臨床克雷伯菌屬碳青霉烯酶三種檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)比較研究

白 倩，趙 雅,，王 林（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽(yáng) 7046；.西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 7000）

克雷伯菌屬屬于腸桿菌科，是導(dǎo)致肺炎、菌血癥、尿路感染以及創(chuàng)口感染的常見(jiàn)醫(yī)療相關(guān)感染病原菌，其多重耐藥現(xiàn)象是世界公眾衛(wèi)生健康面臨的緊迫挑戰(zhàn)。碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥克雷伯菌屬感染的首選用藥，但隨著臨床上此類抗生素的不合理使用，碳青霉烯耐藥克雷伯菌屬所致感染不斷增多[1]。我國(guó)碳青霉烯耐藥機(jī)制最常見(jiàn)為產(chǎn)碳青霉烯酶，主要流行類型為KPC 型（肺炎克雷伯氏菌碳青霉烯酶）、NDM 型（新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶）、IMP 型（亞胺培南水解β-內(nèi)酰胺酶）以及VIM 型（維羅納整合子編碼β-內(nèi)酰胺酶），第一種屬于絲氨酸酶，后三種屬于金屬酶，分別由blaKPC，blaNDM，blaIMP和blaVIM基因編碼[2]。碳青霉烯酶遺傳和表型檢測(cè)的相關(guān)研究有助于全球監(jiān)測(cè)碳青霉烯耐藥菌的多樣性和流行性，且快速準(zhǔn)確地檢測(cè)碳青霉烯酶，能夠幫助臨床及時(shí)地制定有效的治療方案以及實(shí)現(xiàn)對(duì)醫(yī)院內(nèi)感染的監(jiān)控[3]。至今尚無(wú)一種方法能夠快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、全面地檢測(cè)碳青霉烯酶，本文選取了實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)的三種檢測(cè)方法，以聚合式酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）法為金標(biāo)準(zhǔn)，采用改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method,mCIM）+ EDTA 碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)（EDTA-carbapenem inactivation method,eCIM）和GeneXpert法檢測(cè)克雷伯菌屬碳青霉烯酶或碳青霉烯酶基因，對(duì)這三種測(cè)試進(jìn)行方法學(xué)比較，為臨床和實(shí)驗(yàn)室選擇適合的方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2019年1月～2021年5月西安市第一醫(yī)院及西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離出的克雷伯菌屬細(xì)菌，共計(jì)80 株，碳青霉烯類耐藥菌株43 株，碳青霉烯類敏感菌株37 株，剔除同一病人重復(fù)菌株，菌株分離鑒定按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》要求執(zhí)行。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（Escherichia Coli）ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706。所有菌株均使用菌株保存管于-80℃保存。

1.2 儀器與試劑 GeneXpert?Carba-R 全自動(dòng)病原體快速檢測(cè)系統(tǒng)及試劑盒（美國(guó)賽沛公司），基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國(guó)布魯克公司），Vitek 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀（法國(guó)生物梅里埃公司），PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司），電泳儀（北京六一儀器廠）；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB，海博生物有限公司），MH 培養(yǎng)基（康泰生物有限公司），EDTA，細(xì)菌DNA 提取試劑盒及Taq PCR Mix 預(yù)混液（上海生工生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)：將凍存于-80℃冰箱菌株恢復(fù)至室溫，使用接種環(huán)接種于血瓊脂平板上，過(guò)夜孵育。使用質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌菌種鑒定，Vitek 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

1.3.2 PCR 法檢測(cè)耐藥基因：采用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取受試菌全基因組DNA，引物參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)，交由生工生物有限公司合成，見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系共25μl：DNA 模板1μl，上、下游引物各1μl，Taq PCR Mix 12.5μl，ddH2O 9.5μl。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.5ml/dl 瓊脂糖凝膠60V 電泳60min，最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。PCR 擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物交由奧科生物有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，在NCBI數(shù)據(jù)網(wǎng)上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）進(jìn)行blast 序列比對(duì)。

表1 碳青霉烯酶耐藥基因PCR 引物序列

1.3.3 mCIM+ eCIM 試驗(yàn)檢測(cè)耐藥表型:將凍存的菌株復(fù)蘇接種于血瓊脂平板上，過(guò)夜孵育。每個(gè)樣本取1μl 純菌落分別加入裝有2ml TSB 肉湯（mCIM試驗(yàn)）和含20μl 0.5mol/L EDTA 的2ml TSB 肉湯（eCIM 試驗(yàn)）的試管中，漩渦震蕩混勻。每個(gè)試管加入10μg 美羅培南藥敏紙片，確保肉湯浸沒(méi)紙片，37℃空氣孵育4h。使用大腸埃希菌ATCC 25922 與生理鹽水配置0.5 麥?zhǔn)蠞舛葐挝唬?×108CFU/ml）的菌懸液，將菌懸液均勻涂布于MH 平板上。將TSB 肉湯中的美羅培南紙片用無(wú)菌棉簽擠出多余水分，貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC 25922 的MH平板上。倒置平板，37℃空氣孵育18～24h。結(jié)果判斷：mCIM 試驗(yàn)陽(yáng)性：美羅培南抑菌圈直徑6～15mm 或直徑16～18mm，但抑菌圈內(nèi)有散在菌落。mCIM陰性：抑菌圈直徑≥19mm。eCIM 試驗(yàn)陽(yáng)性：與mCIM 結(jié)果相比，抑菌圈直徑之差≥5mm，則判定為產(chǎn)金屬酶類碳青霉烯酶。eCIM 試驗(yàn)陰性：與mCIM 結(jié)果相比，抑菌圈直徑之差≤4mm，則判定為產(chǎn)絲氨酸類碳青霉烯酶（mCIM 試驗(yàn)陰性則不對(duì)eCIM 試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行解釋）。

1.3.4 GeneXpert 檢測(cè)耐藥基因:使用一次性接種環(huán)挑取受試菌單個(gè)菌落，用生理鹽水配置成0.5 麥?zhǔn)蠞舛葐挝痪鷳乙海?0μl 菌懸液加入樣本試劑內(nèi)，漩渦震蕩混勻后取1.7ml 混合液加入GeneXpert?Carba-R 檢測(cè)試劑盒，使用GeneXpert?Carba-R 檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM，blaOXA-48 耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用WHONET5.6 軟件對(duì)受試菌分布及耐藥情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。以PCR 檢測(cè)耐藥基因?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，計(jì)算mCIM+eCIM試驗(yàn)和GeneXpert 的靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。Kappa 值＞0.75（P＜0.05）說(shuō)明一致性較好。

2 結(jié)果

2.1 PCR 耐碳青霉烯酶基因檢出結(jié)果 經(jīng)PCR 擴(kuò)增測(cè)序后，43 株碳青霉烯耐藥克雷伯菌屬中，40株攜帶耐藥基因，3 株未檢出耐藥基因。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast 比對(duì)，blaKPC-2 有30 株，blaNDM-5有4 株，blaNDM-1 有4 株，blaIMP-4 有2 株。主要檢出為blaKPC-2。部分PCR 碳青霉烯酶基因擴(kuò)增陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖1。37 株碳青霉烯類敏感克雷伯菌屬均未檢出耐藥基因。

圖1 耐碳青霉烯類克雷伯菌屬細(xì)菌blaKPC，blaNDM，blaIMP基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 mCIM 和eCIM 試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2。40 株碳青霉烯酶基因陽(yáng)性受試菌中mCIM 試驗(yàn)陽(yáng)性40株，eCIM 試驗(yàn)陰性（絲氨酸酶陽(yáng)性）30 株，eCIM 試驗(yàn)陽(yáng)性（金屬酶陽(yáng)性）10 株。3 株未檢出碳青霉烯酶基因的耐碳青霉烯克雷伯菌屬mCIM試驗(yàn)均為陰性。37 株碳青霉烯酶敏感克雷伯菌屬mCIM 試驗(yàn)均為陰性。

2.3 GeneXpert 檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表2。40 株碳青霉烯酶耐藥基因陽(yáng)性受試菌中GeneXpert 共計(jì)檢出38 株攜帶碳青霉烯酶基因，分別為27 株攜帶blaKPC，8 株攜帶blaNDM，2 株攜帶blaIMP，1 株攜帶blaKPC+blaNDM。3 株未檢出碳青霉烯酶基因的耐碳青霉烯克雷伯菌屬GeneXpert 檢測(cè)結(jié)果均為陰性。37株碳青霉烯酶敏感克雷伯菌屬GeneXpert 檢測(cè)均為陰性。

表2 三種檢測(cè)方法結(jié)果比較

2.4 三種方法檢測(cè)碳青霉烯酶差異及方法學(xué)比較 以PCR 法為金標(biāo)準(zhǔn)，mCIM+eCIM 試驗(yàn)檢測(cè)絲氨酸酶及金屬酶表型結(jié)果靈敏度、特異度以及陰、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100%，一致率100%，Kapaa 值為1。GeneXpert 檢測(cè)敏感度為94.9%，特異度為97.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.4%，陰性預(yù)測(cè)值為95.2%，一致率96.3% Kappa 值為0.925。三種方法檢測(cè)碳青霉烯酶差異及各自優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表3。

表3 三種檢測(cè)方法特點(diǎn)比較

2.5 碳青霉烯耐藥克雷伯菌屬細(xì)菌藥敏結(jié)果分析43 株耐碳青霉烯克雷伯菌屬細(xì)菌中檢出攜帶碳青霉烯酶基因的有40 株，其余三株為非產(chǎn)碳青霉烯酶機(jī)制導(dǎo)致的碳青霉烯耐藥。43 株耐藥菌對(duì)亞胺培南、美羅培南的耐藥率分別為97.7%（42/43）和100%（43/43），呈現(xiàn)高度耐藥現(xiàn)象，未有對(duì)多黏菌素耐藥菌株檢出。三種不同基因型藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4，對(duì)blaKPC及blaNDM兩種基因型進(jìn)行耐藥率比較分析，結(jié)果顯示blaKPC對(duì)阿米卡星的耐藥率高于blaNDM（P＜0.05），blaNDM對(duì)米諾環(huán)素耐藥率明顯高于blaKPC（P＜0.05）。

表4 43 株碳青霉烯耐藥克雷伯菌屬常用抗生素耐藥率（%）

3 討論

1985年以來(lái)，碳青霉烯類抗生素一直是治療多重耐藥革蘭陰性桿菌感染的首選治療藥物。但隨著耐碳青霉烯腸桿菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）出現(xiàn)及全球傳播，其多重耐藥趨勢(shì)以及血流感染期間高死亡率特征，已經(jīng)成為一個(gè)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[5-6]。在碳青霉烯耐藥機(jī)制中，產(chǎn)碳青霉烯酶最為重要，編碼碳青霉烯酶的基因通過(guò)可移動(dòng)遺傳元件實(shí)現(xiàn)耐藥基因在菌株或菌種之間的水平傳播，含碳青霉烯酶基因的質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)recA基因在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)形成質(zhì)粒多聚體，導(dǎo)致碳青霉烯耐藥性的增加[7-8]。研究表明產(chǎn)碳青霉烯酶耐藥菌比非產(chǎn)酶耐藥菌毒性和傳播力更強(qiáng)，且需要實(shí)施更多的感染控制干預(yù)措施[9-10]。因此，探究更快更準(zhǔn)確地檢測(cè)碳青霉烯酶方法對(duì)指導(dǎo)臨床用藥以及控制耐藥菌株的產(chǎn)生與傳播至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)mCIM+ eCIM 試驗(yàn)與GeneXpert 檢測(cè)碳青霉烯酶與PCR 法結(jié)果高度一致。

傳統(tǒng)PCR 方法作為檢測(cè)碳青霉烯耐藥基因的金標(biāo)準(zhǔn)，需要設(shè)計(jì)特定引物。若待測(cè)基因與靶基因不符、待測(cè)基因拷貝數(shù)太低以及引物突變會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，本研究有三株臨床藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示碳青霉烯耐藥，但未檢測(cè)到碳青霉烯酶基因，可能是其他耐藥機(jī)制引起的耐藥或者本研究選擇擴(kuò)增的基因有限所導(dǎo)致。PCR 法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件、設(shè)備及操作人員的要求較高，臨床實(shí)驗(yàn)室難以常規(guī)開(kāi)展，因此需要一種能夠快速準(zhǔn)確的檢出碳青霉烯酶的方法[11]。

美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的mCIM和eCIM 試驗(yàn)通過(guò)碳青霉烯酶水解美羅培南以及EDTA 能夠抑制金屬β-內(nèi)酰胺酶活性的特點(diǎn)，即使待測(cè)菌株低水平表達(dá)碳青霉烯酶，mCIM 試驗(yàn)也能準(zhǔn)確地檢測(cè)出[12]。但目前mCIM 試驗(yàn)僅被推薦用于腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶的檢測(cè)，在HOWARD等[13]人的研究中，mCIM 被用于檢測(cè)不同革蘭陰性桿菌是否產(chǎn)生碳青霉烯酶，結(jié)果顯示mCIM 對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌敏感度分別為74.1%和10.0%，對(duì)腸桿菌細(xì)菌的敏感度為96.2%。本研究與2018年CLSI 評(píng)價(jià)mCIM+ eCIM試驗(yàn)檢測(cè)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)絲氨酸酶和金屬酶的敏感度、特異度結(jié)果相似。但有學(xué)者表明絲氨酸酶與金屬酶共表達(dá)會(huì)導(dǎo)致eCIM 試驗(yàn)篩選金屬酶的靈敏度降低，并且EDTA 對(duì)絲氨酸酶的抑制作用會(huì)導(dǎo)致結(jié)果僅表現(xiàn)金屬酶陽(yáng)性，因此當(dāng)臨床分離到高M(jìn)IC值的腸桿菌科細(xì)菌時(shí)應(yīng)注意是否為絲氨酸酶與金屬酶共表達(dá)菌株[14]。mCIM 和eCIM 試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶以及區(qū)分表型具有較高的敏感度和特異度，經(jīng)濟(jì)學(xué)價(jià)值高、操作簡(jiǎn)單且結(jié)果易于判斷[15]。但其檢測(cè)周期長(zhǎng)不能達(dá)到快速檢測(cè)的目的，適用于基層實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，不建議臨床微生物實(shí)驗(yàn)室將其作為常規(guī)檢查項(xiàng)目開(kāi)展。

GeneXpert?Carba-R 試劑盒是由美國(guó)賽沛公司研發(fā)半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，是一種自動(dòng)化的體外檢測(cè)試驗(yàn)，可以直接采用直腸拭子和臨床分離株進(jìn)行碳青霉烯耐藥基因檢測(cè)，試劑盒內(nèi)含有多對(duì)引物，涵蓋了在中國(guó)流行的主要碳青霉烯類耐藥基因（包括blaKPC，blaNDM，blaIMP，blaVIM以及blaOXA-48），最新版本的檢測(cè)試劑盒對(duì)blaOXA-48 的變異體blaOXA-181 和blaOXA-232 亦有著很好的檢出率[16-17]。本研究中采用臨床分離株進(jìn)行檢測(cè)，主要涉及blaKPC，blaNDM，blaIMP三種基因型的檢測(cè)，與參考方法相比一致程度高。最近有人將GeneXpert技術(shù)直接用于深部痰標(biāo)本中篩選腸桿菌科細(xì)菌基因，結(jié)果顯示其對(duì)blaKPC和blaNDM兩種基因型的靈敏度較高，有望成為直接在已知存在blaKPC和blaNDM型耐藥菌感染風(fēng)險(xiǎn)的痰標(biāo)本中檢測(cè)和鑒定腸桿菌科細(xì)菌的潛在工具[19]。但這種檢測(cè)方法的局限性是不能檢測(cè)到新出現(xiàn)的或罕見(jiàn)的碳青霉烯酶基因，對(duì)于疑似產(chǎn)生碳青霉烯酶的菌株和陰性試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)在參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步評(píng)估是否存在碳青霉烯酶基因[20]。與其他兩種方法相比，GeneXpert 這種分子方法具有更快地識(shí)別所涉及的耐藥基因、能夠允許迅速開(kāi)始適當(dāng)治療的優(yōu)勢(shì)[21]。

綜上所述，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌對(duì)于優(yōu)化抗生素管理、控制感染、改善預(yù)后、減緩耐藥菌的發(fā)展至關(guān)重要。臨床實(shí)驗(yàn)室可以將GeneXpert 技術(shù)作為快速檢測(cè)碳青霉烯耐藥基因的首要選擇，為危急患者爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。