田吉鵬, 韋 青, 劉蓓一, 許能祥, 丁成龍, 顧洪如
(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 南京 210014)
花生(ArachishypogaeaLinn.)在我國(guó)廣泛種植,每年產(chǎn)量達(dá)1 700多萬t?;ㄉ斋@后剩余的花生秧具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)且瘤胃消化率高,十分適合被反芻動(dòng)物利用。據(jù)研究,花生秧在瘤胃的干物質(zhì)及粗蛋白降解率均顯著高于豆秸、玉米秸等其他秸稈[1]。飼喂花生秧可以提高畜禽生產(chǎn)性能和胃腸道消化功能、維持腸道菌群平衡,提高免疫力[2]。我國(guó)黃淮海地區(qū)反芻動(dòng)物舍飼養(yǎng)殖規(guī)模龐大,優(yōu)質(zhì)牧草資源缺乏,同時(shí)也是我國(guó)花生的主產(chǎn)地。充分利用花生秧飼料資源可以有效解決優(yōu)質(zhì)粗飼料短缺的難題,保證我國(guó)黃淮海農(nóng)區(qū)反芻動(dòng)物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
青貯是保存粗飼料營(yíng)養(yǎng)成分、提高消化率的有效手段?;ㄉ鷮儆诙箍浦参?,緩沖能值高,可溶性碳水化合物含量低,附著乳酸菌數(shù)量少,難以有效青貯。同時(shí)花生品種較多,不同品種花生秧營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)差異較大[3],也增大了花生秧青貯飼料添加劑的應(yīng)用難度?,F(xiàn)有研究多將狼尾草(Pennisetumalopecuroides(L.) Spreng.)、全株玉米(ZeamaysL.)、高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench)等與花生秧進(jìn)行混合青貯[4-6]。添加外源乳酸菌及農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物同樣能夠提高青貯發(fā)酵質(zhì)量,抑制有害微生物,在花生秧以及苜蓿等豆科青貯飼料中取得良好的效果[7-8]。玉米芯是玉米果穗脫去籽粒后的穗軸,營(yíng)養(yǎng)成分豐富,與其他原料通過混合青貯能夠提高青貯飼料質(zhì)量和反芻動(dòng)物的生產(chǎn)性能[9]。稻殼粉(OryzasativaL.)營(yíng)養(yǎng)成分含量少,但是添加進(jìn)花生秧青貯中能夠降低緩沖能值,提高干物質(zhì)含量,提高青貯發(fā)酵效果[10],同時(shí)經(jīng)過發(fā)酵亦可提高稻殼粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和消化率[11]。目前尚未有花生秧與玉米芯或稻殼粉混合青貯的相關(guān)報(bào)道。本研究將花生秧與玉米芯或稻殼粉進(jìn)行混合青貯,同時(shí)添加復(fù)合乳酸菌制劑,旨在探索針對(duì)不同花生秧品種的最佳復(fù)合添加劑組合,以提高花生秧青貯的成功率和發(fā)酵質(zhì)量,為花生秧的飼料化利用提供理論依據(jù)及技術(shù)支持。
花生秧來自于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)地,花生品種為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的品種‘027’(H1品種)和‘047’(H2品種),花生收獲期收獲,留茬高度5 cm。乳酸菌采用江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所自研復(fù)合乳酸菌,主要菌種包括植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)和副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei),活菌數(shù)>5×1010CFU g-1。玉米芯和稻殼粉自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購得。
試驗(yàn)采用雙因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì),兩個(gè)花生秧品種H1和H2,每個(gè)品種分別用蒸餾水(CK組),復(fù)合乳酸菌(LAB組),復(fù)合乳酸菌及玉米芯(LAB+C組),復(fù)合乳酸菌及稻殼粉(LAB+R組)進(jìn)行處理,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。
將新鮮收割的花生秧用鍘刀均勻切割為2~3 cm的小段并混合均勻。將復(fù)合乳酸菌加入2 mL滅菌脫脂奶粉溶液中室溫活化2 h,加入適量水(20 mL)溶解均勻噴灑進(jìn)青貯料中。其中CK組和LAB組每個(gè)品種取1 kg,分別均勻噴灑等量蒸餾水及乳酸菌液,其中乳酸菌的添加量為5×105CFU·g-1,CK組用蒸餾水等量噴灑。LAB+C和LAB+R組中各自添加花生秧鮮樣5%的玉米芯和稻殼粉,每份1 kg,并均勻噴灑乳酸菌液,乳酸菌的添加量與LAB組相同。將每份1 kg均勻分為3份分別裝入青貯袋中并用真空包裝機(jī)抽取真空密封后作為3個(gè)重復(fù)。全部完成后放入20~25℃儲(chǔ)藏室中包裹黑色塑料袋遮光儲(chǔ)存1年。
1.3.1發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定 開封后每個(gè)青貯袋中青貯飼料混合均勻,從中均勻取20 g青貯料加入250 mL錐形瓶中,加入180 mL蒸餾水,放入4℃冰箱中浸提24 h,浸提后用4層紗布和定性濾紙過濾,用于pH值的測(cè)定,剩余浸提液立即保存于—20℃冰箱中用于氨態(tài)氮和有機(jī)酸含量的測(cè)定。其中pH值的測(cè)定采用梅特勒公司的玻璃電極pH計(jì)進(jìn)行測(cè)量。采用安捷倫公司的高效液相色譜儀(配備紫外檢測(cè)器)測(cè)定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量[12]。分析條件如下:色譜柱為Shodex RSpak KC-811S-DVB gel C(8.0 mm×30 cm,島津公司);進(jìn)樣體積為5 μL;流動(dòng)相為3 mM HClO4;流速為1 mL·min-1;柱溫為60℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;運(yùn)行時(shí)間20 min。采用苯酚-次氯酸鈉法測(cè)定氨態(tài)氮含量[13]。
1.3.2微生物數(shù)量測(cè)定 青貯袋開封后立即稱取測(cè)定微生物數(shù)量所需樣品,取每個(gè)樣品后更換一次性PE手套和無菌取樣袋。取混合均勻的20 g樣品放入250 mL錐形瓶中,加入180 mL滅菌生理鹽水,室溫條件下在振蕩器中震蕩30 min后立即用于乳酸菌、酵母菌和霉菌的計(jì)數(shù)。無菌條件下用移液槍吸取1 mL混勻的菌懸液加入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中震蕩均勻,反復(fù)稀釋得到10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6的菌懸液。用MRS培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限公司)對(duì)乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù),平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)48 h,選擇乳酸菌菌落數(shù)在30~300內(nèi)的稀釋度培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)。用孟加拉紅培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限公司)對(duì)酵母菌和霉菌進(jìn)行培養(yǎng),28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~7 d,選擇酵母菌菌落數(shù)在30~300內(nèi)的稀釋度培養(yǎng)皿計(jì)數(shù),選擇霉菌菌落數(shù)在10~100內(nèi)的稀釋度培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)。
1.3.3營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和體外消化率測(cè)定 取250 g樣品放在105℃烘箱中殺青15 min,然后65℃烘箱中烘干約48 h至恒重,稱重計(jì)算干物質(zhì)(Dry matter,DM)含量,烘干后樣品粉碎過1 mm篩并用于營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和體外消化率的檢測(cè)。采用凱式定氮法檢測(cè)總氮(Total nitrogen,TN)含量[14],粗蛋白含量以TN×6.25進(jìn)行計(jì)算。中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量采用安康公司的Ankom200i纖維檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定方法為范式法[14-15]。采用體外降解法測(cè)定干物質(zhì)的體外降解率(Invitrodigestibility of dry matter,IVDMD),具體采用胃蛋白酶-纖維素酶測(cè)定法[16]。
相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行初步整理和分析,用SPSS 20數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)一步分析。利用一般線性模型對(duì)品種(H)、添加劑(A)以及交互效應(yīng)(H×A)進(jìn)行方差分析。交互效應(yīng)顯著的(P<0.05)進(jìn)一步進(jìn)行多重比較,多重比較方法采用Tukey法,交互效應(yīng)不顯著但主效應(yīng)顯著的(P<0.05)進(jìn)一步對(duì)總體均值進(jìn)行多重比較,多重比較方法同樣采用Tukey法。各處理以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來進(jìn)行表示。
花生秧青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。從總體均值上看,H1和H2品種在pH值、乳酸和乙酸含量以及乳酸/乙酸比值上存在顯著差異(P<0.01)。同樣,添加劑的使用在pH值、乙酸含量、乳酸/乙酸比值和氨態(tài)氮含量上具有顯著差異(P<0.01)?;ㄉ贩N和添加劑的交互效應(yīng)(H×A)顯著影響了花生秧青貯飼料的各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)(P<0.01)。與CK相比H1品種中LAB,LAB+C和LAB+R處理均能有效降低青貯飼料的pH值。H2品種中只有LAB+C處理組的pH值顯著低于CK組(P<0.05)。H1品種中LAB+C、LAB+R處理組的乳酸含量較高,均超過6.3%DM,顯著高于H2品種中的同樣添加劑組合(P<0.05)。LAB+C和LAB+R處理組的乙酸含量在H1品種和H2品種中均顯著低于LAB處理組(P<0.05),但只有在H2品種中顯著低于CK組(P<0.05)。H2品種的CK組和LAB組具有較高的乙酸含量(P<0.05)。H1品種的LAB+C處理組具有最高的乳酸/乙酸比值(P<0.05),顯著高于H1品種的CK組和其他添加劑組(P<0.05)。H2品種的LAB+C和LAB+R處理組的乳酸/乙酸比值也顯著高于H2品種的CK和LAB組(P<0.05)。H1品種的CK組以及H2品種的CK組和LAB組氨態(tài)氮含量最高,超過了13%TN。LAB+C和LAB+R處理組在H1和H2品種中相比于CK組均能顯著降低氨態(tài)氮含量,其中LAB+C組效果最好,在H1和H2品種中均低于10%TN。H2品種中的LAB+C組具有最低的氨態(tài)氮含量,為8.17%TN。丙酸和丁酸在本次研究中未檢出。
表1 不同品種和添加劑對(duì)花生秧青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 1 The influence of different varieties and additives on the fermentation quality of peanut vine silage
由表2可知,不同品種乳酸菌數(shù)量和霉菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.01),而添加劑的使用從總體上對(duì)乳酸菌、酵母菌和霉菌數(shù)量也有顯著影響(P<0.01)。品種和添加劑的互作效應(yīng)對(duì)于乳酸菌和霉菌數(shù)量具有顯著影響(P<0.01)。H1品種的LAB處理組具有最高的乳酸菌數(shù)量,且顯著高于CK組(P<0.05),但在H2品種中LAB組與CK組無顯著差異。在兩個(gè)品種中LAB+C以及LAB+R處理組乳酸菌數(shù)量顯著低于CK組和LAB組(P<0.05)。H1品種的LAB+R組從數(shù)值上看具有最小的乳酸菌數(shù)量。添加劑的使用能夠顯著影響酵母菌數(shù)量(P<0.01)。LAB+R和LAB+C處理組酵母菌的總體均值分別為1.78和2.67 lgCFU·g-1,相比于CK組和LAB組的總體均值0.71和0.78 lgCFU·g-1,顯著提高了酵母菌數(shù)量(P<0.05)。青貯后H1品種花生秧青貯霉菌數(shù)量未檢出,只有H2品種的LAB+C處理組有少量霉菌檢出,但數(shù)量極少。
表2 不同品種和添加劑對(duì)花生秧青貯飼料微生物數(shù)量的影響Table 2 The influence of different varieties and additives on the microbial counts of peanut vine silage
由表3可知,兩個(gè)品種的青貯飼料在干物質(zhì)、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素含量方面均具有顯著性差異(P<0.01),而添加劑對(duì)于花生秧青貯飼料的干物質(zhì)含量、粗蛋白、酸性洗滌木質(zhì)素含量以及體外干物質(zhì)消化率具有顯著影響(P<0.01),但是僅在干物質(zhì)含量上品種和添加劑具有顯著的交互效應(yīng)(P<0.05)。H1組干物質(zhì)含量和粗蛋白含量顯著高于H2組(P<0.01),中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素含量顯著低于H2品種(P<0.01)。添加劑LAB+C和LAB+R組顯著增加了青貯飼料的干物質(zhì)含量(P<0.01),顯著降低了青貯飼料的粗蛋白含量(P<0.01)。H1品種的CK組和LAB組粗蛋白含量較高,超過11.4%。添加劑LAB+C具有最低的酸性洗滌木質(zhì)素含量,且顯著低于LAB+R處理組(P<0.05)。從整體上看,添加劑的添加對(duì)于中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量無顯著影響。體外干物質(zhì)消化率在青貯后總體保持平穩(wěn),不受品種的影響。添加劑尤其是LAB組和LAB+C組相比CK組能夠顯著提高體外干物質(zhì)消化率(P<0.05)。
表3 不同品種和添加劑對(duì)花生秧青貯飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和體外消化率的影響Table 3 The influence of different varieties and additives on the nutrition value and in vitro digestibility of peanut vine silage
在花生秧青貯飼料中未檢出丙酸和丁酸,這表明丙酸菌和丁酸菌的發(fā)酵受到了抑制。同時(shí)酵母菌和霉菌的數(shù)量也很少。整體花生秧青貯飼料中以乳酸菌發(fā)酵為主。在長(zhǎng)時(shí)間的青貯過程中所有處理的花生秧青貯飼料均得到了很好的保存。一般我們認(rèn)為青貯飼料的pH值最好低于4.2[17],但是對(duì)于豆科植物來說,由于其成分復(fù)雜,蛋白質(zhì)含量較高,很難使其pH值低于4.2[7],只要能夠有效抑制梭菌、酵母菌和霉菌等的活動(dòng),仍能得到發(fā)酵質(zhì)量良好的青貯料。在花生秧中添加乳酸菌制劑和農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物能夠有效降低青貯飼料的pH值,這與Qin等[8]的研究相一致。本研究中LAB+C處理組的pH值最低,在H2品種中最低可以達(dá)到4.27。這可能是因?yàn)樵诨ㄉ砬噘A飼料中引入了玉米芯等禾本科植物加工過程中剩余的副產(chǎn)物,降低了青貯飼料的緩沖能,雖然乳酸含量沒有明顯提高,但是pH值明顯降低。同時(shí),玉米芯和稻殼粉等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物干物質(zhì)含量較高,添加進(jìn)花生秧青貯飼料當(dāng)中能夠提高青貯飼料的干物質(zhì)含量,本試驗(yàn)當(dāng)中青貯飼料中的干物質(zhì)含量由30%左右提高到了33%左右,更加適合乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵[18]。這與杜昭昌等[10]的結(jié)果相似。
乳酸與乙酸的比值代表了青貯飼料中同型發(fā)酵和異型發(fā)酵的占比,比值越大同型發(fā)酵程度越高[17]。同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌組合形成的復(fù)合乳酸菌添加劑能夠有效提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì),抑制真菌等有害微生物繁殖,提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性[19],是目前商業(yè)青貯添加劑應(yīng)用中的主要品種。本試驗(yàn)所用乳酸菌LAB為復(fù)合乳酸菌,里面同時(shí)包含同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌。在本團(tuán)隊(duì)之前的研究中該復(fù)合乳酸菌能夠顯著提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[20]。在本研究中LAB處理組的乳酸和乙酸的比值低于CK組、乙酸含量高于CK組,證明布氏乳桿菌等異型發(fā)酵乳酸菌在花生秧青貯飼料中產(chǎn)生了效果。LAB+C和LAB+R處理組的乳酸和乙酸比值比LAB組高,乙酸含量比LAB組低,這可能是因?yàn)橛衩仔竞偷練し鄣奶砑釉黾恿丝扇苄蕴妓衔锖?,提高了植物乳桿菌等同型發(fā)酵乳酸菌的發(fā)酵效率。該結(jié)果與Tian等[7]利用麥麩和玉米皮提高植物乳桿菌在苜蓿青貯飼料中發(fā)酵效果的研究相似。王思偉等[6]的研究表明,花生秧和全株玉米的混合青貯中隨著花生秧比例的增加pH值和乙酸含量顯著增加。在本研究中,添加稻殼粉和玉米芯顯著降低了青貯中的pH值和乙酸含量?;ㄉ砬噘A飼料4.6左右的pH值仍然較高,在花生秧等豆科植物中適當(dāng)引入禾本科飼草及相應(yīng)副產(chǎn)物有助于提高同型發(fā)酵乳酸菌的發(fā)酵效果,提高青貯品質(zhì)。同樣的在秸稈當(dāng)中加入適量的高蛋白飼料原料與乳酸菌添加劑能夠提升青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)[21]。本研究中品種和添加劑之間存在顯著的交互效應(yīng),且這種交互效應(yīng)主要體現(xiàn)在發(fā)酵品質(zhì)和乳酸菌數(shù)量上,這可能主要因?yàn)閺?fù)合乳酸菌中植物乳桿菌等同型發(fā)酵乳酸菌和布氏乳桿菌等異型發(fā)酵乳酸菌的發(fā)酵效果受到了原料營(yíng)養(yǎng)成分的影響。說明通過品種的選擇以及稻殼粉和玉米芯等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的應(yīng)用,可以提高復(fù)合乳酸菌制劑中不同菌株的發(fā)酵效果。
氨態(tài)氮含量能夠表征青貯飼料中蛋白質(zhì)的降解情況,主要由梭菌產(chǎn)生,氨態(tài)氮的含量越高,青貯品質(zhì)越差[22]。當(dāng)青貯飼料本身蛋白質(zhì)含量較高時(shí),添加適當(dāng)比例的禾本科農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物能夠降低氨態(tài)氮含量。如姜俊芳等[23]研究表明,在稻殼添加量低于30%的時(shí)候,隨著稻殼添加量的增加高蛋白的筍殼青貯中氨態(tài)氮含量是下降的。但是對(duì)于蛋白質(zhì)含量低一點(diǎn)的全混合日糧,隨著稻殼比例從0%到5%再到10%,氨態(tài)氮含量是增加的[24]。本試驗(yàn)中添加稻殼粉和玉米芯及乳酸菌的復(fù)合添加劑能夠顯著降低青貯飼料中氨態(tài)氮含量,相對(duì)來說玉米芯的效果更好。原因在于添加劑及農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的添加提高了青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì),抑制了蛋白質(zhì)降解菌的繁殖,降低了氨態(tài)氮含量。同時(shí)玉米芯本身蛋白質(zhì)含量較低,降低了青貯飼料的總氮含量,相對(duì)于其他添加劑相應(yīng)的氨態(tài)氮產(chǎn)生量較低。
相比H1品種,H2品種蛋白質(zhì)含量較低,纖維組分(中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和酸性洗滌木質(zhì)素)含量更高,受稻殼粉和玉米芯的影響小一些,但是添加稻殼粉和玉米芯及乳酸菌的復(fù)合添加劑后氨態(tài)氮含量降低幅度更大,pH值更低。目前尚未有針對(duì)花生秧不同品種青貯效果的比較研究,但是兩個(gè)品種發(fā)酵品質(zhì)的差異多與蛋白質(zhì)含量的高低有關(guān)。H1品種蛋白質(zhì)含量較高,需要更多乳酸菌產(chǎn)生乳酸以提高發(fā)酵品質(zhì),而H2品種則更接近達(dá)到優(yōu)質(zhì)青貯發(fā)酵效果。添加稻殼粉和玉米芯降低了花生秧青貯飼料的蛋白質(zhì)含量,但在H1品種的青貯飼料中蛋白質(zhì)含量仍超過10%。添加玉米芯及乳酸菌復(fù)合添加劑能夠有效降低花生秧青貯飼料的木質(zhì)素含量,同時(shí)對(duì)于干物質(zhì)體外消化率提升效果最好。這與Valadares等[25]利用玉米芯添加進(jìn)甘薯藤(Dioscoreaesculenta(Lour.) Burkill)青貯中的效果相似。乳酸菌等對(duì)青貯飼料的體外消化率具有顯著的促進(jìn)效果[26],這與本研究的結(jié)果是相似的。同樣的體外消化率的變化主要是由于乳酸菌提高了青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì),降低了非纖維營(yíng)養(yǎng)成分的流失,從而提高了花生秧青貯飼料的體外消化率,而玉米芯的酸性洗滌木質(zhì)素含量較低,對(duì)于提高體外干物質(zhì)消化率也有一定作用。因?yàn)楸狙芯克脧?fù)合添加劑包含3種乳酸菌及輔料,影響因素復(fù)雜,難以從理論上進(jìn)一步進(jìn)行分析及比較,后續(xù)將開展單一乳酸菌菌株與農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物的復(fù)合添加研究,進(jìn)一步分析提高青貯飼料體外干物質(zhì)消化率的原因并提供進(jìn)一步改進(jìn)方案。
乳酸菌、稻殼粉和玉米芯的使用能夠有效提高花生秧青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。粗蛋白含量更高的花生秧品種更需要添加復(fù)合添加劑以提高青貯發(fā)酵質(zhì)量。在兩個(gè)品種當(dāng)中,乳酸菌和玉米芯的組合使青貯具有最低的pH值和氨態(tài)氮含量以及最高的乳酸/乙酸比值,同時(shí)能夠降低青貯飼料的木質(zhì)素含量,提高體外干物質(zhì)消化率。綜上所述,乳酸菌和玉米芯的組合提高花生秧青貯飼料青貯品質(zhì)的效果最好。