。然后稱取5 g 樣品于研缽中,研磨后置于50 mL 離心管中,再加入2 mL 鹽酸(1 mol · L)、5 mL 飽和氯化鈉、40 mL 丙酮,振蕩1 h 后,4 800 r · min離心10 min,取上清液轉至濃縮瓶中,濃縮去除丙酮后轉至分液漏斗,加入40 mL 飽和氯化鈉、60 mL 去離子水,用二氯甲烷萃取2 次,每次用量20 mL,取有機相過無水硫酸鈉于濃縮瓶中濃縮近干,再用5 mL 二氯甲烷沖洗一并轉至20 mL具塞試管中,氮氣吹干后加入5 g 吡啶鹽酸鹽,于220 ℃沙浴進行衍生化處理2 h,冷卻后待凈化。依次用20、20、10 mL 去離子水沖洗試管,將水解產物轉至分液漏斗中,加入5 mL 鹽酸(1 mol ·L),用石油醚萃取2 次,每次用量20 mL,取有機相過無水硫酸鈉后,用20 mL 石油醚沖洗無水硫酸鈉,濃縮近干,最后用正己烷定容至5 mL,待GC-μECD(氣相色譜微池電子捕獲檢測器)檢測。

    咪鮮胺標準曲線的制作:咪鮮胺在環(huán)境中的降解產物有多種,但最終都會降解成對環(huán)境影響較大的2,4,6-三氯苯酚,因此用2,4,6-三氯苯酚配制成濃度為0.01、0.05、0.50、1.00、5.00 μg · mL的5 個系列標準溶液,以峰面積為縱坐標,濃度(μg ·mL)為橫坐標進行線性回歸分析。在最佳試驗條件下檢測咪鮮胺及其最終代謝產物2,4,6-三氯苯酚殘留量。

    1.2.3 咯菌腈殘留測定 樣品前處理同1.2.2。稱取2.5 g 已粉碎的樣品置于離心管中,土壤、莖、葉片樣品中分別加入10、5、5 mL 超純水,渦旋5 min 后,加入5 mL 乙腈,再次渦旋5 min,然后加入3 g 無水硫酸鎂、2 g 氯化鈉,蓋上蓋子混勻,繼續(xù)渦旋3 min 后,4 000 r · min離心3 min,吸取1.5 mL 有機相于2 mL 離心管中,轉移到上機小瓶中,備用。

    儀器檢測條件:高效液相色譜串聯(lián)質譜,Eclipse Plus C18 液相色譜柱。操作條件:乙腈∶水=80∶20;流速:0.4 mL · min;運行時間:2 min。離子源參數為:氣簾氣溫度350 ℃,氣簾氣流速11 mL · min,去簇電壓4 000 V,其他質譜條件詳見表1。

    表1 咯菌腈的質譜檢測參數

    咯菌腈標準曲線的制作:配制濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 μg · mL的6 個系列標準溶液,搖勻,按照儀器檢測條件,以峰面積為縱坐標,濃度(μg · mL)為橫坐標進行線性回歸分析。

    1.3 數據分析

    利用DPS 7.5(DPSSOFTDPSW.TXT)軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析,運用LSD 最小顯著性法進行差異顯著性檢驗。

    2 結果與分析

    2.1 咪鮮胺和咯菌腈復配劑對番茄枯萎病發(fā)病情況的影響

    從表2 可以看出,接種枯萎病菌的番茄植株均發(fā)病,但不同處理的發(fā)病率和病情指數有所差異。咪鮮胺和咯菌腈對番茄枯萎病均有治療效果,尤其復配劑的治療效果更明顯,施藥后30~50 d 植株的發(fā)病癥狀不再擴展,原來的病葉脫落,其他葉片及新葉表現(xiàn)正常;3 個藥劑處理的枯萎病發(fā)病率和病情指數均隨藥劑施用時間呈先上升后下降的變化趨勢,施藥后50 d 咪鮮胺和咯菌腈復配劑處理的枯萎病發(fā)病率為33.33%,病情指數為28.33,明顯低于各單劑處理。

    表2 咪鮮胺和咯菌腈復配劑對番茄枯萎病發(fā)病情況的影響

    2.2 咪鮮胺和咯菌腈復配劑對番茄枯萎病的防治效果

    從表3可以看出,濃度為10mg·L的 咪鮮胺、咯菌腈單劑以及兩者的復配劑對番茄枯萎病均具有防治效果,施用咪鮮胺和咯菌腈單劑后10~50 d 的防治效果分別為18.90%~60.61%和24.17%~53.33%,施用復配劑后10~50 d 后的防治效果為36.53%~71.67%;施藥20 d 后,咪鮮胺和咯菌腈復配劑的防治效果高于單劑。

    表3 咪鮮胺和咯菌腈復配劑對番茄枯萎病的防治效果

    2.3 咪鮮胺和咯菌腈復配劑對番茄莖部病斑長度、株高和根長的影響

    施藥50 d 后,咪鮮胺和咯菌腈復配劑、咪鮮胺單劑和咯菌腈單劑處理的番茄植株莖部病斑長度分別為0.2、1.1、1.4 cm,均顯著低于清水對照,復配劑處理的莖部病斑長度還顯著小于咯菌腈單劑處理;株高分別為32.1、27.1、26.9 cm,復配劑處理與未接種病菌空白對照的株高差異不顯著,但2個單劑處理的株高顯著低于空白對照;根長分別為8.0、7.7、7.2 cm,均顯著低于未接種病菌的空白對照(表4、圖1)。

    表4 咪鮮胺和咯菌腈復配劑對番茄莖部病斑長度、株高和根長的影響

    圖1 咪鮮胺和咯菌腈復配劑對接種枯萎病菌的番茄植株生長的影響

    2.4 咪鮮胺及咯菌腈殘留測定

    2.4.1 咪鮮胺標準曲線 以濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制標準曲線,建立線性方程。2,4,6-三氯苯酚在0.01~5.00 μg · mL范圍內,其濃度咯菌腈與響應值有良好的線性關系,線性方程=2 307.6+203.9,=0.999 3。

    2.4.2 咯菌腈標準曲線 以濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標繪制標準曲線,建立線性方程??┚嬖?.01~5.00 μg · mL范圍內,其濃度與響應值有良好的線性關系,線性方程=2 350.9+3.475,=0.999 4。

    2.4.3 咪鮮胺及咯菌腈殘留分析 從表5 可以看出,施用咪鮮胺單劑、咪鮮胺和咯菌腈復配劑50 d 后,在番茄莖和葉片中均沒有檢測出咪鮮胺及其最終代謝物2,4,6-三氯苯酚;土壤中咪鮮胺的最終殘留量分別為0.30~0.40 mg · kg和0.10 mg · kg,2,4,6-三氯苯酚的最終殘留量分別為0.60~0.90 mg · kg和0.20~0.30 mg · kg。施用咯菌腈單劑、咪鮮胺和咯菌腈復配劑50 d 后,咯菌腈在番茄葉片中的最終殘留量均小于0.01 mg · kg,在莖中的最終殘留量分別為0.03~0.04 mg · kg和0.01~0.06 mg · kg,在土壤中的最終殘留量分別為2.11~2.28 mg · kg和1.56~1.67 mg · kg,均小于GB 2763—2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》中規(guī)定的咯菌腈在番茄中最大殘留限量3 mg · kg。

    表5 咪鮮胺、2,4,6-三氯苯酚和咯菌腈在土壤、番茄莖和葉片中的最終殘留量

    3 結論與討論

    目前,咪鮮胺和咯菌腈單劑或復配劑常用于防治番茄枯萎病,比如用0.4 mg · mL咪鮮胺防治大棚水培番茄枯萎病,防治效果為69.6%(Song et al.,2004);80%乙蒜素乳油與25 g · L咯菌腈懸浮種衣劑或30%嘧菌酯懸浮劑的復配劑比單劑的防治效果更好,校正防效高達93.6%、89.1%(林輝 等,2018)。本試驗結果表明,盆栽番茄施藥后50 d,濃度均為10 mg · L的咪鮮胺和咯菌腈按2∶8配制的復配劑對番茄枯萎病的防效為71.67%,明顯高于咪鮮胺單劑和咯菌腈單劑對番茄枯萎病的防效(52.50%和53.33%)。試驗過程發(fā)現(xiàn),施藥后10~50 d,番茄枯萎病的發(fā)病率和病情指數均呈先升高后降低的變化趨勢,這是因為施藥處理是在接種枯萎病菌10 d 后進行的,藥劑處理前病原菌已侵染番茄植株,逐漸表現(xiàn)出枯萎病癥狀,藥效發(fā)揮作用后發(fā)病程度較輕的病葉脫落,新葉不再發(fā)病,部分發(fā)病植株恢復健康,再次統(tǒng)計發(fā)病情況時成為健康植株,說明該復配劑在一定時間有治療番茄枯萎病的作用,但并不能說明復配藥劑的持效期可達50 d。陳莉等(2012)在篩選防治稻曲病的藥劑試驗中發(fā)現(xiàn),1 mg · mL烯唑醇和咪鮮胺復配劑(1∶10)對稻曲病菌的毒力作用強,30.0%烯唑醇和咪鮮胺可濕性粉劑復配的田間防效為79.2%,高于單劑。本試驗中,在施用咪鮮胺和咯菌腈復配劑30~50 d 后,番茄枯萎病的病情指數從58.33 下降到28.33,均明顯低于咪鮮胺單劑和咯菌腈單劑處理,說明復配劑對番茄枯萎病的防治起到了增效的作用。

    目前我國《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》(GB 2763—2019)規(guī)定咯菌腈在番茄中的最大殘留限量為3 mg · kg,咪鮮胺在旱糧類、黃瓜、蘋果和蘑菇中的最大殘留限量值分別為2、1、2、2 mg · kg,但尚未制定咪鮮胺在番茄上的最大殘留限量標準。本試驗中,施用咪鮮胺、咯菌腈單劑及其復配劑50 d 后,在番茄莖和葉片中均未檢出咪鮮胺及其最終代謝物2,4,6-三氯苯酚,咯菌腈的最終殘留量分別小于0.06 mg · kg和0.01 mg · kg,使用安全,可以為防治番茄枯萎病農藥減量增效提供重要依據。

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