蒙古斑點(diǎn)馬黑、白毛色區(qū)域皮膚中相關(guān)基因的表達(dá)研究

白東義，拉希瑪，趙若陽(yáng)，陶娜拉，韓海格，丁文淇，賈紫潔，劉慧瑩，王文興，黃博光，芒 來(lái)*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動(dòng)物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動(dòng)物研究中心，呼和浩特 010018； 2. 內(nèi)蒙古中蘊(yùn)馬產(chǎn)業(yè)集團(tuán)，錫林浩特 026000； 3.錫林郭勒盟鑲黃旗農(nóng)牧和科技局，鑲黃旗 013250)

內(nèi)蒙古自治區(qū)地域遼闊，草原面積廣，被世人譽(yù)為馬的故鄉(xiāng)，具有深厚的馬文化歷史淵源和文化底蘊(yùn)。目前有蒙古馬、阿巴嘎黑馬、錫尼河馬、鄂倫春馬、三河馬、錫林郭勒和科爾沁馬等品種。其中蒙古馬有烏珠穆沁馬、烏審馬、百岔鐵蹄馬和巴爾虎馬等優(yōu)良類(lèi)群[1-2]。蒙古馬起源于西伯利亞?wèn)|部草原，是世界上最古老的馬品種之一。蒙古馬經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的自然和人工選擇，形成了抗病力強(qiáng)、易增膘、掉膘慢、耐寒冷、耐粗飼、合群性好等特征。其體質(zhì)粗糙結(jié)實(shí)、體軀粗壯、體格較小、胸廓寬深、鬐甲明顯、肌肉豐滿、四肢較短而質(zhì)堅(jiān)實(shí)有力、被毛濃密、毛色復(fù)雜，常見(jiàn)的毛色有栗、騮、黑、青等，還有較特殊的海騮、鼠灰、兔褐、沙毛、花毛、斑點(diǎn)毛等。其中，斑點(diǎn)毛色的表型豐富多樣，有均勻分布在全身的斑點(diǎn)，也有位于背部的毯狀斑點(diǎn)，而且斑點(diǎn)的大小、形狀各不相同[3-4]。本研究以蒙古斑點(diǎn)馬為試驗(yàn)對(duì)象，基于以往對(duì)馬屬動(dòng)物毛色的研究基礎(chǔ)，將毛色表型與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，填補(bǔ)了蒙古馬毛色研究領(lǐng)域的新內(nèi)容。對(duì)多個(gè)與毛色相關(guān)的候選基因進(jìn)行分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和組織學(xué)鑒定，為今后蒙古斑點(diǎn)馬選育環(huán)節(jié)中對(duì)毛色的選擇提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣本 從內(nèi)蒙古自治區(qū)包頭市達(dá)茂旗購(gòu)置3匹具有典型斑點(diǎn)表型的雌性成年蒙古馬(圖1)，分別采集蒙古斑點(diǎn)馬軀體部位黑、白斑點(diǎn)區(qū)域皮膚組織樣品，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，在黑毛色皮膚區(qū)域和白毛色皮膚區(qū)域有一個(gè)漸變色的過(guò)程，因此，在采樣時(shí)采集黑色區(qū)域的中心區(qū)，即圖1中的綠色方框位置。在采集樣本時(shí)首先注射地拖嘧啶和布托啡諾對(duì)馬匹進(jìn)行麻醉，然后用手術(shù)刀割取黑、白色目標(biāo)區(qū)域各1 cm ×1 cm皮膚，然后對(duì)馬匹皮膚取樣處進(jìn)行沖洗、消毒和縫合。將采集獲得的樣本首先分割成2塊， 1塊 立即投入液氮存儲(chǔ)后轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。另1塊用 4% 的多聚甲醛固定24 h，然后乙醇梯度脫水至 100%無(wú)水乙醇溶液中，在4 ℃冰箱保存。

圖1 蒙古斑點(diǎn)馬斑點(diǎn)表型Fig.1 Spot phenotype of Mongolia spotted horse

1.1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備 輪式切片機(jī)、撈片機(jī)、烤片機(jī)(Leica，德國(guó))，通風(fēng)櫥、超純水系統(tǒng)(PALL，美國(guó))，精密天枰、熒光倒置顯微鏡(ZEISS，德國(guó))、顯微成像系統(tǒng)(IX73，奧林巴斯，日本)，真空泵、微波爐、移液器、多功能臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))，多功能酶標(biāo)儀(BIO-TEK，美國(guó))，多用電泳儀(BIO-TEK)，全能型成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))，移動(dòng)紫外燈、CFX96 Touch熒光定量PCR儀(Bio-Rad)、C1000 Touch梯度PCR儀(Bio-Rad)、凝膠成像儀(Bio-Rad)、高壓滅菌鍋(TOMY)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(EPPENDORF)、切片盒、濕盒、暗盒、染色缸、甘油、一次性吸管、透明指甲油、搖床、數(shù)據(jù)中心服務(wù)器等。

1.1.3 主要試劑與耗材 TRIzol(Invitrogen，美國(guó))、Rnase-free ddH2O(天根，北京)、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems，美國(guó))、SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ (TaKaRa，日本)、氯仿(國(guó)藥)、核酸染料(北京天根，中國(guó))、異丙醇(國(guó)藥)、無(wú)水乙醇(國(guó)藥)、96孔板光學(xué)貼膜(ABI)、PCR 用96孔板(axygen)、多聚甲醛(sigma，美國(guó))、高效切片石蠟(56～58 ℃，58～60 ℃， Leica，德國(guó))、蘇木素(GHS116-500ML，Sigma，美國(guó))、伊紅(HT110116-500ML，Sigma，美國(guó))、碳酸鋰(V900124-500G， Sigma，美國(guó))、濃鹽酸(中國(guó))、二甲苯(天津科茂，中國(guó))、無(wú)水乙醇(天津科茂，中國(guó))、95%乙醇(利爾康，中國(guó))、75%乙醇(山東安捷高科，中國(guó))、丙三醇(天津北宏，中國(guó))、顯微鏡蓋玻片(世泰，中國(guó))、黏附載玻片(世泰，中國(guó))、顯微鏡載玻片(美韋德，中國(guó))、一次性切片刀片(Leica，德國(guó))、組織包埋盒(世泰，中國(guó))、PBS緩沖液、羊血清、DAPI，一抗：Anti-TYR antibody(Abcam)、Anti-TYRP1 antibody(Abcam)、 Anti-DCT antibody(Abcam)、Anti-CD34 antibody(Abcam)、Anti-MiTF antibody(Abcam)、Anti-hair cortex Cytokeratin/K40 antibody [AE13] (Abcam)；二抗： goat anti rabbit IgG(Jackson,美國(guó))、goat anti mouse IgG(Jackson,美國(guó))等。

1.1.4 主要使用的軟件與網(wǎng)站 MobaXterm_Personal_10.9、Cutadapt1.10、FastQC 0.10.1、Tophat & HISAT 2.0、StringTie 1.3、RStudio、R x64 3.5.3、DESeq2、Cuffmege、Cuffdiff、Cufflinks、FileZilla、TBtools、Notepad++、NCBI(National Center for Biotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)、GO(Gene Ontology，http://www.geneontology.org)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http://www.genome.jp/kegg/)

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 石蠟切片及HE染色 為觀察蒙古斑點(diǎn)馬黑毛色區(qū)域和白毛色區(qū)域皮膚的表型信息，對(duì)黑、白毛色區(qū)域皮膚進(jìn)行了石蠟包埋和組織切片制作，具體步驟如下：將梯度脫水后的皮膚組織使用二甲苯和石蠟進(jìn)行透明、過(guò)渡、包埋，蠟塊經(jīng)過(guò)修整和冷卻后，使用切片機(jī)縱切皮膚毛囊組織得到厚度7 μm的切片，經(jīng)撈片和烘片得到黑毛色區(qū)域和白毛色區(qū)域皮膚組織切片。使用二甲苯對(duì)切片脫蠟，經(jīng)過(guò)梯度水化后，使用蘇木素和伊紅進(jìn)行染色，最后經(jīng)過(guò)脫水和二甲苯清洗，使用中性樹(shù)膠封片，晾干后在顯微鏡下觀察HE染色結(jié)果。

1.2.2 RNA-seq文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 從各樣品中取3 μg提取總RNA用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)。建庫(kù)及后續(xù)測(cè)序工作在安諾優(yōu)達(dá)基因科技(北京)有限公司完成。首先，對(duì)總RNA 進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，并將RNA片段化(平均片段長(zhǎng)度約為350 nt)；其次，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，末端修復(fù)，加堿基A及測(cè)序接頭，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并回收大小為 450～500 bp 左右的目的片段;其后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化，質(zhì)檢篩選片段大小為450～500 bp左右的文庫(kù)，從而完成整個(gè)文庫(kù)制備工作;最后，將構(gòu)建好的文庫(kù)使用 Iumina NextSeq500進(jìn)行測(cè)序

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析 利用比對(duì)軟件，將獲得的原始測(cè)序序列比對(duì)到馬參考基因組序列上，并且進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，分析流程如下:1)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測(cè)及分布：從Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng) CASAVA 軟件進(jìn)行堿基識(shí)別后轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(raw reads)，以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。隨后對(duì)堿基測(cè)序錯(cuò)誤率和堿基含量進(jìn)行了檢測(cè)和評(píng)估。2)測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾：對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行以下幾個(gè)方面的過(guò)濾，最終得到高質(zhì)量的clean reads:去除接頭污染的 reads→去除低質(zhì)量的 reads→去除含 N 比例大于 5%的reads→去除與核糖體 RNA 匹配的reads。3)基因組比對(duì)分析：采取HiSAT2軟件將過(guò)濾后的RNA-seq數(shù)據(jù)同馬參考基因組(EquCab3.0)進(jìn)行比對(duì)分析。隨后根據(jù)序列的比對(duì)信息，分別統(tǒng)計(jì)比對(duì)到外顯子、內(nèi)含子和基因間區(qū)的序列數(shù)，繪制出唯一比對(duì)序列在參考基因組基因各區(qū)域的分布。4)轉(zhuǎn)錄本組裝：轉(zhuǎn)錄本拼接采用StringTie拼接軟件完成。StringTie是利用 RNA-Seq 比對(duì)結(jié)果快速組裝轉(zhuǎn)錄本并預(yù)計(jì)表達(dá)水平的軟件。StringTie先將 reads分為不同的類(lèi)，然后再針對(duì)每個(gè)類(lèi)的 reads生成一個(gè)拼接圖確定轉(zhuǎn)錄本，之后每個(gè)轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生一個(gè)流型神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的最大流算法來(lái)評(píng)估表達(dá)水平，將復(fù)雜的數(shù)據(jù)集組裝成轉(zhuǎn)錄本。5)表達(dá)量差異表達(dá)分析統(tǒng)計(jì)及聚類(lèi)分析：mRNA的表達(dá)量利用Countreads進(jìn)行歸一化處理；利用DEseq2進(jìn)行差異表達(dá)分析，并選取P<0.01和log2| fold change | >1作為有效差異表達(dá)的篩選條件，得出上、下調(diào)基因個(gè)數(shù)。6)差異表達(dá) mRNAs 功能富集分析：以得到的差異表達(dá)mRNAs作為背景，分別進(jìn)行GO注釋和KEGG富集分析。

1.2.4 RT-qPCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組mRNA數(shù)據(jù) 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果篩選了3個(gè)(TYR、TYRP1、DCT)與毛囊發(fā)育及色素合成相關(guān)的差異表達(dá)基因，通過(guò)NCBI中GenBank檢索馬的TYR、TYRP1和DCT基因序列，利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)功能設(shè)計(jì)特異性引物(表1)并選擇GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，后將設(shè)計(jì)好的引物送Invitrogen公司合成。對(duì)皮膚組織提取的總RNA 按照HiScript?III 1 st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR是采用SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，Bulk。cDNA中添加引物和熒光酶根據(jù)說(shuō)明書(shū)反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。

表1 引物列表

1.2.5 蒙古斑點(diǎn)馬TYR、TYRP1和DCT基因蛋白定位 對(duì)皮膚組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，試驗(yàn)流程依據(jù)UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒說(shuō)明書(shū)制定。切片經(jīng)過(guò)脫蠟水化處理，PBS(pH 7.2～7.4)沖洗后滴加正常非免疫動(dòng)物血清，室溫孵育30 min；PBS沖洗后滴加第一抗體分別為：Anti-TYR antibody(Abcam)、Anti-TYRP1 antibody(Abcam)、 Anti-DCT antibody(Abcam)，4 ℃濕盒孵育24 h；PBS沖洗后滴加熒光二抗goat anti rabbit IgG(Jackson,美國(guó))、goat anti mouse IgG(Jackson，美國(guó))，暗盒孵育2 h；PBS沖洗加DAPI后將片子放置于暗盒孵育10 min；PBS沖洗后用甘油封片。

2 結(jié) 果

2.1 蒙古斑點(diǎn)馬體軀黑、白皮膚區(qū)域表型采集

蒙古斑點(diǎn)馬皮膚組織石蠟切片經(jīng)過(guò)HE染色結(jié)果顯示，蒙古斑點(diǎn)馬皮膚毛囊結(jié)構(gòu)完整，可以清晰地觀察到毛囊的毛乳頭、毛母質(zhì)、毛干、內(nèi)根鞘和外根鞘等。其中，黑色被毛對(duì)應(yīng)的皮膚組織表皮處有明顯的黑色素沉積。毛囊的毛乳頭、毛母質(zhì)部位同樣有黑色素沉積(圖2A)。而白色被毛對(duì)應(yīng)的皮膚組織表皮處、毛囊的毛乳頭和毛母質(zhì)部位均無(wú)黑色素沉積(圖2B)。此外，通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，蒙古斑點(diǎn)馬黑色被毛皮膚組織和白色被毛皮膚組織的毛囊長(zhǎng)度、毛囊密度以及毛乳頭寬度均無(wú)顯著差異(圖3)。

綠色箭頭所指部位是毛球部The green arrow points to the position of hair bulb圖2 蒙古斑點(diǎn)馬毛囊形態(tài)及色素分布Fig.2 The hair follicle morphology and pigment distribution in Mongolian spotted horses

圖3 黑色被毛皮膚組織和白色被毛皮膚組織的毛囊表型比較Fig.3 Comparison of hair follicle phenotype between black and white skin tissues of Mongolian spotted horse

2.2 蒙古斑點(diǎn)馬體軀黑、白區(qū)域皮膚轉(zhuǎn)錄組比較

蒙古斑點(diǎn)馬6個(gè)RNA 測(cè)序文庫(kù)總共獲得約512 M(million)原始讀段(raw reads)。其中，6個(gè)RNA測(cè)序文庫(kù)各獲得82 027 190、91 580 266、93 635 418、 74 062 856、78 684 708、92 543 100條原始下機(jī)reads，除去低質(zhì)量的reads 和接頭污染以及其他污染，最終獲得約500 M(million)有效數(shù)據(jù)(valid data)，分別為80 057 270、89 617 730、91 562 830、 72 442 634、76 848 028、90 466 312 條高質(zhì)量的reads。從測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量結(jié)果來(lái)看，總Q20的比例均99.99%，總Q30的比例在98.02%～98.69%之間，總GC含量在43～44%之間(表1)?？梢哉f(shuō)明本研究中的測(cè)序數(shù)據(jù)堿基讀取的準(zhǔn)確率較高。

表2 蒙古斑點(diǎn)馬RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)控

利用DEseq2軟件對(duì)蒙古斑點(diǎn)馬黑色和白色皮膚組織文庫(kù)中的所有 mRNA進(jìn)行顯著性差異分析(圖4)，利用DESeq2軟件對(duì)兩個(gè)部位之間對(duì)比進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用Benjamini-Hochberg法校正P值小于0.05，log2|fold change| 值大于 1作為有效差異表達(dá)的閾值。共鑒定出740個(gè)基因的表達(dá)量在黑、白兩個(gè)不同顏色皮膚組織中存在顯著差異(P<0.05)，其中109個(gè)基因在蒙古斑點(diǎn)馬黑色皮膚組織表達(dá)量較高，215個(gè)基因在蒙古斑點(diǎn)馬白色皮膚組織表達(dá)量較高。

圖4 差異基因統(tǒng)計(jì)圖Fig.4 Scatter plot of differentially expressed genes

利用R語(yǔ)言的GOseq包進(jìn)行差異表達(dá)基因GO富集分析，選取P<0.05的GO條目。使用KOBAS軟件(http://www.genome.jp/kegg/)來(lái)實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因在KEGG通路中的富集統(tǒng)計(jì)。通過(guò)將差異表達(dá)基因同GO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，找出顯著富集的GO Term。本研究對(duì)蒙古斑點(diǎn)馬黑色皮膚組織間差異表達(dá)的109個(gè)基因進(jìn)行了GO注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的109個(gè)基因被注釋到26條 顯著GO通路上，其中注釋到生物過(guò)程中的13條 通路 上，在細(xì)胞組成被注釋到7條通路上，在分子功能被注釋到6條通路上。差異表達(dá)基因及GO通路富集到的GO term分別為melanosome(黑素體)，melanosome membrane(黑素體膜)，integral component of membrane(膜的組成部分)，structural constituent of muscle(肌肉的結(jié)構(gòu)成分)，actin binding(肌動(dòng)蛋白結(jié)合)，protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity(蛋白質(zhì)酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性)，motor activity(運(yùn)動(dòng)活動(dòng))，melanosome organization(黑素體組織)，cellular response to lipopolysaccharide(細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng))，melanin biosynthetic process(黑色素生物合成過(guò)程)，developmental pigmentation(發(fā)育性色素沉著)，response to interferon-gamma(對(duì)γ干擾素的反應(yīng))，muscle contraction(肌肉收縮)，sarcomere organization(肌節(jié)組織)，cardiac muscle tissue morphogenesis(心肌組織形態(tài)發(fā)生)，myofibril assembly(肌原纖維組裝)，skeletal muscle contraction(骨骼肌收縮)，protein ubiquitination(蛋白質(zhì)泛素化)，striated muscle contraction(橫紋肌收縮)，skeletal muscle fiber development(骨骼肌纖維發(fā)育)，calcium ion binding(鈣離子結(jié)合)，oxidoreductase activity(氧化還原酶活性)，structural constituent of muscle(肌肉的結(jié)構(gòu)成分)，actin binding(肌動(dòng)蛋白結(jié)合)，protein tyrosine/serine/threonine phosphatase activity(蛋白質(zhì)酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性)。

為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因，本研究對(duì)蒙古斑點(diǎn)馬差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG分析。結(jié)果顯示，蒙古斑點(diǎn)馬顯著富集的通路有11個(gè)(P<0.05)，這些通路分別為T(mén)yrosine metabolism(酪氨酸代謝)，Hematopoietic cell lineage(造血細(xì)胞譜系)，Toll-like receptor signaling pathway(Toll樣受體信號(hào)通路)，Melanogenesis(黑色素生成)，TNF signaling pathway(TNF信號(hào)通路)，Calcium signaling pathway(鈣信號(hào)通路)，Insulin secretion(胰島素分泌)，Adrenergic signaling in cardiomyocytes(心肌細(xì)胞中的腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo))，Glycolysis / Gluconeogenesis(糖酵解/糖異生)，Oxytocin signaling pathway(催產(chǎn)素信號(hào)通路)，cGMP-PKG signaling pathway(cGMP-PKG信號(hào)通路)。

對(duì)通過(guò)差異表達(dá)分析篩選到的蒙古斑點(diǎn)馬黑、白區(qū)域皮膚組織中的差異基因做出韋恩圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蒙古斑點(diǎn)馬109個(gè)基因在黑色皮膚組織中表達(dá)，215個(gè) 基因在白色皮膚中表達(dá)(圖5)。

圖5 蒙古斑點(diǎn)馬黑、白皮膚組織mRNA差異表達(dá)韋恩圖Fig.5 Venn diagram of differential expressed mRNAs in black and white skin tissues of Mongolian spotted horse

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的有效性，本研究測(cè)定了對(duì)黑白色皮膚組織中的差異表達(dá)基因TYR、TYRP1和DCT的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示PCR表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序表達(dá)趨勢(shì)一致(圖6)，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

圖6 黑、白皮膚組織中TYR、TYRP1和DCT基因qRT-PCR結(jié)果Fig.6 The qRT-PCR results of TYR，TYRP1 and DCT in black and white skin tissues

2.4 蒙古斑點(diǎn)馬TYR、TYRP1和DCT基因蛋白定位

為了進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)文獻(xiàn)中總結(jié)的和本試驗(yàn)中篩選到的與黑色素形成相關(guān)的基因進(jìn)行免疫熒光驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示(圖7、圖8)，TYR和TYRP1蛋白在毛囊的毛球部位沒(méi)有信號(hào)，而DCT蛋白在毛囊毛球的毛母質(zhì)位置有信號(hào)(圖9)。

圖A含黑色素毛囊，圖B不含色素毛囊，圖中黃色箭頭所指的位置是毛囊的毛球位置。下同Picture A contains black pigmented hair follicles and picture B does not contain pigmented hair follicles, the position indicated by the yellow arrow in the picture is the position of the hair bulb of the hair follicle. Same as below圖7 斑點(diǎn)馬背部毛囊TYR蛋白免疫熒光結(jié)果圖Fig.7 The results of TYR immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

圖8 斑點(diǎn)馬背部毛囊TYRP1蛋白免疫熒光結(jié)果圖Fig.8 The results of TYRP1 immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

3 討 論

哺乳動(dòng)物色素沉著是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，受不同因素的控制。黑色素決定了皮膚顏色，黑色素生成受亞細(xì)胞水平調(diào)控。黑色素生成過(guò)程中，各種黑素生成相關(guān)酶和抑制劑的合成和表達(dá)起關(guān)鍵作用[3]。酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)被認(rèn)為是催化黑素細(xì)胞中黑色素合成的關(guān)鍵酶[4]。TYR催化兩個(gè)主要的反應(yīng)：酪氨酸羥基化生成3，4-L -二羥基苯丙氨酸(3，4-L-dihydroxyphenylalanine，dopa)，和dopa氧化生成多巴醌(dopaquinone)[5]。之后，多巴醌自發(fā)轉(zhuǎn)化為多巴鉻。酪氨酸酶相關(guān)蛋白2/ 多巴異構(gòu)酶(tyrosinase- related protein 2 / dopachrome tautomerase，TRP2/DCT)催化dopachrome轉(zhuǎn)化為5，6-二羥基吲哚-2-羧酸(dopachrome to 5，6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)。TRP1催化DHICA氧化酶氧化生成 5，6-吲哚醌羧酸(indole-5，6-quinone-2-carboxylic acid)。TRP1和DCT密切相關(guān)，可以產(chǎn)生不穩(wěn)定的醌類(lèi)化合物，并進(jìn)行進(jìn)一步聚合，最終導(dǎo)致黑色素生成[6]。酪氨酸酶及其相關(guān)蛋白是TYR基因家族中不同基因的產(chǎn)物，其5′端有轉(zhuǎn)錄因子的共同識(shí)別位點(diǎn)[7]。編碼TRPs家族的基因通常被稱(chēng)為T(mén)YPS，TYR、TRP1與DCT基因相類(lèi)似。目前認(rèn)為，tyrp1基因編碼氧化酶活性，而tyrp2基因編碼多巴色互變酶[8]。人類(lèi)TYR是由tyr基因編碼的。TYPS、TYR和TRP1受上游的小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associated transcription factor，MITF)調(diào)控，影響基因表達(dá)；它們具有多態(tài)性，可以行使不同功能，這使得幾種色素沉著狀態(tài)會(huì)同時(shí)存在，以及突變的存在[9]。同時(shí)，有研究表明，酪氨酸和酪氨酸酶相關(guān)蛋白I (TRP-I)在黑素細(xì)胞中不表達(dá)。此外，缺乏TRP-2的表達(dá)會(huì)影響蛋白銀位點(diǎn)的產(chǎn)物[9]。這也許是蒙古斑點(diǎn)馬黑色斑點(diǎn)部位毛囊有色素沉積的原因。

圖9 斑點(diǎn)馬背部毛囊DCT蛋白免疫熒光結(jié)果圖Fig.9 The results of DCT immunofluorescence in hair follicles at back of spotted horse

大多數(shù)哺乳動(dòng)物有兩種或兩種以上的毛色，這是由皮膚表面的兩種色素決定的。黑色素是在黑素小體發(fā)育過(guò)程中由各種蛋白質(zhì)產(chǎn)生的。黑素體是黑素細(xì)胞中的細(xì)胞器，可以合成和運(yùn)輸黑色素[10]。調(diào)控黑色素生成的一組重要的相關(guān)基因是酪氨酸酶基因家族(TYR，酪氨酸酶相關(guān)蛋白1，TYRP1， dopachrome tautomeraseDCT)。TYR是調(diào)控黑色素生成的關(guān)鍵酶。TYR、TYRP1和DCT在黑素小體發(fā)育的III期發(fā)揮作用，而黑色素小體蛋白基因PMEL是控制毛色的主要候選基因之一[11]。多巴醌是一種高活性的中間體，通過(guò)一系列復(fù)雜的氧化還原反應(yīng)循環(huán)最終形成黑色素[12]。當(dāng)TYR活性高時(shí)，合成真黑素。相反，褐黑素是在其活性不高時(shí)合成的[13]。TYR中的錯(cuò)義突變His214Asn可能引起雞的巧克力毛色和黑素體結(jié)構(gòu)的改變[14]。兔子中TYR基因的3個(gè)未翻譯區(qū)域的缺失導(dǎo)致黑色素合成減少[15]。與白水貂相比，TYRP1基因表達(dá)水平會(huì)在黑色毛皮中上調(diào)[16]。TYR基因在青灰色和黑色雞的表達(dá)水平高于白色[17]，但在淺棕色和白色組之間沒(méi)有顯著差異。然而，DCT基因的表達(dá)僅在青灰色組上調(diào)，與水貂和家兔的研究一致[18]。說(shuō)明TYR、TYRP1和DCT基因富集在細(xì)胞成分，黑素體膜中；TYR和TYRP1基因富集于黑色素生物合成過(guò)程、黑素小體組織和色素沉著DCT基因在TYR的發(fā)育色素沉著和黑色素生物合成過(guò)程中富集。

動(dòng)物的被毛顏色是毛囊中的黑色素細(xì)胞決定的，被毛附著在皮膚的最外層，具有防御、保護(hù)和信息交流作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，蒙古斑點(diǎn)馬毛囊結(jié)構(gòu)與其他哺乳動(dòng)物毛囊結(jié)構(gòu)基本一致，主要由毛干、毛根兩部分構(gòu)成。粱朝錄[21]等在對(duì)雙峰駝毛囊群結(jié)構(gòu)的研究中提出，雙峰駝的毛囊群結(jié)構(gòu)與肉食獸的毛囊群相似，屬于復(fù)合毛囊。同樣，Trautmann[22]研究發(fā)現(xiàn)，駱駝、狗和貓的毛囊都屬于復(fù)合毛囊。趙若陽(yáng)[23]對(duì)阿爾山雪兔毛色的研究發(fā)現(xiàn)，雪兔毛囊結(jié)構(gòu)為典型的復(fù)合毛囊，同一個(gè)毛道中同時(shí)可以長(zhǎng)出多根毛囊。而在蒙古斑點(diǎn)馬毛囊上未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。這與李超[24]對(duì)蒙古馬被毛毛囊形態(tài)的研究結(jié)果描述相符。因此，可以說(shuō)明蒙古斑點(diǎn)馬為非復(fù)合毛囊。

轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以從細(xì)胞或者組織中獲取所表達(dá)的全部轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本可以表現(xiàn)出機(jī)體各種細(xì)胞類(lèi)型、生理狀態(tài)、組織類(lèi)型或生命階段下所表達(dá)的全部基因。因此，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以反映出特定時(shí)期或生命狀態(tài)下全部基因的表達(dá)水平及調(diào)控規(guī)律。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在動(dòng)物毛色研究上也有很多的應(yīng)用價(jià)值。許鐘峯[25]對(duì)同一頭陸川豬黑色和白色皮膚組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得知黑色皮膚相對(duì)于白色皮膚有7個(gè)基因表達(dá)顯著上調(diào)，包括TYRP1、DCT、TRPM1等與黑色素合成相關(guān)基因，由于白色皮膚因缺少TYRP1和TYRP2基因的表達(dá)造成代謝通路中無(wú)法合成真黑色素。趙博昊等[26]利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選獺兔毛色相關(guān)基因，共篩選出17 327個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因8 445個(gè)，下調(diào)基因8 882個(gè)，在這些差異基因當(dāng)中，包含與毛色形成的相關(guān)基因，例如TYR、TYRP1、ASIP等基因，這些毛色相關(guān)基因都與酪氨酸及黑色素形成有著密切聯(lián)系。Yao等[27]利用Illumina HiSeq X Ten測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了綿羊白色、淺棕色、黑色和青灰色毛色的相關(guān)基因，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DCT、TYR、TYRP1、PMEL、SLC45A2、MLANA等 6個(gè)差異表達(dá)基因參與了毛色的調(diào)節(jié)。這些基因與黑素細(xì)胞分化、黑素小體運(yùn)輸、發(fā)育性色素沉著和黑色素生物合成過(guò)程有關(guān)。Xiong等[28]使用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)波爾和麻城山羊毛囊的黑色和白色區(qū)域的皮膚進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在黑色和白色區(qū)域的皮膚中共鑒定出165個(gè)差異表達(dá)基因，認(rèn)為T(mén)YR、DCT、TYRP1、GPR143、SLC45A2等可能與雜交山羊黑色素沉著有關(guān)，Agouti可能在顏色模式的形成中起著關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)控作用。Li等[29]使用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)白色和黑色蒙古馬進(jìn)行了表達(dá)譜分析，鑒定出了231 個(gè)調(diào)控蒙古馬毛色的差異表達(dá)基因，其中 119 個(gè)為下調(diào)基因、112 個(gè)為上調(diào)基因。Fan等[17]以蘇尼特綿羊皮膚樣本為研究對(duì)象，通過(guò) Illumina HiSeqTM2000 測(cè)序平臺(tái)開(kāi)展了皮膚組織 RNA-seq 研究，發(fā)現(xiàn)在已知45 個(gè)毛色基因中，13 個(gè)在黑色被毛綿羊皮膚中顯著高表達(dá)，包括TYRP1、TYR、MLPH、MATP和Silver基因等。而本研究中通過(guò)差異表達(dá)分析篩選到了109個(gè)基因在黑色皮膚組織中表達(dá)。包括TYR、TYRP1、DCT基因，預(yù)示蒙古斑點(diǎn)馬斑點(diǎn)表型的形成與這3個(gè)基因具有直接的聯(lián)系。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)以蒙古斑點(diǎn)馬為研究對(duì)象，分別對(duì)蒙古斑點(diǎn)馬體軀白色區(qū)域和黑色區(qū)域皮膚的表型和差異表達(dá)基因進(jìn)行分析并驗(yàn)證。經(jīng)HE染色發(fā)現(xiàn)白色區(qū)域和黑色區(qū)域皮膚毛囊組織表型上并沒(méi)有顯著差異，但其中的黑色素分布有明顯的差異，黑色素細(xì)胞主要分布于黑色皮膚組織表皮和毛囊毛球部位，而白色皮膚組織相對(duì)應(yīng)的位置未發(fā)現(xiàn)有黑色素沉積。其次對(duì)白色和黑色區(qū)域皮膚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序結(jié)果中得到了324個(gè)基因的表達(dá)量在黑、白兩個(gè)不同區(qū)域皮膚組織中存在顯著差異，其中109個(gè)基因在蒙古斑點(diǎn)馬黑色皮膚組織表達(dá)量較高，215個(gè)基因在蒙古斑點(diǎn)馬白色皮膚組織表達(dá)量較高。差異表達(dá)的mRNAs主要富集到了黑色素生成通路(主要參與基因包括TYR、TYRP1、DCT、PAX3、DAPL1等)。通過(guò)免疫組化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TYR和TYRP1蛋白在毛囊的毛球部位不表達(dá)，DCT在毛囊毛球的毛母質(zhì)部位表達(dá)。從而得知，蒙古斑點(diǎn)馬的毛色形成主要由黑色素形成相關(guān)基因的表達(dá)量所決定，與其他表型相近的哺乳動(dòng)物未有太大的差距。