薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油對川芎嗪納米粒跨血腦屏障模型轉(zhuǎn)運行為的影響

張翼 楊凱麗 畢嘉謠 王迪磊 郭子碩 杜守穎 李鵬躍

缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease, ICVD)是指因腦部血液供應(yīng)障礙而導(dǎo)致的相應(yīng)供血區(qū)腦組織缺血、缺氧、壞死或軟化[1]。ICVD是導(dǎo)致人類死亡的三大主要疾病之一，占全部腦血管疾病的70%左右[2]。在治療ICVD的中藥方劑中常配伍使用各類芳香開竅藥以取其通關(guān)利竅之效。揮發(fā)油是芳香類中藥中的一類重要成分，現(xiàn)代研究顯示，多種揮發(fā)油能夠提高藥物入腦藥量，提高藥物的腦組織分布[3-4]。但同時應(yīng)注意的是，大量的經(jīng)皮遞藥實驗顯示揮發(fā)油具有一定的刺激性，在研究及應(yīng)用時應(yīng)予以重視。

川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從傘形科藁本屬植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)中提取的活性生物堿單體成分，主要用于治療ICVD。但藥動力學(xué)研究顯示，川芎嗪在體內(nèi)代謝迅速，排泄快，生物利用率低[5]，導(dǎo)致其在腦組織分布較低。目前研究顯示納米制劑能夠在一定程度上提高藥物的腦靶向性，如孫德清[6]制備了聚乳酸—羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]納米粒(nanoparticles,NPs)，經(jīng)靜脈注射途徑給藥，提高了乙酰葛根素在腦組織中的分布。

基于上述認(rèn)識，本研究擬采用bEnd.3細胞構(gòu)建體外細胞模型，對薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油對血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)的生物相容性進行研究；同時構(gòu)建川芎嗪納米粒(TMP-PLGA-NPs)，在生物相容性良好的前提下配伍薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油，探索二者對TMP-PLGA-NPs跨膜轉(zhuǎn)運的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株

小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(bEnd.3 細胞，資源編號：ATCC CRL-2299)購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection, ATCC)。

1.2 主要儀器

電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，BSA 224S]；高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，Agilent 1100)；電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司，HH-6)；超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-ⅡD)；超聲波清洗機(寧波新苓生物科技股份有限公司，SB25-12DTD)；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司，SHB-III)；二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Binder公司，C170)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司，CKX41-A22PHP)；臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL80-2B)； -80℃超低溫冰箱(美國Thermo公司，Revco PLUS)；細胞電阻儀(美國Merck公司，Millcell?ERS-2)；12 孔Transwell細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司，配有0.4 μm孔徑聚酯膜)。

1.3 主要試劑與試藥

磷酸川芎嗪對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100845-201603)；2,3,5,6-四甲基吡嗪(北京華威銳科化工有限公司)；酯封端聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA 75/25 COOR,山東濟南岱罡生物有限公司)；L-薄荷醇(貨號01002845)、蘇合香揮發(fā)油(貨號01028128)均購于北京偶合科技有限公司；二氯甲烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、冰乙酸(色譜純)，均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；聚乙烯醇1788(上海麥克林生化科技有限公司)；甲醇(Fisher公司，色譜級)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；DMEM 高糖培養(yǎng)基(美國 Gibco 公司，貨號C11995500BT)；胎牛血清FBS(美國Gemini公司，貨號100-700)；PBS緩沖液(Solarbio公司，貨號P1020)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑蘭，MTT)(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，貨號bn30793)；二甲基亞砜DMSO(美國 Sigma-Aldrich 公司，貨號D2438)；無血清細胞凍存液(蘇州新賽美生物科技有限公司，貨號C40100)。

1.4 細胞培養(yǎng)

將bEnd.3細胞置于含10% FBS、1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基的25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱環(huán)境下培養(yǎng)，隔天換液。當(dāng)培養(yǎng)瓶中bEnd.3細胞的覆蓋率達到70～80%時，以胰蛋白酶消化并傳代。

1.5 薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油細胞相容性實驗研究

本研究擬采用MTT實驗對薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油與bEnd.3細胞的生物相容性進行研究。將處于對數(shù)生長期的bEnd.3細胞以5×104/mL密度接種于96孔板，每孔終體積100 μL。細胞培養(yǎng)24小時后棄去原培養(yǎng)基，加入配制好的含藥培養(yǎng)基，組別設(shè)置有TMP-PLGA-NPs 100～1000倍稀釋液、TMP-PLGA-NPs 100～1000倍稀釋液+25 μg/mL促透劑(薄荷醇/蘇合香油)、TMP-PLGA-NPs 100～500倍稀釋液+50 μg/mL促透劑(薄荷醇/蘇合香油)、TMP-PLGA-NPs 100～1000倍稀釋液+75 μg/mL促透劑(薄荷醇/蘇合香油)，此外，對照組僅加入新鮮的DMEM高糖培養(yǎng)基。按照“1.4”項下條件培養(yǎng)6小時后，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液10 μL，37℃下繼續(xù)孵育4小時。終止培養(yǎng)后小心吸棄藥液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度(A)，計算細胞存活率。選取細胞存活率≥95%且與對照組采用獨立樣本t檢驗無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)組的稀釋倍數(shù)作為非細胞毒劑量，即安全給藥劑量。

1.6 TMP-PLGA-NPs的制備及藥劑學(xué)性質(zhì)評價

1.6.1 TMP-PLGA-NPs的制備 采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備TMP-PLGA-NPs。精密稱取10 mg TMP、150 mg PLGA溶于0.7 g 二氯甲烷中，待完全溶解后加入0.3 g乙酸乙酯，構(gòu)成有機相；另取一定量的聚乙烯醇溶于娃哈哈水中，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、0.5%的聚乙烯醇水溶液，作為水相；精密稱取2% 聚乙烯醇水溶液5 g置于上述混合有機相中，于冰浴條件下細胞破碎儀超聲10分鐘(200 W，超聲2秒，停頓2秒)，加入0.5% 聚乙烯醇水溶液5 g，以相同條件再次超聲10分鐘后，置于磁力攪拌器上，室溫下攪拌6小時，靜置24小時揮去有機溶劑，即得TMP-PLGA-NPs混懸液。

1.6.2 TMP-PLGA-NPs的形態(tài)觀察 通過透射電子顯微鏡對TMP-PLGA-NPs的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行觀測。將TMP-PLGA-NPs稀釋至合適的濃度，滴加在覆蓋碳膜的銅網(wǎng)上，30秒后用濾紙從邊緣吸除水分，滴加1% 醋酸鈾水溶液，染色10秒，用濾紙吸去染液，將銅網(wǎng)置濾紙上自然干燥，置透射電鏡下觀察并拍照。

1.6.3 TMP-PLGA-NPs的粒徑測定 取TMP-PLGA-NPs 100 μL，娃哈哈純凈水稀釋至1 mL，混勻，用馬爾文粒度電位儀測定樣品的粒徑分布情況。

1.6.4 TMP-PLGA-NPs存放穩(wěn)定性的初步考察 將依照處方制備的TMP-PLGA-NPs混懸液置于室溫下保存，于1、2、3、4、5、6、7天分別取樣，觀察制劑外觀，并測定粒徑及載藥量，考察各指標(biāo)的變化。

1.7 轉(zhuǎn)運樣品中TMP含量測定方法的建立

1.7.1 色譜條件 色譜柱為Waters Xselect?HSS T3 Column(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.5%醋酸(70∶30)；體積流量為0.5 mL/min；檢測波長為282 nm；柱溫30℃。

1.7.2 對照品溶液的制備 取磷酸川芎嗪對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含120 μg/mL的磷酸川芎嗪對照品儲備液。

1.7.3 轉(zhuǎn)運實驗供試品溶液的制備 于接收池內(nèi)取樣600 μL，添加一倍量50%甲醇，渦旋2 分鐘，超聲5分鐘，4℃ 10 000 r/min離心10分鐘，取1 mL上清液，即得。

1.8 轉(zhuǎn)運樣品中TMP含量測定方法學(xué)考察

1.8.1 專屬性試驗 分別吸取空白DMEM培養(yǎng)液、TMP對照品溶液以及轉(zhuǎn)運后樣品溶液進行高效液相色譜分析，分析上述各實驗組出峰位置，確保樣品溶液出峰位置無干擾以測定方法專屬性。

1.8.2 精密度試驗 取濃度為2.4200 μg/mL的磷酸川芎嗪對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.8.3 重復(fù)性試驗 取空白DMEM培養(yǎng)基配制的濃度為2.4200 μg/mL的磷酸川芎嗪溶液600 μL，添加一倍量50%甲醇，渦旋2分鐘，超聲5分鐘，4℃ 10 000 r/min離心10分鐘，取1 mL上清液，按照1.7.1項下色譜條件進樣，平行操作6份，記錄峰面積并計算RSD。

1.8.4 穩(wěn)定性試驗 取空白DMEM培養(yǎng)基配制的濃度為1.0020 μg/mL的磷酸川芎嗪溶液600 μL，添加一倍量50%甲醇，渦旋2分鐘，超聲5分鐘，4℃ 10 000 r/min離心10分鐘，取1 mL上清液，分別于 0、2、4、8、12、24小時進樣記錄峰面積并計算RSD。

1.8.5 加樣回收率試驗 取空白DMEM培養(yǎng)基配制的低、中、高濃度分別為0.1002、0.5010、1.0080 μg/mL磷酸川芎嗪對照品溶液600 μL，添加一倍量50%甲醇，渦旋2分鐘，超聲5分鐘，4℃ 10 000 r/min離心10分鐘，取1 mL上清液，高效液相色譜測定TMP含量，計算回收率RSD值。

1.9 TMP-PLGA-NPs跨細胞單層轉(zhuǎn)運研究

1.9.1 bEnd.3細胞單層模型的構(gòu)建 將處于對數(shù)生長期的細胞以2.5×105/mL的密度、0.5 mL的體積接種于配有聚碳酸酯膜(孔徑0.4 μm，面積1.12 cm2)的12孔Transwell細胞培養(yǎng)板頂側(cè)(AP)細胞培養(yǎng)池中，底側(cè)(BL)加入1.5 mL相應(yīng)培養(yǎng)基，移入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，隔天更換Transwell細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，觀察細胞生長狀態(tài)，并使用電阻儀測定細胞跨膜電阻值(trans-epithelial electrical resistance,TEER)。bEnd.3細胞TEER值生長到55～70 Ω·cm2時，在AP側(cè)新添一定量的培養(yǎng)基，使AP側(cè)液面上升至明顯高于BL側(cè)液面，培養(yǎng)4小時后測定液面差有無變化。若bEnd.3細胞TEER值生長到55～70 Ω·cm2，且液面差無變化(如圖1所示)，表明其細胞單層具有足夠的緊密連接和完整性，可用以進行藥物轉(zhuǎn)運實驗[7]。

1.9.2 TMP-PLGA-NPs跨BBB模型轉(zhuǎn)運實驗研究 取符合1.9.1項下條件的轉(zhuǎn)運孔，在實驗前用預(yù)熱的PBS清洗3次，加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含10% FBS)，在37 ℃培養(yǎng)箱中溫孵20分鐘，棄掉培養(yǎng)基。用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制TMP-PLGA-NPs 100倍稀釋液、TMP-PLGA-NPs 100倍稀釋液+薄荷醇(50 μg/mL)、TMP-PLGA-NPs 100倍稀釋液+蘇合香油(50 μg/mL)。在AP側(cè)至BL側(cè)的轉(zhuǎn)運中，AP側(cè)加上述藥液0.5 mL，作為供給池；同時取空白DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基1.5 mL，加于BL側(cè)，作為接收池。給藥后，在30、60、120、180、240、300、360分鐘時，從接收池中取樣600 μL，隨即補充相同溫度和體積的空白DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按照1.7.1項下色譜條件，高效液相色譜法檢測TMP的含量，繪制TMP的累積透過量-時間曲線，計算表觀滲透系數(shù)(Papp)。

式中Papp為表觀滲透系數(shù)(cm/s)；dQ/dt為TMP轉(zhuǎn)運速率；A為聚碳酸酯膜面積；C0為TMP在供給池中的初始濃度。

圖1 bEND.3細胞單層的試漏實驗

1.9.3 跨膜轉(zhuǎn)運TEER值檢測 TEER與細胞間緊密連接的完整性相關(guān)，細胞生長越緊密，TEER值越大，因而常通過TEER值表征細胞單層膜結(jié)構(gòu)的完整性及藥物轉(zhuǎn)運的阻力大小。取符合1.9.1項下條件的轉(zhuǎn)運孔，給藥后分別于0、30、60、120、180、240、300、360分鐘，使用Millcell?ERS-2細胞電阻儀測定各孔細胞的TEER值，計算TEER百分率并繪制TEER百分率-時間曲線。

式中TEER(%)為電阻值百分率，TEERt為各時間點的電阻值，TEER0為0時間點的電阻值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油的細胞相容性

如表1～3所示，無論是否添加不同濃度涼性促透劑薄荷醇，TMP-PLGA-NPs稀釋100倍～1000倍，bEnd.3細胞的存活率均≥95%；TMP-PLGA-NPs稀釋100～500倍后分別配伍25、50、75 μg/mL的薄荷醇均未顯示細胞毒性；而TMP-PLGA-NPs稀釋100～500倍后配伍75 μg/mL的蘇合香揮發(fā)油，具有顯著的細胞毒性(P<0.05)，配伍25、50 μg/mL的蘇合香揮發(fā)油則不具有細胞毒性。

為了在保障細胞生物相容性的條件下對比薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油對TMP-PLGA-NPs跨膜轉(zhuǎn)運的影響，故統(tǒng)一采用50 μg/mL的濃度進行后續(xù)實驗。

表1 TMP-PLGA-NPs不同稀釋倍數(shù)下bEnd.3細胞存活率

表2 TMP-PLGA-NPs配伍不同濃度薄荷醇的bEnd.3細胞存活率

表3 TMP-PLGA-NPs配伍不同濃度蘇合香揮發(fā)油的bEnd.3細胞存活率

2.2 TMP-PLGA-NPs藥劑學(xué)性質(zhì)評價結(jié)果

2.2.1 形態(tài)觀察 透射電子顯微鏡結(jié)果顯示，TMP-PLGA-NPs為實心球結(jié)構(gòu)，表面光滑圓整，分散性好，無粘連，見圖2。

圖2 TMP-PLGA-NPs透射電鏡圖

2.2.2 粒徑測定 由粒徑分析結(jié)果可知，平均粒徑為(152.9±2.6)nm，聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index,PDI)為(0.101±0.017)，粒徑分布見圖3。

2.2.3 穩(wěn)定性初步研究 由圖4可知,TMP-PLGA-NPs在室溫下保存7天粒徑、PDI、載藥量無顯著變化，基本保持穩(wěn)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取1.7.2項下對照品儲備液適量，加空白DMEM培養(yǎng)基配制成系列質(zhì)量濃度分別為0.1002、0.5010、1.0020、1.5030、2.0040、2.5050 μg/mL的磷酸川芎嗪對照品溶液。按照1.7.1項下色譜條件進樣，記錄峰面積，并以峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸。結(jié)果顯示川芎嗪質(zhì)量濃度的回歸方程為Y=187.9X+4.0444，r=0.9997，表明川芎嗪在0.1002～2.5050 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 轉(zhuǎn)運樣品中TMP含量測定方法學(xué)實驗結(jié)果

2.4.1 專屬性試驗 由圖5可見，TMP的保留時間約為8.75分鐘，TMP色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于 1.5，且空白對照在相應(yīng)位置上未見色譜峰，方法專屬性良好。

2.4.2 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗結(jié)果 將1.8中各組樣品按照相應(yīng)方法條件檢測后，得出實驗結(jié)果，見表4。

表4 轉(zhuǎn)運樣品中TMP含量測定方法學(xué)實驗結(jié)果

2.5 TMP-PLGA-NPs跨細胞單層轉(zhuǎn)運結(jié)果

2.5.1 不同促透劑對TMP-PLGA-NPs跨細胞單層轉(zhuǎn)運的影響 隨時間延長各組累積轉(zhuǎn)運量呈增長趨勢。TMP-PLGA-NPs的Papp值為15.9199×10-6cm/s，配伍薄荷醇組、蘇合香油組Papp值分別為15.5661×10-6cm/s、15.1416×10-6cm/s，均無顯著性差異。提示在當(dāng)前配伍濃度(50 μg/mL)下薄荷醇、蘇合香油對TMP-PLGA-NPs跨細胞單層轉(zhuǎn)運并無影響。見圖6。

2.5.2 不同促透劑對轉(zhuǎn)運過程中細胞TEER值的影響 由圖7可見，在給予不同濃度薄荷醇、蘇合香油后，細胞單層TEER值的變化趨勢與單獨給予TMP-PLGA-NPs組相近，整體均呈現(xiàn)下降趨勢。

圖3 TMP-PLGA-NPs粒徑分布圖

圖4 TMP-PLGA-NPs穩(wěn)定性考察

圖5 空白DMEM培養(yǎng)液(A)、TMP對照品溶液(B)和TMP-PLGA-NPs樣品溶液(C)的高效液相色譜圖

圖6 TMP-PLGA-NPs配伍薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油的

圖7 不同促透劑對bEnd.3細胞單層TEER值的影響

3 討論

現(xiàn)代研究表明，芳香開竅成分可通過提高細胞膜的流動性，影響細胞骨架結(jié)構(gòu)等發(fā)揮促透作用，是良好的化學(xué)促透劑。當(dāng)前，促透技術(shù)常應(yīng)用于經(jīng)皮遞藥研究，而對于其對藥物跨BBB轉(zhuǎn)運的研究相對較少，且促透劑的促透作用與刺激性通常相伴存在，為此本研究初步構(gòu)建“納米制劑+芳香開竅成分”聯(lián)用系統(tǒng)，能夠在降低促透劑刺激性的同時提高藥物滲透性，為化學(xué)、藥劑學(xué)的聯(lián)用提供了一定的實驗依據(jù)。

腦微血管內(nèi)皮細胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)是BBB的主要結(jié)構(gòu)。小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(bEnd.3)是目前國際公認(rèn)的一種血管內(nèi)皮細胞株，其生長迅速并高水平表達緊密連接蛋白，是體外模擬BBB的常用細胞模型。

在對TMP-PLGA-NPs進行跨膜轉(zhuǎn)運研究前，為了保障薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油對模型細胞無損傷作用，首先以細胞存活率為指標(biāo)，采用MTT法對薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油對bEnd.3細胞的生物相容性進

行了研究。實驗結(jié)果顯示，相對于薄荷醇而言，蘇合香揮發(fā)油毒性更大，為了保障試驗的對照性和均衡性原則，故統(tǒng)一設(shè)計薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油的濃度為50 μg/mL。

本研究采用乳化—溶劑揮發(fā)法制備了TMP-PLGA-NPs，納米粒表面光滑圓整，分散性好，無黏連，粒徑均勻，平均粒徑為(152.9±2.6)nm，PDI為(0.101±0.017)。對穩(wěn)定性的初步研究顯示，納米粒在室溫下密封貯存7天其粒徑、PDI、載藥量無顯著變化，基本能夠保持穩(wěn)定。

在課題組前期對葛根素微乳的轉(zhuǎn)運實驗研究中[8]，配伍薄荷腦后在Calu-3細胞模型中轉(zhuǎn)運Papp值與葛根素微乳組相比并無顯著性差異，這與本研究中跨膜轉(zhuǎn)運實驗結(jié)果相一致。結(jié)果顯示在當(dāng)前配伍濃度下，薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油對TMP-PLGA-NPs的跨膜轉(zhuǎn)運并無影響。然而，這一現(xiàn)象與部分在體研究的文獻存在一定程度的矛盾，如LIANG等[9]研究顯示，薄荷醇能夠顯著增加負(fù)載阿苯達唑的薄荷醇—牛血清白蛋白—銀納米粒的BBB通透性，進而增加在腦膠質(zhì)瘤中的積累；李東娜等[10]研究發(fā)現(xiàn)蘇合香(0.4 g/kg)可增加伊文思藍的滲透，對生理狀態(tài)BBB具有一定開放作用。

這種不一致可能是由于薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油配伍濃度較低所造成的。受體外細胞模型實驗的局限，為了不使細胞在實驗過程中受到損傷，選擇了較低的配伍濃度。但在絕大多數(shù)體內(nèi)藥動學(xué)研究中，并未考慮促透劑對實驗動物BBB(或其他生物屏障)細胞的損傷作用，促透劑的配伍濃度往往較高，故而表現(xiàn)出更好的促透效果。以目前報道最多的中藥促透劑冰片為例，張琪[11]對山奈酚經(jīng)靜脈遞藥后腦藥藥時曲線下面積(area under curve, AUC)進行了考察，25 mg/kg山奈酚腦藥AUC為13.06 μg/(mL·min)，若配伍15 mg/kg的冰片靜注則腦藥AUC增加到24.00 μg/(mL·min)，若大鼠血液體積以12 mL計(6 mL/100 g)[12]，則冰片的血藥濃度可達250 μg/mL。研究發(fā)現(xiàn)，冰片可能通過影響神經(jīng)內(nèi)分泌功能以改善伊立替康的藥動學(xué)，配伍冰片(0.125 g/kg)后抗腫瘤藥物伊立替康靜注腦藥AUC 由760.91 ng/(L·h)增加至974.19 ng/(L·h)，此時冰片的血藥濃度高達2.08 mg/mL[13]。

對于實際應(yīng)用而言，只要能夠保障BBB具有可恢復(fù)性，以一定程度的損傷來提高藥物制劑的腦靶向性亦具有一定的可行性，故而除上述體外細胞模型實驗外，后續(xù)需要更多的在體動物實驗以篩選芳香開竅藥的配伍劑量，挖掘更高的指導(dǎo)價值。

對于細胞單層TEER值的監(jiān)測顯示，隨著轉(zhuǎn)運時間的延長TEER值表現(xiàn)出降低的趨勢，但薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油組與對照品組并無差異，在一定程度上作證了上述推論，正是由于薄荷醇、蘇合香揮發(fā)油配伍濃度較低，未能體現(xiàn)出對TMP-PLGA-NPs的促透作用。

從中醫(yī)藥理論的角度出發(fā)，本研究選擇了溫、涼兩種藥性藥物的揮發(fā)性成分，分別是薄荷(性涼)中的薄荷醇、蘇合香(性溫)中的蘇合香揮發(fā)油。MTT實驗結(jié)果顯示，二者細胞毒性存在較大的差異，蘇合香揮發(fā)油對bEnd.3細胞的刺激性更大。姚俊宏等[14]研究了21 種辛味中藥揮發(fā)油的透皮促滲效果，并對其藥性規(guī)律進行分析，雖然研究中揮發(fā)油的濃度較高[丙二醇—異丙醇(3∶7)復(fù)合溶媒中含有3%的揮發(fā)油]，但結(jié)果亦顯示四氣與揮發(fā)油透皮促滲效果具有一定的相關(guān)性。上述結(jié)果均提示在后續(xù)研究或應(yīng)用過程中應(yīng)當(dāng)對于不同類型(或藥性)促透劑的安全性予以關(guān)注。