去外泌體血清對脂肪干細(xì)胞及胃癌細(xì)胞生物學(xué)活性的影響

謝佳慧， 文 藝， 王 艦， 徐 俊

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200092)

外泌體是一種由真核細(xì)胞分泌的直徑40～150 nm、密度1.13～1.19 g/mL的囊泡結(jié)構(gòu)[1]，表面富含膽固醇、神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺等脂類物質(zhì)[2]，膜內(nèi)包含著多種生物活性成分和細(xì)胞信號(hào)分子，如蛋白質(zhì)、多肽、脂類及mRNA、microRNA、miRNA、DNA等[3]。外泌體作為細(xì)胞間信息交流的重要載體[4]，可攜帶內(nèi)容物靶向投遞至特定的部位釋放，在介導(dǎo)微環(huán)境中細(xì)胞間信號(hào)和物質(zhì)交流上起重要作用[5]，且不同來源、不同環(huán)境下發(fā)揮作用不同，為疾病診治、組織修復(fù)治療提供了新思路[6]。目前，對于外泌體的研究幾乎涉及全部機(jī)體組織，其中基礎(chǔ)領(lǐng)域中對脂肪干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的外泌體功能及相關(guān)作用機(jī)制的研究更是近年來熱點(diǎn)之一[7]。

脂肪干細(xì)胞來源豐富，便于獲取和操作，分泌外泌體能力強(qiáng)且脂肪干細(xì)胞外泌體(adipose-derived stem cells-derived exosomes, ADSCs-Exos)功能眾多[8]，它能通過細(xì)胞分化、周期調(diào)控、炎癥趨化等相關(guān)因子影響或改變受體細(xì)胞行為，參與機(jī)體內(nèi)多種生理進(jìn)程，如細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡以及損傷修復(fù)與再生、血管生成、抗炎反應(yīng)、免疫應(yīng)答等[9]，有很好的研究前景[10]。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體(tumor-derived exosomes, TEX)既有抑制宿主免疫應(yīng)答[11]，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，在一定條件下又能夠起到抗腫瘤免疫作用，因其雙重性，探索TEX對免疫應(yīng)答作用及其相關(guān)機(jī)制在腫瘤診斷及治療中具有重要意義[12]。研究指出干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均能分泌大量外泌體，因此研究它們的旁分泌作用對干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及腫瘤的治療具有重要的意義。

然而，目前的用于外泌體研究的細(xì)胞培養(yǎng)體系中通常需要添加胎牛血清，而血清中帶有大量的牛外泌體，會(huì)對后續(xù)提取細(xì)胞上清液中的細(xì)胞源外泌體的研究產(chǎn)生較強(qiáng)的干擾作用[13]；一些研究中會(huì)選擇采用無血清培養(yǎng)法避免干擾，但往往會(huì)對細(xì)胞活力以及其外泌體效應(yīng)產(chǎn)生很大影響，所以在一些高質(zhì)量的研究中，更傾向于使用含有去除外泌體的血清培液來培養(yǎng)細(xì)胞。目前外泌體分離的方法有很多種，但暫時(shí)還沒有理想且統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本研究使用的去除血清外泌體的超離法建立在已有文章報(bào)道[14-15]，并研究了其對ADSCs和腫瘤細(xì)胞的影響，為獲得理想細(xì)胞源外泌體提供可行方法。

1 材料與方法

1.1 材料

原代脂肪干細(xì)胞來源于上海美立方醫(yī)療美容醫(yī)院抽脂提取的脂肪組織，且原代脂肪干細(xì)胞已完成檢驗(yàn)鑒定工作。腫瘤細(xì)胞為購買自中國科學(xué)院細(xì)胞庫的胃癌細(xì)胞MGC803。

DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，F(xiàn)BS購自澳洲Moregate公司，無外泌體血清購自美國SBI公司，CCK-8試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒、衰老β-Gal半乳糖苷酶染色試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)有限公司,細(xì)胞周期試劑盒購自美國BD公司，Alix抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，CD63抗體購自美國圣克魯斯生物技術(shù)公司，TSG101抗體和Actin抗體購自英國Abcam公司，山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 超離法去除血清外泌體 將FBS分裝到超速離心管中離心(離心半徑88 cm，34 800 r/min，18 h)，使用移液器從上方貼著液面小心吸取上清液，避免擾動(dòng)底部的沉淀，收集80%左右的上清液，轉(zhuǎn)移到50 mL離心管，混勻后使用0.45 μm的濾器過濾，即可得到無菌的Exo-Free FBS。處理后的Exo-Free FBS可以凍存于-20 ℃。

1.2.2 對比不同血清中外泌體的含量 提取兩種不同血清中外泌體，使用RIPA裂解液裂解外泌體，BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)測定的外泌體濃度以每孔上樣15 μg計(jì)算每孔上樣量。然后加入1/4體積的5×上樣緩沖液與外泌體混合，放入蛋白煮樣器100 ℃進(jìn)行蛋白變性10 min，結(jié)束后立即放在冰上待用。使用上海雅酶PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)制備SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜。用TBST清洗5 min后，放入5%牛奶中，搖床上振蕩封閉2 h。Alix(E6P9B，Rabbit mAb),TSG101(ab125011),CD63(MX-49.129.5)以及Actin(ab8226)抗體孵育過夜，洗膜，接著分別加入對應(yīng)二抗Goat anti-mouse IgG(H+L), HRP conjugate，SA00001-1和Goat anti-rabbit IgG(H+L), HRP conjugate，SA00001-2，室溫孵育2 h。

1.2.3 脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng) 將脂肪組織剪碎，加入0.15%的Ⅰ型膠原酶，37 ℃消化45 min；將懸液離心(離心半徑88 cm,800 r/min,5 min)，即獲得P0代細(xì)胞，將細(xì)胞接種于含有90% DMEM/F12、10% FBS、10 ng/mL成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)和1%青霉素-鏈霉素雙抗的培養(yǎng)基中,37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔天換液，長至80%～90%匯合度時(shí)傳代，加0.25%胰酶消化3 min，離心(離心半徑13.5 cm，1 000 r/min，5 min)收集細(xì)胞，接種至新鮮培養(yǎng)基中。從P1代開始分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組用10%去外泌體血清(Exo-Free FBS)代替FBS，選取P4代細(xì)胞和P6代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2.4 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 購買自中國科學(xué)院細(xì)胞庫的胃癌細(xì)胞MGC803，使用90% RPMI-1640和10% FBS配制培養(yǎng)基,培養(yǎng)傳代從P1代開始分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組用10% Exo-Free FBS代替FBS，選取P4代細(xì)胞和P6代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)分析 將細(xì)胞以5×103/孔鋪至96孔板中，每隔24 h向一組的3個(gè)復(fù)孔中添加10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測量在450 nm處吸光度(A450)，A450代表細(xì)胞活力。持續(xù)檢測6 d繪制生長曲線。

1.2.6 細(xì)胞衰老分析 用SA-β-Gal染色試劑盒測定細(xì)胞衰老，按照試劑盒說明書進(jìn)行染色，用光學(xué)顯微鏡隨機(jī)捕獲多個(gè)不同視野的細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算藍(lán)色陽性細(xì)胞的比例。

1.2.7 細(xì)胞周期分析 6孔板接種106/孔細(xì)胞，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，PBS清洗3次，細(xì)胞消化后用PBS清洗3次，用0.5 mL的PBS將細(xì)胞重懸，再加入1.5 mL預(yù)冷的無水乙醇混勻細(xì)胞，懸液放置-20 ℃固定12 h以上。PBS清洗3次，去除乙醇，加入300 μL碘化丙啶染色液，室溫避光染色15 min，使用濾網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞分析儀上機(jī)檢測。Modfit軟件分析各時(shí)期細(xì)胞情況。

1.2.8 細(xì)胞凋亡分析 6孔板接種細(xì)胞106/孔培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，PBS洗滌消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)離心(離心半徑13.5 cm，1 000 r/min，5 min)，棄上清液，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取(5～10)×104細(xì)胞重懸離心(離心半徑13.5 cm，1 000 r/min，5 min)，棄上清液，加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin Ⅴ-FITC，輕輕混勻，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，隨后置于冰浴中，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測。FlowJo軟件分析凋亡細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用t檢驗(yàn)法分析比較組間差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)3次以上。

2 結(jié) 果

2.1 不同類型培養(yǎng)方法對ADSCs細(xì)胞活力的影響

比較不同培養(yǎng)方法: 饑餓培養(yǎng)法(Hungry組)、購買的無外泌體血清培養(yǎng)法(SBI Exo-Free組)、超離去除外泌體血清培養(yǎng)法(Exo-Free組)及正常血清培養(yǎng)法(Control組)對ADSCs細(xì)胞活力的檢測。配置培養(yǎng)基培養(yǎng)ADSCs，48 h后CCK-8法對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，饑餓培養(yǎng)的ADSCs活力顯著性降低(P<0.000 1)，兩個(gè)去外泌體血清組的細(xì)胞活力均明顯降低(P<0.01),其中購買的去外泌體血清與超離法去外泌體的血清之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 不同類型培養(yǎng)基中ADSCs增殖情況Fig.1 Proliferation of ADSCs in different medium**P<0.01,****P<0.000 1

2.2 去除外泌體的效果

應(yīng)用超離法去除血清外泌體，利用Western印跡法檢測control組，以及Exo-Free組，典型外泌體蛋白標(biāo)記Alix，TSG101，CD63以及骨架蛋白Actin，結(jié)果清晰表明，超離法能高效去除血清外泌體，見圖2。

圖2 Western印跡法檢測蛋白表達(dá)Fig.2 Protein expression was detected by Western blotting

2.3 去外泌體血清對ADSCs和MGC803細(xì)胞的增殖情況

應(yīng)用CCK-8法對Exo-Free組Control組的ADSCs和MGC803進(jìn)行檢測，結(jié)果表明Exo-Free組的ADSCs增殖速度較Conrol組會(huì)有一定程度的減慢，且培養(yǎng)時(shí)間越長細(xì)胞數(shù)量差距越大。腫瘤細(xì)胞MGC803的增殖則不受影響，見圖3。

圖3 ADSCs和MGC803的增殖情況Fig.3 The proliferation of ADSCs and gastric cancer MGC803 cells*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1;P4: P4代細(xì)胞，P6: P6代細(xì)胞

2.4 ADSCs和MGC803的衰老情況

應(yīng)用SA-β-Gal染色法對Exo-Free組和Control組的ADSCs和MGC803進(jìn)行染色，隨機(jī)選取10個(gè)以上視野,將陽性藍(lán)色細(xì)胞計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)衰老細(xì)胞的比例。Exo-Free組的ADSCs和Exo-Free組的MGC803的衰老細(xì)胞比例均無明顯變化，見圖4、5。

圖4 ADSCs的SA-β-Gal染色(標(biāo)尺200 μm)Fig.4 SA-β-Gal staining of ADSCs(scale bar 200 μm)

圖5 MGC803的SA-β-Gal染色圖片(標(biāo)尺200 μm)Fig.5 SA-β-Gal staining of MGC803 cells(scale bar 200 μm)

2.5 ADSCs和MGC803的細(xì)胞周期情況

用細(xì)胞周期檢測試劑盒，對固定的對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞分析儀檢測，并分析各時(shí)期細(xì)胞比例，結(jié)果顯示Exo-Free組與Control組ADSCs的S期比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。Exo-Free組MGC803的S期比例略微的低于Control組，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>1)，可以認(rèn)為對細(xì)胞周期變化無影響，見圖7。

圖6 ADSCs的細(xì)胞周期流式圖Fig.6 Cell cycle flowcytometry diagram of ADSCs

圖7 MGC803的細(xì)胞周期流式圖Fig.7 Cell cycle flowcytometry diagram of MGC803 cells

2.6 ADSCs和MGC803的細(xì)胞凋亡情況

用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，對細(xì)胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞分析儀對細(xì)胞進(jìn)行檢測，分析凋亡細(xì)胞比例。結(jié)果顯示Exo-Free FBS的使用對ADSCs的早期凋亡不產(chǎn)生影響，但對晚期凋亡比例產(chǎn)生了顯著性影響，P4和P6代一致顯示Exo-Free FBS組的晚期凋亡比例上升，見圖8；MGC803的實(shí)驗(yàn)組與對照組之間無論早期凋亡還是晚期凋亡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖9。結(jié)果表明超離法獲得的去外泌體血清對細(xì)胞的早期凋亡無影響，對MGC803的晚期凋亡無影響。

圖8 ADSCs的細(xì)胞凋亡流式圖Fig.8 Cell apoptosis flow cytometry diagram of ADSCs**P<0.01,***P<0.001

圖9 MGC803的細(xì)胞凋亡流式圖Fig.9 Cell apoptosis flowcytometry diagram of MGC803 cells

3 討 論

外泌體攜帶大量特異性的蛋白質(zhì)以及功能性生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)參與細(xì)胞通信、細(xì)胞遷移、促血管新生和抗腫瘤免疫等生理過程，與多種疾病的發(fā)生和進(jìn)程密切相關(guān)[16]。由于外泌體的特殊結(jié)構(gòu)和功能，使它具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，一方面作為診斷多種疾病的生物指標(biāo)，另一方面也可以作為治療手段，未來作為藥物的天然載體用于臨床治療[17]，已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域無細(xì)胞治療的理想解決方案[18]。

ADSCs-Exos的研究是近年來熱點(diǎn)之一，ADSCs-Exos可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促使血管生成[19]，且具有良好的耐受性，能降低細(xì)胞治療帶來的免疫排斥反應(yīng)的問題[20]，并且能解決干細(xì)胞移植的存活率低、致瘤風(fēng)險(xiǎn)等問題[21]，在皮膚損傷修復(fù)，神經(jīng)退行性疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療，腫瘤診治等多種領(lǐng)域扮演著重要角色[22]，但目前對于ADSCs-Exos的生物成分、功能以及發(fā)揮作用的機(jī)制仍存在很多未知，需要繼續(xù)深入研究[23]。TEX的相關(guān)研究領(lǐng)域也是備受關(guān)注，TEX參與腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞之間的信息傳遞[24]，在癌細(xì)胞的生長、遷移、侵襲等過程中發(fā)揮重要作用[25]，而且TEX在介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境的過程中機(jī)制復(fù)雜，呈現(xiàn)一定的雙重性，一方面通過抑制宿主免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[26]，在另一些特定條件下又起到抗腫瘤免疫作用[27]。因此，對不同條件下TEX的成分以及信號(hào)傳遞分子機(jī)制的研究，有望了解腫瘤免疫相關(guān)機(jī)制并開發(fā)腫瘤標(biāo)志新型分子靶點(diǎn)[28]，為腫瘤早期診斷以及預(yù)后判斷提供了新的方向[29]。

然而在研究某種特定的細(xì)胞分泌的外泌體時(shí)，通常需要提取細(xì)胞上清液，而在細(xì)胞培養(yǎng)過程中對于大多數(shù)細(xì)胞來說，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基須在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中外加FBS作為生長添加物。常用的FBS含有大量的牛源外泌體，這些外泌體含有牛相關(guān)蛋白質(zhì)或miRNA等分子，對于相關(guān)細(xì)胞自身分泌外泌體的提取和研究，牛血清中的外泌體可能會(huì)造成嚴(yán)重的背景問題，從而影響或干擾結(jié)果的判斷。一些研究中直接選擇采用無血清培養(yǎng)法，但饑餓培養(yǎng)法往往對細(xì)胞活力影響巨大，所以在一些高質(zhì)量的文獻(xiàn)中[30-34]研究者更傾向于使用含有去除外泌體的血清培液來培養(yǎng)細(xì)胞，收集上清液分離細(xì)胞外泌體。因此通過適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)獲得去除外泌體的血清，排除血清中外源干擾獲得純凈的細(xì)胞源外泌體樣本是必要的。

市面上已存在一些商業(yè)化的無外泌體血清產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品不僅價(jià)格昂貴并且可能對不同細(xì)胞的生長情況造成一定的影響[35]。本研究使用的去除血清外泌體的超離法，即離心(半徑88 cm，34 800 r/min，18 h)取上層約80%的上清液后0.45 μm濾器過濾，是建立在已有文章報(bào)道基礎(chǔ)上[14-15]。此方法使用的設(shè)備簡單，操作步驟較少容易實(shí)現(xiàn)，Western印跡法結(jié)果顯示去除外泌體的效率極為可觀。一次操作可獲取200 mL左右的去除外泌體血清,凍存后可供后續(xù)使用，與購買的無外泌體血清商品其高達(dá)2 500元(50 mL)的費(fèi)用相比，在大量科研工作的進(jìn)行過程中操作可行具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。為研究超離方法獲得的去外泌體血清在細(xì)胞生長過程中是否會(huì)產(chǎn)生影響，本次選擇了外泌體研究領(lǐng)域較為關(guān)注的兩種細(xì)胞進(jìn)行了研究。在ADSCs中，超離法獲得的去外泌體血清對增殖的影響比購買的無血清外泌體小，且其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明超離法比商品化獲得的無外泌體血清更適用于ADSCs的培養(yǎng)。接著，為了驗(yàn)證超離法獲得的去外泌體血清對細(xì)胞生長狀況的影響，將去除外泌體的血清作為實(shí)驗(yàn)組(Exo-Free組)配制培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞與對照組進(jìn)行對比，在ADSCs中結(jié)果顯示，ADSCs的增殖速度會(huì)因血清外泌體的去除顯著降低，細(xì)胞數(shù)量差異呈現(xiàn)隨生長時(shí)間增加的累積效果，P4代顯示P<0.01,P6代達(dá)到P<0.000 1；在細(xì)胞周期和細(xì)胞衰老的分析中，Exo-Free組均無明顯變化；在細(xì)胞凋亡方面，Exo-Free組的ADSCs的早期凋亡無顯著性差異，Exo-Free組的晚期凋亡比例有顯著性升高，具體原因需要進(jìn)一步探索。總體來說，可以認(rèn)為超離法去除的外泌體對ADSCs的生長狀況并無明顯影響。在腫瘤細(xì)胞MGC803中結(jié)果顯示，超離法去除血清外泌體對細(xì)胞增殖、衰老和凋亡均不產(chǎn)生影響，Exo-Free組的S期細(xì)胞比例有一定的變化，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述，超離法可以有效去除血清外泌體對細(xì)胞外泌體研究的干擾且對ADSCs和腫瘤細(xì)胞MGC803的活性不產(chǎn)生影響。特別是在對血清的要求比較高的干細(xì)胞上，商品化去外泌體血清可能不適合干細(xì)胞生長，改變細(xì)胞培養(yǎng)基條件可能會(huì)影響干細(xì)胞的生物學(xué)活性及干細(xì)胞外泌體的效應(yīng)。本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為完全可以使用本研究中的超離方法自行制備去外泌體血清，即解決血清外泌體的干擾問題又有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本研究為外泌體研究中的細(xì)胞培養(yǎng)用去外泌體血清的獲取提供了新的思路與策略，在饑餓培養(yǎng)和購買昂貴的商業(yè)化去外泌體血清找到了平衡點(diǎn)。

本研究中討論的方法仍存在一些局限性，目前僅針對外泌體的分離去除的應(yīng)用進(jìn)行驗(yàn)證，超離法是否也適合對細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中目標(biāo)外泌體的提取，是否可以保證外泌體提取過程中不被破壞，在未來的研究中，可以進(jìn)一步在高分辨率顯微鏡下觀察分離后的外泌體的形態(tài)是否完整，并將分離的外泌體使用到機(jī)制研究中，去驗(yàn)證提取的外泌體是否保持活性且具備相應(yīng)的功能。未來繼續(xù)改進(jìn)現(xiàn)有的方法，得到理想的外泌體提取技術(shù)，并建立統(tǒng)一的操作體系，探索、開發(fā)及優(yōu)化獲得質(zhì)量均一、能大規(guī)模生產(chǎn)和存儲(chǔ)的外泌體的相關(guān)技術(shù)，將為外泌體研究進(jìn)展和臨床的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。