生龍接骨膠囊對SD大鼠骨折愈合過程中BMP-2及BMP-7表達(dá)的影響*

丁 超 占海思 萬春虎 梁 詈 朱浩亮 熊名副△

由于交通事故、意外跌倒等原因，全球每周有數(shù)萬計骨折的發(fā)生，每年骨折的治療費(fèi)用高達(dá)數(shù)十億美元[1]。促進(jìn)骨折部位的愈合、緩解疼痛是目前骨折治療的主要方法。資料表明[2]，中醫(yī)藥在治療骨折方面優(yōu)勢明顯，很多中藥能有效促進(jìn)骨折的愈合，加快骨折患者的恢復(fù)[3，4]。生龍接骨膠囊是南昌市洪都中醫(yī)院的一個院內(nèi)制劑，近年來應(yīng)用與骨折的治療中療效確切，可有效促進(jìn)骨痂生長和骨折的愈合、提升骨密度，利于患者轉(zhuǎn)歸[5-7]。雖然生龍接骨膠囊臨床治療骨折安全有效，但目前缺乏對生龍接骨膠囊作用機(jī)制相關(guān)的研究。鑒于此，本研究建立脛骨骨折大鼠模型，從成骨細(xì)胞的增殖、BMP-2和BMP-7等的表達(dá)等方面對生龍接骨膠囊促進(jìn)大鼠骨折愈合的作用機(jī)制進(jìn)行初步的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料SD大鼠180只，雄性，清潔級，8周齡，體質(zhì)量155～175 g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)動物科技中心提供，在江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，飼養(yǎng)室溫度22～25 ℃、濕度40%～50%。生龍接骨膠囊由南昌市洪都中醫(yī)院制劑室制備。PBS緩沖液實(shí)驗室自行配置。PBS緩沖液配置方法：磷酸二氫鉀0.24 g，磷酸氫二鈉1.44 g，氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g。加去離子水800 ml充分?jǐn)嚢枞芙猓←}酸調(diào)pH至7.4，最后定容到1 L；其他相關(guān)試劑為分析純。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 實(shí)驗動物的分組按照隨機(jī)數(shù)字法，將實(shí)驗大鼠分為正常組(空白組)、對照組(自然恢復(fù)組)、生龍接骨膠囊低、中、高劑量組，每組36只。參照《中醫(yī)正骨學(xué)》中的骨折分期，除空白組外，各組大鼠又分為早、中、后3期骨折模型，每期分別12只。

1.2.2 大鼠脛骨骨折模型的建立將自然恢復(fù)組、對照組和生龍接骨膠囊低、中、高劑量組大鼠建立脛骨骨折模型。大鼠雙下肢常規(guī)脫毛處理，1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，無菌條件下雙下肢脛骨上1/3段前正中點(diǎn)，橫行切開骨膜造成約2.0 mm×1.5 mm大小的骨缺損。造模后1周的大鼠為早期骨折模型，3周的為中期骨折模型，4周的為后期骨折模型(即造模后第1周、第3周和第4周開始給藥治療)，以此作為骨折愈合基礎(chǔ)模型。每只大鼠腹腔注射青霉素20萬IU/d，連續(xù)注射7 d，預(yù)防感染。

1.2.3 治療方法正常組和對照組大鼠給予生理鹽水灌胃，每次灌胃體積1 ml。生龍接骨膠囊低、中、高劑量組分別給以生龍接骨膠囊10 g/(kg·d)、20 g/(kg·d)、40 g/(kg·d)灌胃治療，每次灌胃體積1 ml。其中生龍接骨膠囊早、中、后3期分別在造模后第1周、第3周和第4周開始給藥治療，對照組早、中、后3期分別在造模后第1周、第3周和第4周給以生理鹽水灌胃，空白組在各取12只，分別在相同時期給予生理鹽水灌胃。各組大鼠分別連續(xù)灌胃2周。

1.2.4 觀察指標(biāo)開始治療后觀察各組大鼠下肢發(fā)生自主活動的開始時間，患處局部血腫消腫的時間。各組與末次給藥后2 h，眼球取血。取血后脫頸處死再常規(guī)處理脛骨骨折處標(biāo)本，CCK-8法測定各組骨折斷端成骨細(xì)胞的A值(A值越高，表示成骨細(xì)胞數(shù)量越多)，酶聯(lián)免疫吸附法測定BMP-2和BMP-7的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 一般情況治療過程中，對照組和治療組共144只大鼠，建模過程中死亡1只，其余143只成功建立骨折模型?？瞻捉M大鼠未活動正常，未發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象。治療組低、中、高劑量組給藥連續(xù)給藥7 d后可見骨折部位有局部突起增生，給藥14 d后可見到清晰的骨痂形成，但對照組大鼠灌胃14 d沒有發(fā)現(xiàn)有骨痂形成，僅有骨膜反應(yīng)。

2.2 成骨細(xì)胞增殖情況與正常組比較，對照組的A值顯著升高，表明大鼠骨折后，成骨細(xì)胞開始生長。生龍接骨膠囊低、中、高劑量顯著高于對照組(P<0.05)，且呈劑量依賴性。低、中、高劑量組成骨細(xì)胞的A值早期>中期>后期(P<0.05)，這表明，治療越早，效果越好。CCK-8法比較各組大鼠治療前后不同時期成骨細(xì)胞的增殖情況。見表1。

表1 各組大鼠不同時期成骨細(xì)胞增殖A值比較 (只，

2.3 BMP-2表達(dá)生龍接骨膠囊低、中、高劑量BMP-2的表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。低、中、高劑量組BMP-2的表達(dá)量早期>中期>后期(P<0.05)，這表明，治療越早，效果越好。見表2。

表2 各組大鼠BMP-2表達(dá)結(jié)果比較 (只，

2.4 BMP-7表達(dá)生龍接骨膠囊低、中、高劑量BMP-7的表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。低、中、高劑量組BMP-7的表達(dá)量早期>中期>后期(P<0.05)，這表明，治療越早，效果越好。見表3。

表3 各組大鼠BMP-7表達(dá)結(jié)果比較 (只，

3 討論

本研究中生龍接骨膠囊對SD大鼠骨折愈合不同時期BMP-2及BMP-7的表達(dá)影和成骨細(xì)胞的增殖進(jìn)行了初步的研究。研究的結(jié)果表明，生龍接骨膠囊低、中、高劑量組BMP-2及BMP-7的表達(dá)顯著高于對照組和正常組，且早期>中期>后期，且表現(xiàn)出劑量依賴性。這表明，骨折發(fā)生后，治療越早，效果越好。資料表明[8，9]，BMP-2和BMP-7是重要的骨折愈合促進(jìn)蛋白，能誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)前體細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，促進(jìn)骨折的愈合，調(diào)節(jié)骨缺損的修復(fù)。資料表明[10]，成骨細(xì)胞在骨折的愈合過程中起十分關(guān)鍵的作用。本研究的結(jié)果表明，生龍接骨膠囊能通過上調(diào)BMP-2和BMP-7蛋白的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖來達(dá)到促進(jìn)骨折愈合的目的。臨床實(shí)踐經(jīng)驗表明[11]，中醫(yī)藥在骨折治療方面安全有效，能通過多種作用機(jī)制促進(jìn)骨折愈合，調(diào)節(jié)骨缺損的修復(fù)。生龍接骨膠囊是南昌市洪都中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，由生龍骨、三七、當(dāng)歸、熟地黃、自然銅、雞血藤、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、炒土鱉蟲、乳香、淫羊藿、血竭等多種中藥組成，能活血化瘀，強(qiáng)筋健骨、療傷續(xù)折，尤長于促進(jìn)骨折愈合。本研究的結(jié)果表明，生龍接骨膠囊能促進(jìn)大鼠骨折的愈合，且早期的效果>中期>后期。這表明，對于骨折治療的越早，效果越好。