寄生桑樹(shù)的粗毛纖孔菌母種培養(yǎng)基最佳碳源和氮源篩選

宋洪燕 郭 光 任鵬飛 韓建東 宮志遠(yuǎn)

(1山東省蠶業(yè)研究所，山東煙臺(tái) 264002； 2山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，山東濟(jì)南 250100)

粗毛纖孔菌俗名粗毛黃孔菌或粗毛黃褐孔菌，按照現(xiàn)代分類(lèi)系統(tǒng)該菌屬于擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、銹革孔菌目(Hymenochaetales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、纖孔菌屬(Inonotus)[1]。該菌以寄生為主，寄主有楊樹(shù)、水曲柳、榆樹(shù)、日本槐和桑樹(shù)等，是一種生長(zhǎng)在溫帶的木腐菌，主要生長(zhǎng)在活立木，偶見(jiàn)長(zhǎng)于倒木上。經(jīng)專(zhuān)家考證，粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)即為古代中藥“桑黃”[2-3]，含有豐富的多糖、多酚、三萜以及多種活性物質(zhì)[4-8]，是一種十分珍貴的藥用真菌，具有抗腫瘤[9]、降血糖[10]、降血脂[11]、抗病毒[12]、抗炎[13]、活血化瘀[14-15]、保肝[16]、免疫活性[17]、抗氧化和抑菌活性[18]等藥理作用。

食用菌母種培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室及菌種生產(chǎn)部門(mén)保存菌種的關(guān)鍵，同時(shí)還是生產(chǎn)上制備原種的重要依據(jù)[19]；因此，為了明確粗毛纖孔菌生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，了解其營(yíng)養(yǎng)特性，本試驗(yàn)研究了母種培養(yǎng)基中不同碳、氮源對(duì)粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響，旨在為粗毛纖孔菌的規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 粗毛纖孔菌，采自山東夏津黃河故道古桑樹(shù)群，保存于山東省蠶業(yè)研究所。

1.1.2 主要試劑 選用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉5種常用碳源，蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸銨、大豆粉5種常用氮源，以及磷酸二氫鉀、硫酸鎂、瓊脂、新鮮馬鈴薯。其中，葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂，分析純，均為天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乳糖、蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉，生物試劑，均為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蔗糖，分析純，上海展云化工有限公司產(chǎn)品；瓊脂，生物試劑，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；馬鈴薯、大豆粉，均為市售成品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 1 000 mL、250 mL三角瓶，四川蜀牛玻璃儀器有限公司產(chǎn)品；直徑7 cm一次性塑料平板培養(yǎng)皿，比克曼生物科技有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；玻璃試管，四川蜀牛玻璃儀器有限公司產(chǎn)品；5D Mark Ⅲ佳能數(shù)碼相機(jī)，佳能(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；美的26 cm不銹鋼蒸鍋、C21-Simple103美的電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司產(chǎn)品；LQ-C5003電子天平，昆山優(yōu)科維特電子科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)基的制作

1.2.1 PDA斜面培養(yǎng)基 逐一稱取去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g。將去皮馬鈴薯切小塊加蒸餾水蒸煮20～30 min，4層紗布趁熱過(guò)濾，取濾液，加入葡萄糖、瓊脂混合均勻，用1 000 mL三角瓶加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻，倒入玻璃試管，硅膠塞封口，10支1組，用牛皮紙包裹，橡皮筋捆綁好，放入壓力蒸汽滅菌器中滅菌，溫度為121 ℃，時(shí)間為20～25 min。滅菌結(jié)束后將試管取出，傾斜45°放置制成斜面培養(yǎng)基，冷卻后待用。

1.2.2 CPDA平板培養(yǎng)基 逐一稱取去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g。蒸煮、定容按1.2.1項(xiàng)進(jìn)行，分裝至250 mL三角瓶進(jìn)行滅菌，方法同1.2.1項(xiàng)，滅菌結(jié)束后在無(wú)菌凈化工作臺(tái)制成平板培養(yǎng)基。

1.2.3 碳源供試平板培養(yǎng)基 蛋白胨5 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，待加入不同碳源滅菌、澆制，制作方法同1.2.2項(xiàng)。

1.2.4 氮源供試平板培養(yǎng)基 葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂20 g，待加入不同氮源后滅菌、澆制，制作方法同1.2.2項(xiàng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 將粗毛纖孔菌菌種從4 ℃冰箱中取出后，28 ℃下恒溫放置1 d，在無(wú)菌條件下把活化菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)3～4 d后挑取菌絲生長(zhǎng)前端，轉(zhuǎn)接于CPDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃下恒溫培養(yǎng)12 d左右，待菌絲長(zhǎng)滿平板作為試驗(yàn)種備用。

1.3.2 碳源篩選試驗(yàn) 將相同質(zhì)量(20 g)葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉5種碳源分別加入碳源供試培養(yǎng)基，進(jìn)行碳源篩選試驗(yàn)，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.3 氮源篩選試驗(yàn) 將相同質(zhì)量(5 g)蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸銨、大豆粉5種氮源分別加入氮源供試培養(yǎng)基，進(jìn)行氮源篩選試驗(yàn)，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 接種 在無(wú)菌凈化工作臺(tái)上，用直徑5 mm的打孔器將活化后的粗毛纖孔菌菌種取相同菌齡的菌塊，每個(gè)平板培養(yǎng)基接種1塊于中心位置，用封口膜封住，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)7 d，取出，測(cè)量菌落面積，并觀察記錄菌絲生長(zhǎng)勢(shì)。菌絲生長(zhǎng)勢(shì)用致密、密實(shí)、細(xì)密、稀疏表示，為依次減弱順序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

為減少測(cè)量試驗(yàn)誤差，本試驗(yàn)采用7日菌落生長(zhǎng)面積代替常用的每日測(cè)量菌落直徑求平均值的方法作為分析指標(biāo)。菌落面積測(cè)量采用Image J軟件分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel2013和SPSS20.0 軟件進(jìn)行分析，多重比較采用Tukey HSD檢驗(yàn)法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同碳源對(duì)粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響情況

從圖1和表1可以看出，在相同培養(yǎng)條件下，粗毛纖孔菌菌絲在5種碳源培養(yǎng)基上都可以生長(zhǎng)，但菌絲生長(zhǎng)情況存在明顯不同，各處理間差異較大，這說(shuō)明粗毛纖孔菌對(duì)碳源的利用是有選擇性的。從本次試驗(yàn)中得出，在相同培養(yǎng)條件下，果糖培養(yǎng)基上該菌種的菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)(顏色呈淺黃色，菌絲邊緣生長(zhǎng)整齊，菌絲致密)，7日菌落生長(zhǎng)面積最大，達(dá)1 063.827 mm2，與葡萄糖(615.641 mm2)、蔗糖(673.514 mm2)、乳糖(130.482 mm2)、可溶性淀粉(100.517 mm2)等其他4種碳源相比呈極顯著差異。由此得出，在相同培養(yǎng)條件下，適宜粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源是果糖。

C1、C2、C3、C4、C5分別表示葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、可 溶性淀粉等不同碳源培養(yǎng)基，N1、N2、N3、N4、N5分別表示 蛋白胨、酵母浸粉、牛肉粉、硫酸銨、大豆粉等不同氮源 培養(yǎng)基。圖1 不同碳源和氮源粗毛纖孔菌接種7日菌落生長(zhǎng)圖

表1 不同碳源對(duì)粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響情況

2.2 不同氮源對(duì)粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響情況

從圖1和表2可以看出，在選用的5種氮源中，除大豆粉培養(yǎng)基沒(méi)有菌絲生長(zhǎng)外，粗毛纖孔菌在其他4種氮源培養(yǎng)基上都能生長(zhǎng)，說(shuō)明粗毛纖孔菌在有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但仍存在較大差異。從本次試驗(yàn)中得出，在相同培養(yǎng)條件下，粗毛纖孔菌在酵母浸粉培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)(顏色呈奶白色，菌絲邊緣生長(zhǎng)整齊，菌絲致密)，7日菌落生長(zhǎng)面積最大，達(dá)1 433.617 mm2，與蛋白胨(439.455 mm2)、牛肉粉(421.839 mm2)、硫酸銨(413.320 mm2)等其他3種氮源相比呈極顯著差異。由此得出，在相同培養(yǎng)條件下，適宜粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)的最佳氮源是酵母浸粉。

表2 不同氮源對(duì)粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)的影響情況

3 小結(jié)與討論

針對(duì)本次試驗(yàn)使用的碳源和氮源，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室常用的試劑中選擇了單糖(葡萄糖、果糖)、雙糖(蔗糖、乳糖)、多糖(可溶性淀粉)作為碳源。在碳源單因素試驗(yàn)中，粗毛纖孔菌對(duì)果糖的利用成績(jī)最好，這可能與該菌株具有對(duì)單糖分解更為快速的酶和途徑有關(guān)，劉鑫等[20]對(duì)寄生棗樹(shù)的粗毛纖孔菌研究獲得相近的結(jié)果。在氮源單因素試驗(yàn)中，粗毛纖孔菌對(duì)有機(jī)氮源的利用結(jié)果要好于無(wú)機(jī)氮源，這可能與有機(jī)氮源中營(yíng)養(yǎng)成分比較全面，從而更有利于粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)[21-23]有關(guān)。在評(píng)價(jià)菌絲生長(zhǎng)勢(shì)的指標(biāo)中，菌絲顏色呈現(xiàn)奶白色和淺黃色2種，宋永學(xué)等[24]試驗(yàn)得出粗毛纖孔菌母種菌絲顏色在一定程度上可體現(xiàn)菌絲的活力、顏色越淺活力越強(qiáng)的結(jié)論，正好與本試驗(yàn)吻合；因此，綜合本試驗(yàn)結(jié)果得出，適宜粗毛纖孔菌菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源和最佳氮源分別是果糖和酵母浸粉。

本次試驗(yàn)選用的碳、氮源是實(shí)驗(yàn)室常用試劑，為達(dá)到試驗(yàn)的客觀合理性，每種物質(zhì)的添加量設(shè)計(jì)為同一水平，究竟選出的碳、氮源添加的最適量是多少，以及用此制成的母種培養(yǎng)基在進(jìn)行子實(shí)體栽培時(shí)是否會(huì)出現(xiàn)極好的產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)，還有待我們今后進(jìn)一步研究。