新疆地區(qū)3株驢源馬鏈球菌馬亞種新SeM基因型的鑒定與進化分析

杜 宇，蒲小峰，陳曉萌，呂芬芬，汪 麗，張澤華，張寶江，蘇 艷

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

馬鏈球菌馬亞種(Streptococcussubsp.equi，S.equi)可引起的馬屬動物急性、高度接觸性傳染病腺疫，主要臨床特征為發(fā)熱、上呼吸道發(fā)炎、頜下淋巴結(jié)腫脹等[1]。該病呈世界性分布[2-3]，已成為危害全球馬驢養(yǎng)殖業(yè)的典型細菌性傳染病，目前流行呈上升趨勢，已造成嚴重經(jīng)濟損失[4]。

由于S.equi的血清型眾多且不同血清型菌株之間缺乏有效的交叉保護。M蛋白是S.equi的重要毒力因子之一，研究證實SeM基因的N端存在一個多變區(qū)，來自免疫系統(tǒng)的壓力使得該區(qū)域不斷發(fā)生突變，該區(qū)域進行的遺傳進化分析有利于分析菌株的流行動態(tài)[5-6]。近年來16S rRNA 及SeM基因分型方法不僅可在全球數(shù)據(jù)庫中進行比對，為該菌進化研究和流行病學研究提供了一種簡便可行的方法[7-8]，還對促進疫苗研究具有重要的意義。

2018年山東省暴發(fā)驢腺疫后鑒定了SeM 136基因型，這是我國對驢腺疫的首次報道[9]。劉延麟[10]對9個省份年采集667份驢腺疫病樣證實SeM 136基因型廣泛流行于我國8個省。目前我國對驢源馬鏈球菌馬亞種SeM基因型報道較少。本研究對新疆地區(qū)分離鑒定的3株驢腺疫鏈球菌，利用16S rRNA序列進行位點多態(tài)性及系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析，其次進行SeM基因型的鑒定和多態(tài)性分析，從而了解和掌握新疆地區(qū)驢腺疫臨床分離株的基因型流行分布及變異特點，為驢腺疫的有效防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

測試的樣品菌株來自新疆地區(qū)某驢場腺疫病驢，采集驢頜下淋巴結(jié)組織樣本，由新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物實驗室分離、鑒定并保存。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒、E.coliDH5α 均購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂粉、肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨、細菌菌生化反應管、營養(yǎng)瓊脂、藥敏試紙購自杭州濱和微生物試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 分離培養(yǎng)及生化試驗

采集的病樣劃線培養(yǎng)于鮮血培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)及溶血，將分離純化的細菌進行革蘭染色，在顯微鏡下觀察形態(tài)特征。取分離菌的純培養(yǎng)物接種于細菌微量生化反應管，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，記錄生化反應結(jié)果。

1.4 藥物敏感性試驗

采用紙片瓊脂擴散法：取純培養(yǎng)菌液均勻涂布于MH平板，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，按照國家行業(yè)標準(抗菌藥物敏感性試驗的技術要求WS/T 639—2018)判定標準進行判定(S為敏感，I為中度敏感，R為耐藥)。

1.5 細菌16S rRNA基因擴增及序列分析

細菌16S rRNA基因擴增的上游引物16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物16S-R:5′-ACCTGTCACCCGATGTACCGAA-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的分離株基因DNA為模板進行PCR擴增，設定PCR反應體系：TaqDNA聚合酶0.4 μL，10×TaqPCR緩沖液5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)8 μL， DNA模板1.5 μL,上、下游引物各1 μL，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察后進行測序。測序結(jié)果經(jīng)Blast檢索后，將分離菌株的16S rRNA序列與同屬不同細菌在GenBank中的相關序列進行比對，選取參考序列，采用MEGA 6.0 中的NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 分離菌株SeM基因擴增及序列分析

分離菌SeM基因擴增的上游引物SeM-F：5′-TCTTTGCGTTTAGGAGACA-3′；下游引物SeM-R：5′-AGCATCAGAAAACTAAGTGC-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以提取的分離株基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系同上；PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳觀察后測序。測序后的SeM基因序列與同亞種不同細菌在GenBank中的相關序列進行比對，選取參考序列采用MEGA 6.0中的NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并根據(jù)PubMLST-SEM數(shù)據(jù)庫鑒定分離菌株的基因型。將分離菌株SeM蛋白N端氨基酸序列與GenBank中參考菌株進行對比。

2 結(jié) 果

2.1 分離菌株形態(tài)與菌落特征

采集的病樣分離到3株可疑菌落HTP133、HTP123和HTP232，37 ℃培養(yǎng)18 h后在鮮血培養(yǎng)基上長出半透明、濕潤的β溶血型小菌落(圖1A)。經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡下可觀察到革蘭陽性、橢圓或圓形、鏈狀排列的菌體(圖1B)。

圖1 分離菌株菌落形態(tài)(A)及革蘭染色形態(tài)(B)Fig.1 Colony morphology(A) and morphology by Gram staining(B) of isolates

2.2 細菌生化試驗

3株分離菌株(HTP232、HT123、HTP133)對吡咯烷酮、曲美他嗪、精氨酸、蔗糖、甲基丙烯酰基和七葉苷試驗結(jié)果為陽性，對二苯基膦、蕈糖、山梨醇、葡磷、乳糖試驗的結(jié)果為陰性(表1)，3株菌對髓磷脂連接糖和曲美他嗪的試驗結(jié)果有差異。該結(jié)果與已知的馬鏈球菌馬亞種的主要生化反應特性相符。

表1 分離菌株生化試驗

2.3 藥物敏感性

3株分離菌株(HTP232、HT123、HTP133)對21種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果顯示(表2)，分離菌株均對阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢西丁、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、克拉霉素、多西環(huán)素、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、磺胺異口惡唑、磺胺嘧啶鈉、利福平、克林霉素、土霉素、四環(huán)素及左氧氟沙星敏感，對頭孢呋辛及青霉素耐藥。其中HTP123對頭孢噻呋及四環(huán)素為中度敏感。

2.4 細菌16S rRNA基因擴增

以分離菌株基因組DNA為模板進行16S rRNA基因的PCR擴增，電泳鑒定結(jié)果顯示擴增到約為1 000 bp(圖2)的條帶，與預期結(jié)果大小一致。

表2 分離菌株藥物敏感性試驗結(jié)果

1.陰性對照; 2.HTP133; 3.HT123; 4.HTP232; M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準1.Negative control; 2.HTP133; 3.HT123; 4.HTP232; M. DL2000 DNA marker圖2 分離菌株16S rRNA基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA gene of isolates

2.5 分離菌株16S rRNA序列分析

基于3株分離株16S rRNA基因序列進行的比較和構建的遺傳進化樹，分離菌及相關參考菌株分為6組(GroupⅠ、GroupⅡ、GroupⅢ、GroupⅣ、GroupⅤ及GroupⅥ)，分離菌所歸屬于第Ⅰ群，馬鏈球菌馬亞種(S.equi)，第Ⅱ、Ⅲ群為馬鏈球菌獸疫亞種(S.zooepidemicus)；第Ⅳ群為犬鏈球菌(S.canis)，第Ⅴ群為豬鏈球菌(S.suis)和第Ⅵ群為類馬鏈球菌(S.equiuns)(圖3)，Ⅰ群在V5可變區(qū)具有特征性的序列，遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)本研究分離株與中國分離株JQ726493株親緣關系較近(圖4)。

2.6 細菌SeM基因擴增

以分離菌株的基因組DNA為模板進行SeM基因的PCR擴增，檢測擴增到大約1 560 bp的條帶，與預期結(jié)果大小一致(圖5)。

2.7 分離菌株SeM基因型及親緣關系分析

基于SeM基因序列結(jié)合SeM數(shù)據(jù)庫鑒定分離的3株菌發(fā)現(xiàn)了二個新SeM基因型，分別為SeM 210(HTP232)和SeM 211(HTP133、HTP123)。根據(jù)基于SeM基因序列進化樹圖可發(fā)現(xiàn)(圖6)，分離株SeM基因型與SeM 136、SeM 138、SeM 142、SeM 146、SeM 149、SeM 144遺傳進化關系較近，且發(fā)現(xiàn)這些基因型菌株均為驢源馬鏈球菌馬亞種，提示驢源菌株具有相似的SeM基因進化特征。

2.8 分離株與國際參考菌株SeM N端氨基酸序列的比較

本研究將分離菌株和馬鏈球菌馬亞種國內(nèi)外參考菌株進行SeM N端氨基酸比較分析后發(fā)現(xiàn)(表3)，3株分離株SeM 210(HTP232)和SeM 211(HTP133、HTP123)與參考菌株相比在SeM蛋白N端44Aa-143Aa之間存在9和10個氨基酸的差異，本研究鑒定的2種基因型SeM 210和SeM 211之間存在著3個氨基酸的差異。本次比較還發(fā)現(xiàn)驢源菌株在SeM N端47-127之間存在3個特征性氨基酸位點62位、81位和113Aa具有共同的氨基酸序列特征，不同于馬源菌株。

3 討 論

近年來，新疆地區(qū)驢集約化養(yǎng)殖規(guī)模發(fā)展迅速，驢腺疫的流行呈現(xiàn)明顯上升的趨勢[10-13]，給養(yǎng)驢業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失。S.equi的血清型眾多且不同血清型之間缺乏交叉免疫保護[14]，SeM進行基因分型是一種基于SeM的N端等位基因的分子流行病學研究方法，可實現(xiàn)跨區(qū)域和時間的細菌流行病學分析與監(jiān)測，彌補傳統(tǒng)血清學分型方法的局限性。目前對新疆地區(qū)驢腺疫分子流行病學的信息匱乏[15]，對地方分離株進行分子水平的遺傳進化分析和基因分型分析，可為該病的有效防控提供基礎性的依據(jù)。

▲表示本次分離菌株▲indicate the isolates in this study圖3 分離菌株及參考菌株16S rRNA基因可變區(qū)對比結(jié)果Fig.3 Sequence alignment of the variable region 16S rRNA gene of isolates and reference strains

16S rRNA基因可以揭示不同細菌種間的差異，該基因V2區(qū)可表現(xiàn)較顯著的差異[16]，本研究對3株新疆地方分離株進行16S rRNA基因為基礎的遺傳譜系分析。將3株S.equi分離株與獸疫鏈球菌、豬鏈球菌、犬鏈球菌和類馬鏈球菌的16S基因可變區(qū)序列進行對比分析，3株分離株與S.equi國際菌株V1-V5區(qū)差異不大，歸屬于進化Ⅰ群(馬鏈球菌馬亞種)，與新疆石河子2012年鑒定的馬源S.equiJQ726493親緣關系較近。

S.equi可產(chǎn)生具有抗吞噬活性的SeM蛋白，該蛋白位于菌體表面，可以結(jié)合纖維蛋白原IgG[17]。由于在進化過程中該菌在外界環(huán)境和機體免疫的選擇壓力下，在該蛋白N端高度可變[6，18-19]，其N端第106-166位被認為是其高變區(qū)[20]。Ivens等[8]依據(jù)該方法對2011年英國的145株S.equi分離株進行分型，確定了該法可準確的評估該菌的分子流行特征。Dong等[9]于2019年報道從山東驢腺疫樣品中鑒定了SeM 136基因型，該基因型在2018年于山東省流行時被發(fā)現(xiàn)[5]，被認為是2018—2019年國內(nèi)驢腺疫的主要流行基因型。劉延麟對國內(nèi)多地菌株的分析表明，驢腺疫在國內(nèi)多地呈現(xiàn)出多種基因型的分布，發(fā)現(xiàn)了驢源菌株還存在SeM 138、SeM 142、SeM 144、SeM 145、SeM 146 及SeM 149[10]。

▲ 表示本次分離菌株▲ indicate the isolates in this study圖4 分離菌株16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene of isolated strains

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準; 1.陰性對照; 2.HTP232; 3.HT123; 4.HTP133M. DL2000 DNA marker; 1.Negative control; 2.HTP232; 3.HT123; 4.HTP133圖5 分離株SeM基因PCR擴增結(jié)果Fig.5 PCR amplification results of SeM gene of isolates

最近，有學者報道鑒定了4種不同的埃及馬源菌株基因型，其中2株(SeM 139和SeM141)與中國驢源菌株歸屬于相同的進化群，其余2種基因型(SeM 140和SeM 199)與歐洲流行的馬源菌株歸屬于相同遺傳進化群[21]。本研究對3株驢腺疫新疆地方株SeM基因進行了測序和分析，確定得到兩個新的SeM基因型(SeM 210、SeM 211)，不同于國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的驢源菌株的基因型。將本次鑒定得到兩種基因型與國內(nèi)其他地區(qū)鑒定的基因型比較發(fā)現(xiàn)，這兩種驢源基因型與驢源SeM 145遺傳距離較遠，而與其他國內(nèi)驢源基因型均親緣關系較近，這表明驢源S.equi的流行存在著變異與進化的特征，推測隨著集約化養(yǎng)殖過程中驢的頻繁調(diào)運和跨區(qū)引種還會導致更多新的基因型出現(xiàn)，今后有必要對不同年份基因型的變化規(guī)律和致病特性進行更深入的研究和分析。此外，對SeM基因庫中馬屬動物菌株的比較結(jié)果還表明,驢源菌株具有明顯的宿主適應的特點，與馬源菌株差異較大。

S.equiSeM基因變異不僅產(chǎn)生了新的SeM基因型，因其為該菌主要的抗原分子，因此變異也導致該菌的免疫逃避[18-20]。劉云濤等[22]在分析新疆地區(qū)馬鏈球菌馬亞種SeM氨基酸N端突變位點時，發(fā)現(xiàn)分離的馬源腺疫菌株SeM 的部分氨基酸存在較大差異。將驢源分離株與馬源分離株SeM氨基酸N端突變位點進行比對，結(jié)果顯示驢源S.equi菌株可在SeM基因N端62aa、81aa、113aa位點表現(xiàn)出驢源菌株的特征，推測這些位點氨基酸的差異可能是該菌適應不同宿主的基因特征，而我們根據(jù)從馬分離的與驢源菌株相同基因型的菌株SeM基因比較后未發(fā)現(xiàn)具有此特征。對驢源菌株SeM基因比較的結(jié)果還表明不同地區(qū)流行菌株也在氨基酸的變化方面表現(xiàn)出明顯的特征，如SeM基因N端61 aa、64 aa、70 aa、100 aa、103 aa、107 aa和125 aa處與其他驢源菌株不同。因此對分離菌株的基因型進行鑒定的比較分析，是對該菌監(jiān)測和溯源的重要方法之一。

Dong等[9]SeM 136基因型將SeM蛋白與參考菌株S.equi4047 的N端多變區(qū)進行對比，發(fā)現(xiàn)該驢源菌株與該馬源參考菌株在N端47-127位氨基酸位點之間共有8個氨基酸的差異，本研究分離菌SeM 211(HTP133、HTP123)與參考菌株S.equi4047比較，在N端47-127位氨基酸位點之間共有9個 氨基酸的差異，SeM 210(HTP232)共有10個氨基酸的差異。將驢源菌株SeM 136與本研究的2種 不同基因型驢源菌株SeM 210和SeM 211之間則有6個氨基酸在相同的位點發(fā)生變化(Aa 52、62、70、81、113、122)，本研究鑒定的2種基因型SeM 210和SeM 211之間存在著3個氨基酸的差異。此外，本次比較還發(fā)現(xiàn)驢源菌株在SeM N端47-127的62、81、和113Aa具有共同的氨基酸序列特征，不同于馬源菌株，推測由于受到驢運輸流動情況和宿主適應性等的影響導致這些驢源菌株SeM基因的變異和不同基因型共存的情況。

腺疫常用抗生素治療，以往認為青霉素是治療馬鏈球菌馬亞種引起腺疫的治療藥物[23]。本次試驗結(jié)果表明，分離的3株菌雖然還未出現(xiàn)多重耐藥，但均對青霉素和頭孢呋辛耐藥，對青霉素耐藥的結(jié)果與2019年周婷婷等[24]報道的馬源馬鏈球菌馬亞種結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

從新疆地區(qū)某驢場驢腺疫病例下頜組織中獲得了3株S.equi分離株HTP133、HTP123和HTP232，屬于該菌16S rRNA進化群中的Ⅰ群，與新疆地區(qū)以往分離鑒定的馬源S.equi菌株具有較近的進化關系。分離菌株SeM基因型分別鑒定為SeM 210和SeM 211，屬于國內(nèi)外首次報道的驢源S.equi分離株SeM基因型，這2種驢源基因型與驢源SeM 145遺傳距離較遠，而與其他國內(nèi)驢源基因型親緣關系均較近。本研究為驢腺疫發(fā)病病例的流行和傳播特征的分析提供了分子生物學的基礎數(shù)據(jù)。