桑椹菌核病綠色防控藥劑篩選試驗

劉筱雪 王 一 曾澤彬 李冬兵 周 麗 王洪江 蘭鳳杰 劉學(xué)鋒

(宜賓市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川宜賓 644000)

桑椹菌核病(mulberry fruit sclerotiniosis)，俗稱白果病，是果桑種植區(qū)普遍發(fā)生的一類真菌病害，具有毀滅性危害，嚴重威脅果桑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。根據(jù)感染桑椹的病原菌不同，又將桑椹菌核病分為桑椹肥大性菌核病(hypertrophy sorosis scleroteniosis)、桑椹縮小性菌核病(reduced sorosis scleroteniosis)和桑椹小粒性菌核病(small particles sorosis scleroteniosis)3種類型[1-3]。其中，桑椹肥大性菌核病的發(fā)病率最高，危害也最為嚴重，發(fā)病率占桑椹菌核病總量的80%以上[2]。目前，已報道的桑椹菌核病病原菌有4種[1-4]，但是較常見的有3種，即引起桑椹肥大性菌核病的桑實杯盤菌(Ciboriashiraiana)，引起桑椹縮小性菌核病的白井地杖菌(Mitrulashiraiana)以及引起桑椹小粒性菌核病的肉阜狀杯盤菌(Ciboriacarunculoides)。

桑椹菌核病的防控方法包括化學(xué)、物理、農(nóng)業(yè)等手段。其中，化學(xué)防控是目前控制桑椹菌核病的主要手段，生產(chǎn)上常用70%甲基硫菌靈或50%多菌靈進行防控[1]，呂蕊花等[5]研究發(fā)現(xiàn)草甘膦對桑椹菌核病也有良好的防控效果。合理地使用這些藥劑可以有效控制桑椹菌核病的發(fā)生及減輕危害程度。然而，這些藥劑屬于低毒或有毒藥物，對環(huán)境、食品以及人體存在潛在危害，長期使用還會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此，急需篩選出綠色無污染的高效殺菌劑。近年來，植物精油、脂肪酸、二氧化氯、水楊酸、殼聚糖、草酸鈉、氯化鈣、海藻酸鈉等新型綠色殺(抑)菌劑和植物誘抗劑在食品業(yè)和農(nóng)業(yè)得到廣泛研究和應(yīng)用[6-13]。由此，本研究選擇了10種綠色低毒藥劑開展桑椹菌核病的防治試驗，旨在篩選出安全、高效的防控藥劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

圖1 DGF1的菌落形態(tài)(A)和子實體(B)

1.1.1 供試菌株 桑椹肥大性菌核病菌株編號DGF1(圖1)，由宜賓市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑和食用菌研究實驗室從患病桑椹分離所得。將菌株ITS序列提交到NCBI進行BLAST分析，結(jié)果顯示菌株DGF1與Genbank中Ciboriashiraiana(JF816240.1)的同源相似性高達99%，結(jié)合菌落形態(tài)與分子鑒定，將其鑒定為Ciboriashiraiana。

1.1.2 供試藥劑 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑，農(nóng)藥登記證號PD20085037，江蘇龍燈化學(xué)有限公司產(chǎn)品；50%多菌靈可濕性粉劑，農(nóng)藥登記證號PD85150-35，四川國光農(nóng)化股份有限公司產(chǎn)品；99%香芹酚、98%百里香酚、99.5%水楊酸，均為分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；肉桂酸、草酸鈉、氯化鈣、海藻酸鈉，均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；11%脂肪酸乳油，海厄滋生物科技有限公司產(chǎn)品；18%二氧化氯消毒劑(粉劑)，昆明雙玖消毒藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；殼聚糖，生物純，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 E.Z.N.A. Fungal DNA Kit 試劑盒(D3390)，美國OMEGA生物公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥劑室內(nèi)篩選試驗 藥劑室內(nèi)篩選試驗采用菌絲生長速率法和最小抑制濃度法(minimal inhibitory concentration, MIC)[14]進行。(1)藥劑初篩試驗：分別將脂肪酸等10種綠色低毒藥劑用含0.5%吐溫-80的無菌水配制成終濃度為稀釋1 000倍的藥物平板，以同樣處理的甲基硫菌靈和多菌靈2種傳統(tǒng)化學(xué)藥劑為藥物對照，以不加藥物的PDA平板為空白對照，每個培養(yǎng)皿接入培養(yǎng)至對數(shù)期、直徑為8 mm的病原菌菌塊，置于25 ℃培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3個重復(fù)。(2)藥劑梯度試驗：采用同樣的方法進行梯度試驗,分別將藥劑初篩試驗篩選出的脂肪酸等6種綠色低毒藥劑用含0.5%吐溫-80的無菌水配制成終濃度為稀釋500倍、750倍、1 000倍、1 250倍、1 500倍的藥物平板，以同樣處理的甲基硫菌靈和多菌靈2種傳統(tǒng)化學(xué)藥劑為藥物對照，以不加藥物的PDA平板為空白對照。根據(jù)公式計算藥劑的相對抑制生長率：菌落凈直徑=菌落直徑-菌絲塊直徑；相對抑制率(%)=[(對照菌落凈直徑-處理菌落凈直徑)/對照菌落凈直徑]×100。

1.2.2 藥劑大田試驗 藥劑大田試驗于2021年2—5月份，在宜賓市農(nóng)業(yè)科學(xué)院大觀科研基地開展，果桑品種為粵椹大十，樹齡6年。試驗分別設(shè)置脂肪酸、香芹酚以及二氧化氯等的500倍稀釋藥液3個綠色低毒藥劑處理，以70%甲基硫菌靈500倍稀釋藥液(甲基硫菌靈安全性比多菌靈高，且多菌靈正在逐漸被禁用，因此，大田試驗未選用多菌靈)為藥物對照，以噴施清水作空白對照(CK)，每處理設(shè)3個重復(fù)，每小區(qū)面積60 m2。每小區(qū)選擇有代表性的3株桑樹，每株定點調(diào)查3個枝條，統(tǒng)計每個枝條上桑椹的總數(shù)和病椹數(shù)，計算每株桑樹的發(fā)病率。用危害嚴重度分級法統(tǒng)計病情指數(shù)，共分為0～4級：0級為桑椹全果健康，代表分值為0；1級為桑椹的病小核果占全果面積1/4以下，代表分值為1；2級為桑椹的病小核果占全果面積1/4～1/2，代表分值為3；3級為桑椹的病小核果占全果面積1/2～3/4，代表分值為5；4級為桑椹的病小核果占全果面積3/4以上，代表分值為10。

第1次施藥從桑花初開時開始，之后每隔7 d噴藥1次，每次噴霧以滴水為度，直到部分桑椹由青變紅時停止施藥。施藥停止后，每7 d調(diào)查1次，直至病果不再增加即調(diào)查結(jié)束。根據(jù)公式計算發(fā)病率和相對防效：發(fā)病率(%)=(發(fā)病植株數(shù)/調(diào)查植株總數(shù))×100；病情指數(shù)(%)=[∑(各級病椹數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查病椹總數(shù)×最高級別代表值)]×100；相對防效(%)=[(對照區(qū)發(fā)病率-防治區(qū)發(fā)病率)/對照區(qū)發(fā)病率]×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0軟件處理試驗數(shù)據(jù)，采用ANOVA法進行方差分析，并用Duncan’s新復(fù)極差法比較數(shù)據(jù)間的差異顯著性。通過SPSS 22.0軟件分析，取藥劑質(zhì)量濃度為X，抑制率值為Y，得到毒力回歸方程并計算藥物抑制中濃度(EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對Ciboria shiraiana的抑制效果

藥劑初篩試驗比較了10種綠色低毒藥劑與2種傳統(tǒng)化學(xué)藥劑的1 000倍稀釋藥液對Ciboriashiraiana菌絲生長的作用情況。從表1可以看出，脂肪酸對Ciboriashiraiana的抑制效果最好，相對抑制率達99.21%，與傳統(tǒng)化學(xué)藥劑甲基硫菌靈和多菌靈的效果相當。其次為香芹酚，相對抑制率為96.38%。二氧化氯、水楊酸和百里香酚的抑制效果較好，相對抑制率分別為93.23%、90.55%、89.76%。肉桂酸和殼聚糖的抑制效果較差，相對抑制率分別為67.32%和23.15%。草酸鈉、氯化鈣和海藻酸鈉對Ciboriashiraiana沒有抑制效果。

表1 不同藥劑對Ciboria shiraiana的抑制效果

表中不同小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 不同藥劑對Ciboria shiraiana的藥物抑制中濃度(EC50)

從表2可以看出，藥劑的抑菌效果與藥物濃度呈正相關(guān)。其中，香芹酚的EC50最低，僅為62 mg/L，說明Ciboriashiraiana對香芹酚表現(xiàn)出較高的敏感性，在較低的濃度下即有較強的抑制效果。里香酚與香芹酚是同分異構(gòu)體，但百里香酚的EC50為382 mg/L，兩者的EC50相差近6倍，說明兩者分子結(jié)構(gòu)的差異(酚羥基位置不同)導(dǎo)致了抑菌效果的不同，而香芹酚的構(gòu)型更有利于對Ciboriashiraiana的抑制作用。肉桂酸的EC50最高，達902 mg/L，說明Ciboriashiraiana對肉桂酸敏感性較低。水楊酸是肉桂酸的衍生物，EC50為475 mg/L，說明Ciboriashiraiana對其敏感性也較低。脂肪酸和二氧化氯的EC50分別為311 mg/L和322 mg/L，與傳統(tǒng)化學(xué)藥劑的效果相當。綜上所述，香芹酚、脂肪酸和二氧化氯具有防控桑椹肥大性菌核病的潛力。

表2 不同藥劑對Ciboria shiraiana的藥物抑制中濃度(EC50)

2.3 不同藥劑對桑椹菌核病的大田防控效果

從表3和圖2可以看出，粵椹大十在宜賓的桑椹菌核病發(fā)病高峰期在4月初。大田試驗結(jié)果表明，香芹酚處理的發(fā)病率為3.19%～18.59%，病情指數(shù)為0.95～13.01；二氧化氯處理的發(fā)病率為0.32%～19.29%，病情指數(shù)為0.10～13.09；脂肪酸處理的發(fā)病率為1.41%～12.18%，病情指數(shù)為1.13～8.17；甲基硫菌靈處理的發(fā)病率為0.42%～8.26%，病情指數(shù)為0.12～4.97；空白對照的發(fā)病率為1.47%～19.35%，病情指數(shù)為1.45～13.61。由此可知，在田間環(huán)境下，香芹酚和二氧化氯對桑椹菌核病沒有明顯的防治效果；甲基硫菌靈對桑椹菌核病的防控效果最好，相對防效為41.10%～83.60%；脂肪酸相對于香芹酚和二氧化氯對桑椹菌核病的防控效果較好，相對防效為4.08%～46.93%。

表3 不同藥劑對桑椹菌核病的大田防控情況

圖2 不同藥劑對桑椹菌核病的大田防控效果折線圖

3 討論

桑椹菌核病是果桑產(chǎn)業(yè)面臨的一大難題，該病只能防不能治，具有來勢猛、發(fā)病快的特點，其危害往往是毀滅性的，因此必須加強對桑椹菌核病的防控力度。多菌靈和甲基硫菌靈是桑椹菌核病最常用的防治藥物，其中，多菌靈的殘效期比較長，對哺乳動物有一定的毒害性[15]。目前，多菌靈已在美國禁用，中國及歐盟等多個國家(地區(qū))也在逐步限制其使用；相對于多菌靈，甲基硫菌靈的安全性更高，但其在植物體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為多菌靈，其潛在毒性也值得進一步研究[16]。因此，急需篩選出針對桑椹菌核病的安全、高效防控藥物。

植物精油是一類植物源次生代謝物質(zhì)，具有抗菌、防腐、高效、低毒、易降解和對環(huán)境污染小等特點。研究利用植物精油作為化學(xué)殺菌劑的替代品用于防治植物病蟲害已成為國內(nèi)外的研究熱點[6,17]。國外已經(jīng)開發(fā)出幾種精油類農(nóng)藥，并被美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration，F(xiàn)DA)認證為一般公認安全(generally recognized as safe，GRAS)。例如，Mycotech公司以肉桂油為原料，以其主要成分肉桂醛為有效成分研制出30%的乳油產(chǎn)品，用作殺蟲、殺螨、殺菌劑。EcoSMART公司推出用于防治植物病蟲害的氣霧劑和粉劑產(chǎn)品，不同產(chǎn)品包含肉桂、百里香、丁香、迷迭香、薄荷油以及2-苯乙基丙酸酯等活性成分。國內(nèi)也逐漸開始重視對植物精油的研究和應(yīng)用。植物精油作為一種新型的植物源農(nóng)藥，相較于傳統(tǒng)化學(xué)藥劑，其對人類和環(huán)境的風(fēng)險更小，具有潛在的價值和廣闊的市場。

二氧化氯是目前國際上公認的一種安全高效的殺菌劑，被聯(lián)合國衛(wèi)生組織(WHO)列為A1級安全消毒劑，具有無毒、無害、無殘留的特點[18]。國外發(fā)達國家已廣泛將其應(yīng)用于環(huán)境殺菌消毒、食品行業(yè)、果蔬保鮮以及水質(zhì)凈化等方面，并頒布了相應(yīng)的法令和法規(guī)[19]。近年來，我國也出臺了關(guān)于二氧化氯在各行業(yè)使用的相關(guān)標準，并大力推廣應(yīng)用。二氧化氯作為消毒劑也逐步應(yīng)用于蠶桑產(chǎn)業(yè)，黃旭華等[20]將二氧化氯應(yīng)用于桑葉表面消毒并取得良好效果。

脂肪酸及其部分衍生物天然存在于許多動植物體內(nèi)，因此天然脂肪酸及其部分衍生物在小劑量下一般無毒無害，也不會對環(huán)境產(chǎn)生任何污染，大部分脂肪酸被美國FDA認證為GRAS。國外對脂肪酸及其衍生物的抑菌作用研究較早，已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)藥等領(lǐng)域[21-22]。

隨著社會的發(fā)展，人們越來越關(guān)注食品健康和環(huán)境安全問題。逐步淘汰高毒、高風(fēng)險的農(nóng)藥，開發(fā)綠色高效的替代產(chǎn)品將成為農(nóng)業(yè)未來的發(fā)展方向。本研究選擇了10種綠色藥劑開展桑椹菌核病的防治試驗，結(jié)果表明，在田間環(huán)境下，香芹酚和二氧化氯對桑椹菌核病沒有防治效果，而脂肪酸對桑椹菌核病的相對防治效果僅為4.08%～46.93%。由此說明，這些新型綠色防控藥劑比傳統(tǒng)化學(xué)藥劑相對安全，但尚未達到理想的防效。因此，如何提高新型綠色藥物的防效還有待進一步研究。當前，對桑椹菌核病的防控重點是圍繞病害的發(fā)生規(guī)律采取措施，除了通過藥物殺滅病原菌外，還可從切斷其傳播途徑以及控制環(huán)境等方面入手，通過多種手段協(xié)同控制桑椹菌核病的發(fā)生和減輕危害。