兩階段轉(zhuǎn)速調(diào)控對(duì)納豆芽胞桿菌合成維生素K2的影響

馮靜靜，吳 靜，李 偉，周夢(mèng)潔，胡汶松，汪 劍，薛正蓮，2，王 洲，2，劉 艷*，2

（1.安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.微生物發(fā)酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖 241000）

維生素K2（VK2，MK-n）是一種重要的脂溶性維生素，在血液凝固和預(yù)防骨質(zhì)疏松癥中發(fā)揮重要作用，并具有降低與心血管相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)，以及抗腫瘤、改善Ⅱ型糖尿病患者的骨質(zhì)、改善早期膝骨關(guān)節(jié)炎、保護(hù)腎功能等作用[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由于人口老齡化、久坐不動(dòng)和維生素D缺乏癥日益嚴(yán)峻，導(dǎo)致2010年全世界約900萬例骨折，因此研究預(yù)防骨質(zhì)疏松的高效率產(chǎn)品迫在眉睫[4]。而維生素K2作為預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的有效藥物，其價(jià)格昂貴、產(chǎn)量低、供不應(yīng)求。維生素K2也被稱為甲萘醌（menaquinoe），它的萘醌環(huán)與4~13個(gè)異戊二烯單元組成的可變側(cè)鏈相連，生成一系列被稱為MK-n的異構(gòu)體，其中n代表異戊二烯單元的個(gè)數(shù)[5]。

甲萘醌是呼吸鏈中重要的電子傳遞載體，因此很多微生物都可以產(chǎn)生甲萘醌。不同的菌株可以產(chǎn)生不同類型的甲萘醌[6]，納豆芽胞桿菌（Bacillus subtilis natto，Bsn）能夠產(chǎn)生MK-4~MK-8的MK同系物，MK-7占比可達(dá)96%，而黃桿菌主要產(chǎn)生MK-4和MK-6，一些腸道微生物如乳球菌、腸球菌也可以產(chǎn)生MKs[7-9]。納豆芽胞桿菌具有食用安全的特點(diǎn)以及發(fā)酵產(chǎn)生的MK-7含量高，被認(rèn)為是微生物生產(chǎn)MK-7最主要和最有發(fā)展?jié)摿Φ木闧10]。近年來維生素K2（MK-7）的制備和產(chǎn)業(yè)化已成為研究的熱點(diǎn)。目前，獲取維生素K2的方法主要有微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法[11]，化學(xué)合成法通常具有產(chǎn)生低活性的順式異構(gòu)體、副產(chǎn)物以及造成環(huán)境污染等弊端，而微生物發(fā)酵法所得產(chǎn)品的生物活性較高，因此廣受青睞。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)具體研究發(fā)酵過程中各個(gè)參數(shù)之間的關(guān)系，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、基質(zhì)消耗、產(chǎn)物生成速率之間的變化規(guī)律以及環(huán)境因素對(duì)三者的影響[12-13]，三者相輔相成，形成錯(cuò)綜復(fù)雜的體系。張敏[14]等人將發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型應(yīng)用于糞腸乳酸球菌產(chǎn)γ-氨基丁酸（GABA），使GABA產(chǎn)量提高了60.1%。圣亞春[15]等人基于發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的分析，使丁醇產(chǎn)量提升了210.3%。通過發(fā)酵動(dòng)力學(xué)分析，能夠深入研究微生物的新陳代謝規(guī)律，為后續(xù)產(chǎn)業(yè)化的過程控制以及工藝的優(yōu)化提供理論支撐。

生物膜（biofilm，BF）是具有高度組織性的微生態(tài)系統(tǒng)，是細(xì)菌由浮游的單細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殪o止的多細(xì)胞狀態(tài)的過程，隨后的生長(zhǎng)導(dǎo)致了有組織的群落以及細(xì)胞分化[16]。它能夠附著在非生物介質(zhì)的表面以及氣液相交的界面上，分泌的細(xì)胞外聚合物（extracellular poly-mericsubatances，EPS）主要包括胞外多糖、胞外蛋白、胞外DNA（extracellular DNA，eDNA），以此來增強(qiáng)對(duì)外界不利環(huán)境的抗性以及耐受能力[17-18]。有研究提到枯草芽孢桿菌生物膜的形成有利于維生素K2的產(chǎn)生[19]。靜置發(fā)酵能夠產(chǎn)生大量疏水性的生物膜，作者通過分析不同條件下（0、200 r/min）發(fā)酵進(jìn)程曲線與發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以及對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液進(jìn)行稀釋涂布和掃描電鏡觀察菌體形態(tài)變化，明確菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間的關(guān)系，根據(jù)結(jié)果提出分階段轉(zhuǎn)速調(diào)控的方法，并對(duì)其發(fā)酵條件（溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH和時(shí)間）進(jìn)行正交優(yōu)化，進(jìn)一步提高納豆芽胞桿菌合成維生素K2的產(chǎn)量，同時(shí)也為大規(guī)模生產(chǎn)維生素K2提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌種

納豆芽胞桿菌GMCC2108 （Bacillus subtilis natto）：由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試劑

正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇（均為色譜純）、冰醋酸、結(jié)晶紫、乙醇、戊二醛（均為分析純）：購(gòu)于上海生工。

萃取液為V正己烷∶V異丙醇=2∶1

流動(dòng)相為V二氯甲烷∶V甲醇=1∶9

1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，瓊脂20；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5；pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白胨50，酵母粉20，甘油50，K2HPO43.86，KH2PO41.62；121℃滅菌20 min。

1.4 培養(yǎng)方法

將在LB固體培養(yǎng)基上活化的納豆芽胞桿菌接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以體積分?jǐn)?shù)2%將種子液接入50 mL/250 mL的搖瓶中，37℃于0 r/min與200 r/min分別發(fā)酵。

1.5 分析方法

1.5.1 生物量的測(cè)定按照1.4的培養(yǎng)方法，發(fā)酵至相應(yīng)時(shí)間，將菌液全部吸出離心，去除培養(yǎng)基，用PBS（7.4）緩沖液洗滌2~3遍，以完全去除培養(yǎng)基，離心稱濕質(zhì)量，即為生物量（g/L）。

1.5.2 不同轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵前期菌落數(shù)比較在不同轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)至所需要的時(shí)間，將發(fā)酵液稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛韧坎迹谙嗤瑵舛认卤容^菌落數(shù)量。

1.5.3 維生素K2產(chǎn)量的測(cè)定維生素K2標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品的測(cè)定參照文獻(xiàn)[19]。

1.5.4 甘油殘余量的測(cè)定甘油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以及樣品的測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]。

1.5.5 掃描電子顯微鏡樣品的制備樣品制備參照文獻(xiàn)[21]。

1.6 不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立

1.6.1 菌體生長(zhǎng)模型Logistic方程是典型的S形曲線，可以很好地反應(yīng)菌體濃度的增加對(duì)自身生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用，且達(dá)到穩(wěn)定期后菌體不再生長(zhǎng)，納豆芽胞桿菌的生長(zhǎng)過程可以用Logistic方程來描述，公式（1）。

式中：X為生物量，g/L；Xm為最大生物量，g/L；μm為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；t為發(fā)酵時(shí)間，h。

1.6.2 產(chǎn)物生成模型根據(jù)判斷細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成在時(shí)間上的關(guān)系，可將其分為3類。當(dāng)α≠0，β=0時(shí)為Ⅰ類發(fā)酵，即偶聯(lián)型發(fā)酵；當(dāng)α≠0，β≠0時(shí)，為Ⅱ類發(fā)酵，即部分偶聯(lián)型發(fā)酵；當(dāng)α=0，β≠0時(shí)，為Ⅲ類發(fā)酵，即非偶聯(lián)型發(fā)酵[14]，見公式（2）。

式中：P為維生素K2產(chǎn)量，g/L。

1.6.3 底物消耗模型維生素K2發(fā)酵過程中，甘油的消耗主要用于3個(gè)方面[22]，即甘油分解后產(chǎn)生的3-磷酸-甘油醛可以與丙酮酸通過DXP途徑合成維生素K2的異戊二烯側(cè)鏈部分；供納豆芽胞桿菌生長(zhǎng)；為維生素K2的合成提供前體，促進(jìn)菌體合成維生素K2。甘油消耗模型見公式（3）。

式中：S為甘油質(zhì)量濃度，g/L；Yx/s為納豆芽胞桿菌對(duì)甘油得率，g/g；Yp/s為發(fā)酵產(chǎn)物維生素K2對(duì)甘油得率，g/g；m為維持系數(shù)，g/（g·h）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同轉(zhuǎn)速下維生素K2發(fā)酵進(jìn)程曲線及動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析

研究了不同轉(zhuǎn)速下（0、200 r/min）菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成的關(guān)系，結(jié)果見圖1。圖中各點(diǎn)為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，當(dāng)轉(zhuǎn)速為0時(shí)，菌體能夠形成很厚的疏水性生物膜（圖2），使生物量大大提高，在48 h時(shí)生物量達(dá)到最大，為（67.08±2.1）g/L。之后隨著生物膜的溶解，生物量隨之緩慢下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)生物量為（63.21±1.3）g/L，比轉(zhuǎn)速為200 r/min時(shí)要高很多?？赡艿脑蚴牵壕w在形成生物膜之后產(chǎn)生的胞外聚合物對(duì)菌體具有保護(hù)和抵御外界不良環(huán)境的作用，而未形成生物膜的菌體只是一少部分，少量菌體自溶；維生素K2產(chǎn)量在108 h達(dá)到最大值，為（21.32±0.08）mg/L。此時(shí)，甘油消耗殆盡，無法繼續(xù)供給菌體生長(zhǎng)所需的能量，甘油除了供微生物生長(zhǎng)之外，還能夠?yàn)榫S生素K2的合成提供前體，促進(jìn)菌體合成維生素K2；隨后維生素K2產(chǎn)量的下降主要體現(xiàn)在兩方面[23-24]：一是維生素K2受到光解作用；二是位于細(xì)胞膜上的維生素K2在納豆芽胞桿菌的電子傳遞系統(tǒng)中作為電子載體參與電子傳遞鏈。而pH的升高是由于蛋白質(zhì)水解和隨之而來的氨化作用導(dǎo)致的[25]。

圖1 不同恒定轉(zhuǎn)速條件下納豆芽胞桿菌產(chǎn)維生素K2發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig.1 Times courses of VK2 production by Bacillus subtilis natto at various constant rotational speed

圖2 生物膜的疏水性Fig.2 Hydrophobicity of biofilms

當(dāng)增加轉(zhuǎn)速（200 r/min）時(shí)，最大生物量為（27.2±0.2）g/L，此時(shí)甘油所剩無幾，菌體生長(zhǎng)受到限制。發(fā)酵過程中pH總體趨勢(shì)降低，可能是由于氮源代謝，氨基酸中的—NH2被利用后導(dǎo)致pH下降，過低的pH影響溶液的化學(xué)性質(zhì)和氧化還原電位，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，使菌株對(duì)基質(zhì)的利用速率降低，從而影響產(chǎn)物的合成。發(fā)酵結(jié)束時(shí)維生素K2的產(chǎn)量為（3.68±0.09）mg/L，遠(yuǎn)低于0 r/min時(shí)的產(chǎn)量。納豆芽胞桿菌發(fā)酵時(shí)會(huì)產(chǎn)生表面活性物質(zhì)和酶類，可能對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從而使維生素K2的合成受到影響。雖然0 r/min培養(yǎng)的生物膜生物量高于200 r/min培養(yǎng)的生物量，但是將其稀釋涂布，發(fā)現(xiàn)其菌落數(shù)量小于200 r/min下培養(yǎng)的菌落數(shù)量，見圖3。可能的原因是：搖動(dòng)培養(yǎng)時(shí)，細(xì)菌能夠很快增殖產(chǎn)生大量菌體；靜置發(fā)酵時(shí)在氣液界面產(chǎn)生大量生物膜，其主要成分為胞外多糖、胞外蛋白質(zhì)和eDNA，生物膜的產(chǎn)生使靜置發(fā)酵的生物量比搖動(dòng)培養(yǎng)的生物量高；測(cè)定菌落數(shù)時(shí)用的是發(fā)酵液，而靜置發(fā)酵的菌體大部分被生物膜吸附粘連很難洗脫，因此，靜置發(fā)酵的菌落數(shù)沒有搖動(dòng)培養(yǎng)的菌落數(shù)多。

圖3 不同轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至12、24、36、48、60、72 h的菌落數(shù)量Fig.3 Number of colonies between different rotating speeds at 12,24,36,48,60 and 72 h

綜上所述，適合菌體生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)速和維生素K2合成所需的最適轉(zhuǎn)速并不統(tǒng)一。據(jù)文獻(xiàn)[26]報(bào)道，低轉(zhuǎn)速可以使孢子的產(chǎn)生時(shí)間推遲，有利于維生素K2產(chǎn)量的提高，而增加轉(zhuǎn)速可以使氧氣的供應(yīng)量升高，有助于菌體的生長(zhǎng)。因此，恒定的轉(zhuǎn)速不能使菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成同時(shí)達(dá)到最佳的效果，為使兩者同時(shí)達(dá)到最佳狀態(tài)，提出分階段轉(zhuǎn)速控制發(fā)酵合成維生素K2。

2.2 不同轉(zhuǎn)速下菌體形態(tài)的變化

如圖4所示，對(duì)不同條件下（0、200 r/min）的菌體形態(tài)利用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，0 r/min、24 h時(shí)菌體形態(tài)正常，箭頭所指為胞外聚合物；48 h時(shí)菌體表面有輕微褶皺；96 h出現(xiàn)大面積褶皺至發(fā)酵結(jié)束。而在200 r/min條件下，0~48 h菌體形態(tài)正常；72 h菌體開始破裂至發(fā)酵結(jié)束，但沒有破裂的菌體表面潤(rùn)滑平坦。菌體形態(tài)產(chǎn)生的差異可能是導(dǎo)致維生素K2產(chǎn)量產(chǎn)生差異的原因之一。

圖4 不同固定轉(zhuǎn)速下各時(shí)間點(diǎn)的菌體形態(tài)Fig.4 Morphology of bacteria at different time points at different constant rotational speed

2.3 不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的分析

2.3.1 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)公式的求解當(dāng)t=0時(shí)，X=X0，P=P0，S=S0，求得的公式（4）、（5）、（6）分別為：

將兩種不同轉(zhuǎn)速培養(yǎng)條件下的發(fā)酵參數(shù)作為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過1stOpt軟件撰寫程序，對(duì)上述動(dòng)力學(xué)方程采用通用全局優(yōu)化算法（First Optimization），不需設(shè)置初始值，便能找出最優(yōu)解，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)求出模型最優(yōu)參數(shù)估計(jì)值，結(jié)果見表1~2。

由表1~2可知，兩種轉(zhuǎn)速培養(yǎng)條件下的α和β值均不為0，說明菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間為部分偶聯(lián)關(guān)系；參數(shù)估計(jì)值顯示靜態(tài)發(fā)酵時(shí)μm、YP/S、YX/S大于動(dòng)態(tài)發(fā)酵時(shí)的值，說明靜態(tài)發(fā)酵有利于維生素K2的生物合成，雖然靜態(tài)發(fā)酵時(shí)Xm的值比動(dòng)態(tài)發(fā)酵時(shí)的值要高很多，但是將兩種不同條件下的發(fā)酵液進(jìn)行稀釋涂布發(fā)現(xiàn)靜態(tài)培養(yǎng)條件下的菌落數(shù)明顯少于動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的菌落數(shù)，可能的原因是靜態(tài)培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的生物膜成分主要為胞外多糖、胞外蛋白以及少量的eDNA，使生物膜生物量升高，但菌體數(shù)量少于動(dòng)態(tài)培養(yǎng)，證明維生素K2產(chǎn)量的提高并不是由于生物量的升高而增加，可能是由于產(chǎn)生生物膜之后的一系列生理活動(dòng)引起的。

表1 0 r/min發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)預(yù)估值Table 1 Parameter estimation of the shake flask（0 r/min）fermentation kinetics model

對(duì)于要想獲得更大的維生素K2產(chǎn)量，通過改變和優(yōu)化培養(yǎng)條件，盡可能減小維持系數(shù)m，使得μ值變大以及更高的菌體生物量X，是提高維生素K2產(chǎn)量行之有效的方法，通過比較靜態(tài)與動(dòng)態(tài)發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)估值，從表3~4可以看出，細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成和底物消耗的預(yù)估值與實(shí)驗(yàn)值接近，說明此模型能較好地反映納豆芽胞桿菌在250 mL搖瓶中0、200 r/min發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)。

表3 0 r/min發(fā)酵實(shí)驗(yàn)值與預(yù)估值比較Table 3 Experimental value of shake flask（0 r/min）fermentation compared with the predicted value

表2 200 r/min發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)預(yù)估值Table 2 Parameter estimation of the shake flask（200 r/min）fermentation kinetics model

表4 200 r/min發(fā)酵實(shí)驗(yàn)值與預(yù)估值比較Table 4 Experimental value of shake flask（200 r/min）fermentation compared with the predicted value

2.4 兩階段轉(zhuǎn)速控制策略發(fā)酵條件的優(yōu)化

根據(jù)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)合不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的理論驗(yàn)證，證明菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成之間為部分偶聯(lián)關(guān)系。若在相同的接種體積分?jǐn)?shù)下培養(yǎng)，在發(fā)酵前期，0 r/min的菌落數(shù)不及200 r/min的菌落數(shù)，且生物膜形成的時(shí)間長(zhǎng)，因此將分階段轉(zhuǎn)速調(diào)控方法用于發(fā)酵培養(yǎng)，并對(duì)影響其發(fā)酵的條件（溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH、時(shí)間）進(jìn)行正交優(yōu)化，每個(gè)因素4個(gè)水平，采用L16（45）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，每組3個(gè)重復(fù)。

由表6試驗(yàn)結(jié)果的極差分析可知，4個(gè)因素影響納豆芽胞桿菌產(chǎn)維生素K2的次序?yàn)镈（時(shí)間/h）、A（溫度/℃）、C（初始pH）、B（轉(zhuǎn)速r/min）。正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)組合為溫度40℃、初始pH 6.5、0~36 h控制轉(zhuǎn)速220 r/min，36~132 h轉(zhuǎn)速為0 r/min，維生素K2的產(chǎn)量達(dá)到（35.60±0.13）mg/L，比優(yōu)化前（0 r/min和200 r/min）分別提高了1.67倍和9.674倍。因此，該方案可行，兩階段轉(zhuǎn)速控制方法可以有效地提高納豆芽胞桿菌合成維生素K2的能力，為維生素K2的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

表5 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 5 Factor level table

表6 L16（45）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Result of L16（45）orthogonal test

3 結(jié)語

分析不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵過程曲線與動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并用掃描電鏡觀察菌體的形態(tài)變化。掃描電鏡結(jié)果顯示，0 r/min發(fā)酵后期菌體表面形態(tài)出現(xiàn)明顯的褶皺，但菌體很少破裂；對(duì)于200 r/min培養(yǎng)的菌體，在72 h菌體出現(xiàn)破裂、自溶現(xiàn)象，但正常菌體表面光滑平整無異常。根據(jù)不同條件下菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成的關(guān)系，利用發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型證明兩者之間的關(guān)系為部分偶聯(lián)型，提出分階段轉(zhuǎn)速調(diào)控的方法進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)影響其發(fā)酵的條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：溫度40℃、初始pH 6.5、0~36 h控制轉(zhuǎn)速220 r/min、36~132 h轉(zhuǎn)速為0 r/min，維生素K2的產(chǎn)量達(dá)到（35.60±0.13）mg/L，比優(yōu)化前（0 r/min和200 r/min）分別提高了1.67倍和9.674倍，這使納豆芽胞桿菌合成維生素K2的能力顯著提高，為進(jìn)一步大量生產(chǎn)維生素K2提供了依據(jù)。