乳酸鏈球菌素工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的穩(wěn)定性研究

王兆蘭，李海軍,2,3*，王 超，張英華，鄭德強(qiáng),2,3，馬雙雙

（1.山東福瑞達(dá)生物科技有限公司，山東 臨沂 276700；2.山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)南 250000；3.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250000）

乳酸鏈球菌素（nisin）是某些乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種活性多肽物質(zhì)，對(duì)人體安全無(wú)毒副作用，是一種安全、綠色、環(huán)保的生物防腐劑。Nisin的穩(wěn)定性易受溫度、pH、基質(zhì)等影響[1]，不僅在一定程度上限制了其在食品加工中的應(yīng)用，影響其最終抑菌效果[2]，更重要的是在工業(yè)大生產(chǎn)過(guò)程中影響產(chǎn)品的最終收率。目前在nisin的工業(yè)生產(chǎn)中，通常利用高溫方式釋放胞內(nèi)nisin，并用鹽酸調(diào)節(jié)其pH值，實(shí)現(xiàn)其提純過(guò)程中的穩(wěn)定性。雖然胞內(nèi)nisin通過(guò)高溫作用釋放的過(guò)程較快，但大工業(yè)生產(chǎn)時(shí)因罐體體積較大，升、降溫過(guò)程所需時(shí)間較長(zhǎng)，造成nisin在高溫、低pH條件下維持的時(shí)間較長(zhǎng)，可能會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性下降[3]。為了提高nisin在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的穩(wěn)定性，保證最終收率，本研究模擬工業(yè)生產(chǎn)條件，在40～120 ℃條件下考察不同溫度和pH值對(duì)nisin穩(wěn)定性的影響，重點(diǎn)研究產(chǎn)品提純過(guò)程中使用不同酸對(duì)nisin在穩(wěn)定性方面的影響，以優(yōu)化其制備工藝。

在nisin的檢測(cè)方法方面，目前最常用的為瓊脂擴(kuò)散法，此方法不僅受檢測(cè)菌活性影響誤差較大，而且檢測(cè)周期也較長(zhǎng)。本研究針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法的弊端，開(kāi)發(fā)使用高效液相法檢測(cè)產(chǎn)品效價(jià)，有效提高產(chǎn)品檢測(cè)效率，且準(zhǔn)確度高，樣品不被破壞[4]，更能在一定程度上反應(yīng)效價(jià)下降的實(shí)質(zhì)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（安捷倫）；Sorvall RC-6型高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher）；Seven Multi S40 pH計(jì)（梅特勒-托利多）；ZHJH-C1115B垂直超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造公司）；SHB-III型臺(tái)式循環(huán)水式多用抽濾機(jī)（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)）；LDZF-75KB-II型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安），HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒）。

1.2 材料與試劑

1.2.1 主要材料 乳酸鏈球菌素成品及半成品（山東福瑞達(dá)生物科技有限公司）；檢測(cè)菌：黃色微球菌（NCIB8166）；S1培養(yǎng)基（青島海博）。

1.2.2 主要試劑 乙腈（色譜級(jí)）；三氟乙酸（分析純）；鹽酸（分析純）；乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）；酵母粉（安琪酵母）、蛋白胨（吳忠市王國(guó)旗生物科技）；磷酸氫二鈉（科密歐試劑）；氯化鈉（科密歐試劑）；葡萄糖（諸城東曉生物科技）；吐溫20（無(wú)錫亞泰聯(lián)合化工）。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相檢測(cè)方法及驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相（A：90 %乙腈水溶液，三氟乙酸1 ml/L，B：10 %乙腈水溶液，三氟乙酸1 ml/L），洗脫時(shí)間見(jiàn)表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：20 μl。

表1 乳酸鏈球菌素洗脫時(shí)間表

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品處理 標(biāo)準(zhǔn)品處理：精確稱量乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品（效價(jià)約1000 IU/mg）20，40，60，80，100 mg，置入10 ml量瓶，0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解。上樣前使用微孔濾膜過(guò)濾。

樣品處理：將編號(hào)1～5的樣品分別稱量100，50，50，25，25 mg，置入10 ml量瓶，0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解。上樣前使用微孔濾膜過(guò)濾。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 按照上述色譜檢測(cè)條件和洗脫方法進(jìn)行檢測(cè)，以儀器峰面積Y對(duì)乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度X（mg/ml）作標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]?；貧w方程為Y=303.59X+16.958，相關(guān)系數(shù)r2=0.9992，表明在乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為1～10 mg/ml范圍內(nèi)，乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

2.1.4 乳酸鏈球菌素效價(jià)按下式計(jì)算：

式中：C測(cè)：標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得的樣液中乳酸鏈球菌素的質(zhì)量濃度，單位mg/ml。C稱：所稱樣品的質(zhì)量濃度，單位mg/ml。效價(jià)單位IU/mg。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖 分別對(duì)乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品和樣品采用同等條件進(jìn)行檢測(cè)。見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，乳酸鏈球菌素的色譜峰約在20～21 min之間，能與其他物質(zhì)有效分離。

圖1 乳酸鏈球菌素高效液相色譜圖

2.1.6 方法回收率及檢出限 在乳酸鏈球菌素樣品中添加乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算其加標(biāo)回收率、RSD值及檢出限。由表2可見(jiàn)，樣品加標(biāo)回收率達(dá)91 %以上，RSD值小于5 %，以3倍信噪比計(jì)算檢出限為0.5 mg/ml。

表2 樣品加標(biāo)回收率

2.1.7 高效液相法與國(guó)標(biāo)瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)效價(jià)對(duì)比 將編號(hào)1～5的樣品分別稱量100，50，50，25，25 mg置入10 ml量瓶，用0.02 mol/L鹽酸水溶液定容并充分震蕩溶解，上樣前使用微孔濾膜過(guò)濾；按照上述色譜檢測(cè)條件和洗脫方法進(jìn)行檢測(cè)，并按照2.1.4項(xiàng)計(jì)算方法進(jìn)行效價(jià)計(jì)算。高效液相法與國(guó)標(biāo)瓊脂擴(kuò)散法（參見(jiàn)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑乳酸鏈球菌素GB 1886.231-2016[6]）相比，其相對(duì)誤差小于6 %（見(jiàn)表3），與瓊脂擴(kuò)散法相比誤差小于10 %，表明高效液相法可用于乳酸鏈球菌素含量的檢測(cè)[7]。

表3 高效液相法與國(guó)標(biāo)瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)效價(jià)對(duì)比

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.2.1 Nisin水溶液在不同pH、不同溫度條件下的穩(wěn)定性 將nisin半成品固體溶解成較高效價(jià)的溶液，等分5份，用鹽酸調(diào)pH值分別為2.0，3.0，4.0，5.0和6.0，每份樣品各分為3份密閉分裝，分別置于65，75，85 ℃水浴鍋內(nèi)，定期取樣使用高效液相法監(jiān)測(cè)其效價(jià)。結(jié)果表明，在pH 2.0（圖2A）和3.0（圖2B）時(shí)，65～85 ℃條件下nisin水溶液的效價(jià)變化較小，pH 4.0（圖2C）時(shí)，隨著溫度增加，效價(jià)稍有下降；pH 5.0（圖2D）及6.0（圖2E）時(shí)，隨著溫度增加，效價(jià)下降趨勢(shì)明顯。pH小于3.0時(shí)乳酸鏈球菌素在85 ℃依然穩(wěn)定。

圖2 不同pH條件下nisin水溶液穩(wěn)定性

2.2.2 Nisin水溶液在pH 2.0、不同溫度條件下的穩(wěn)定性 因pH2.0時(shí)乳酸鏈球菌素較穩(wěn)定，為了優(yōu)化在工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程nisin的生產(chǎn)工藝，現(xiàn)將溶液pH調(diào)節(jié)為2.0，于40，60，80，100，120 ℃條件下分別作用20，40，60，80，100 min，用高效液相法檢測(cè)其效價(jià)。結(jié)果表明，pH 2.0時(shí)（圖3），溫度低于120 ℃，60 min以內(nèi)nisin比較穩(wěn)定，在120 ℃條件下維持60 min以上時(shí)，nisin效價(jià)明顯下降。

圖3 pH2.0條件下nisin水溶液穩(wěn)定性

2.2.3 不同酸制備的nisin的穩(wěn)定性 分別使用硫酸、磷酸、鹽酸、乳酸調(diào)節(jié)nisin發(fā)酵液 pH為2.0～2.5，制備其成品粉末，于37 ℃放置，定期取樣使用液相法檢測(cè)其效價(jià)。結(jié)果：使用硫酸制備的nisin成品效價(jià)在一個(gè)月內(nèi)下降55 %；使用乳酸和磷酸制備的nisin成品與對(duì)照（鹽酸）相比，其穩(wěn)定性明顯提高。在37 ℃條件下放置3個(gè)月效價(jià)分別下降27.2 %和20 %，對(duì)照效價(jià)下降36 %（具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4）。

圖4 不同酸制備樣品效價(jià)變化趨勢(shì)

2.2.4 Nisin樣品穩(wěn)定性圖譜分析 將同一樣品在37 ℃條件下分別放置1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月后，取少量樣品存放于-20 ℃。3次留樣使用高效液相法進(jìn)行圖譜分析（見(jiàn)圖5）發(fā)現(xiàn)：隨著在37 ℃條件下存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品效價(jià)下降，且目標(biāo)峰（保留時(shí)間22.5 min）之后的雜峰（保留時(shí)間24 min）占比也在相應(yīng)的增加，表明乳酸鏈球菌素在一定條件下其性質(zhì)有所改變，造成其效價(jià)下降。

圖5 Nisin 37 ℃存儲(chǔ)過(guò)程中雜峰變化趨勢(shì)

3 討論

本文用HPLC法檢測(cè)是通過(guò)峰面積來(lái)表征活性，但因Nisin的活性受結(jié)構(gòu)等諸多因素影響，為防止其在不同溫度和酸堿度條件下因結(jié)構(gòu)改變?cè)斐墒Щ畹猿龇逭?，在?duì)實(shí)驗(yàn)樣品活性衰減的定期監(jiān)測(cè)過(guò)程中，同時(shí)使用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，兩種方法結(jié)果一致。然而是否在其他特殊情況下出現(xiàn)出峰正常但活性降低的現(xiàn)象還有待進(jìn)一步研究。

考慮到在工業(yè)大生產(chǎn)過(guò)程中nisin溶液的升溫、降溫不能在短時(shí)間內(nèi)精準(zhǔn)實(shí)現(xiàn)，所以本文延長(zhǎng)了考察時(shí)間并將考察的溫度范圍擴(kuò)大，便于生產(chǎn)借鑒。不同溫度和酸堿度條件下，nisin穩(wěn)定性有較大差異，會(huì)直接導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品收率的波動(dòng)，通過(guò)HPLC快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中nisin的效價(jià)，進(jìn)而優(yōu)化其工藝參數(shù)就顯得尤為重要。本研究使用檢測(cè)nisin效價(jià)的HPLC前處理步驟簡(jiǎn)單，儀器較普遍，不僅效率高、具有良好的可靠性，還能通過(guò)降解產(chǎn)物峰在一定程度上直觀的體現(xiàn)其效價(jià)下降的原因[8]，可作為瓊脂擴(kuò)散法的良好補(bǔ)充。

為了更直接觀察到nisin在不同條件下峰面積、效價(jià)的變化，本實(shí)驗(yàn)使用較高效價(jià)的nisin溶液進(jìn)行考察，但帶菌發(fā)酵液高溫釋放nisin的過(guò)程同樣可使用本文所用的HPLC方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。另外本研究發(fā)現(xiàn)，在存儲(chǔ)過(guò)程中，使用磷酸、乳酸制備的nisin成品比使用鹽酸制備的nisin成品相對(duì)穩(wěn)定，3個(gè)月內(nèi)其穩(wěn)定性分別提高16 %和8.8 %，這也為nisin的工業(yè)生產(chǎn)提供了新的思路，目前研究者們已經(jīng)探討了許多改善其活性的方法[9-10]，但同時(shí)考慮到產(chǎn)品生產(chǎn)成本等因素，還需做進(jìn)一步的研究和探索。