超聲誘導(dǎo)對發(fā)芽花生的轉(zhuǎn)錄組分析及苯丙烷類合成相關(guān)基因的挖掘

解夢汐，于淼，魯明，付欣，張良晨，石太淵

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110034）

花生（Arachis hypogaeaL.）又名“長生果”，是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物，含有大量蛋白質(zhì)、膳食纖維和不飽和脂肪酸。花生發(fā)芽過程中總酚含量和反式白藜蘆醇等生物活性成分增加，具有高抗氧化活性，因此發(fā)芽花生被專家視為理想的新型功能芽菜品種，也稱花生芽[1]?；ㄉ诎l(fā)芽過程中通過調(diào)控苯丙烷代謝途徑提高苯丙烷類化合物如酚酸、白藜蘆醇和黃酮類物質(zhì)的含量。大量研究證實了酚類物質(zhì)的產(chǎn)生有助于植物應(yīng)對多種外界生物和非生物的脅迫，而這些物質(zhì)的產(chǎn)生涉及植物次生代謝過程信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)控作用[2，3]。

在實際生產(chǎn)中，為解決花生芽生產(chǎn)周期長、活性成分富集消減速度慢等問題，國內(nèi)外學(xué)者通過利用物理場誘導(dǎo)如超聲處理[4-6]、紫外照射[7，8]、外源添加[9]、高壓靜電場[10]等手段對花生或發(fā)芽花生的生物活性成分進(jìn)行富集。Sales等[8]研究表明，經(jīng)過超聲誘導(dǎo)的花生總酚含量從0.84 mg GAE/g提升至1.22～1.89 mg GAE/g；Yu等[4，5]研究表明超聲誘導(dǎo)能夠顯著提高發(fā)芽花生的白藜蘆醇含量，且隨著超聲頻率和發(fā)芽時長而變化，此現(xiàn)象也與花生品種的差異密切相關(guān)。但是未見超聲誘導(dǎo)對發(fā)芽花生苯丙烷類活性物質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控的研究報道。

為了加強(qiáng)對發(fā)芽花生更深層次的開發(fā)利用，本研究選用超聲誘導(dǎo)處理后的發(fā)芽花生作為研究對象進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并利用生物信息學(xué)方法對其測序數(shù)據(jù)進(jìn)行功能注釋分類、代謝通路分析，探討超聲誘導(dǎo)處理對發(fā)芽花生苯丙烷類合成相關(guān)基因的表達(dá)的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及超聲處理

材料于2020年6月采自遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院沙地治理研究所花生研究基地，所選品種為阜花23號。選取大小均一且無破損的200粒花生籽粒放在紗布上，用體積分?jǐn)?shù)為 1%的次氯酸鈉（次氯酸鈉:水=1:100）浸泡消毒20 min，再用純凈水沖洗三次，避光浸泡6 h后，連同紗布放在燒杯里，燒杯加水沒過花生，放入超聲儀器中進(jìn)行超聲處理。超聲參數(shù)設(shè)置為 35 ℃、30 min、240 W（60%）、85 kHz。處理后，種子放置在托盤上，底部鋪上濾紙，鋪上紗布然后另一半紗布蓋上進(jìn)行避光發(fā)芽。經(jīng)過72 h后，取空白對照組和超聲誘導(dǎo)下的花生胚芽置于液氮中快速冷凍，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫椭辽虾Ｃ兰镉邢薰尽?/p>

1.2 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建和測序

從組織樣品中提取total RNA，利用Nanodrop 2000對所提RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，Agilent 2100測定RIN值。樣品檢測合格后利用帶有 Oligo（dT）的磁珠與 ployA 進(jìn)行A-T堿基配對，加入fragmentation buffer，可以將mRNA隨機(jī)斷裂，通過磁珠篩選分離出300 bp左右的小片段。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，加入六堿基隨機(jī)引物（random hexamers），以mRNA為模板反轉(zhuǎn)合成一鏈cDNA，隨后進(jìn)行二鏈合成，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。然后加入End Repair Mix將其補(bǔ)成平末端，隨后在3’末端加上一“A”堿基，用于連接Y字形的接頭。最后通過PCR擴(kuò)增，純化PCR產(chǎn)物，得到最終文庫。文庫質(zhì)量檢測合格后，不同文庫按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量進(jìn)行 pooling，利用Illumina平臺進(jìn)行測序（PE文庫，讀長2×150 bp）。

1.3 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

使用軟件SeqPrep去除reads中的接頭序列，去除由于接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads；將序列末端（3’端）低質(zhì)量（質(zhì)量值小于30）的堿基修剪掉，如剩余序列中仍然有質(zhì)量值小于10的堿基，則將整條序列剔除，否則保留；去除含N比率超過10%的reads；舍棄去adapter及質(zhì)量修剪后長度小于50 bp的序列得到clean data，使用TopHat2（http://tophat.cbcb.umd.edu/）軟件進(jìn)行序列比對分析。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選

以樣品KB組作為對照樣品，與樣品CS進(jìn)行基因表達(dá)量的比較。將錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.001且差異倍數(shù)（fold change）≥2作為DEG的篩選標(biāo)準(zhǔn)，滿足此篩選標(biāo)準(zhǔn)的基因即為DEG。

1.5 DEG的功能注釋

通過BLAST軟件將篩選到的所有DEG分別與NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（Non-redundant Protein Sequence Database，NR）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫、基因本體論（GeneOntology，GO）、蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫（COG）、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（Swiss-Prot）、蛋白數(shù)據(jù)庫（TrEMBL）和非冗余蛋白序列庫（NR）等一系列數(shù)據(jù)庫，并對基因進(jìn)行功能注釋、分析以及統(tǒng)計。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)芽花生轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

表1 發(fā)芽花生轉(zhuǎn)錄組測序統(tǒng)計Table 1 Transcriptomic sequencing statistics of peanut sprout

將構(gòu)建好的發(fā)芽花生轉(zhuǎn)錄組文庫通過HiSeq 2000高通量測序，得到超聲處理 CS組和空白對照組 KB的三次生物學(xué)重復(fù)間的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，ReadSum的平均值分別為46208369條和49367041條，數(shù)據(jù)過濾后超聲處理CS組和空白對照組KB的平均總堿基數(shù)分別是6.98 Gb和7.45 Gb，GC含量分別為45.00%和45.13%，這些序列的Q20和Q30分別在98%和94%以上。以上數(shù)據(jù)說明全部樣品轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量較高，可為后續(xù)的差異表達(dá)基因分析提供了科學(xué)的依據(jù)。

2.2 發(fā)芽花生轉(zhuǎn)錄組功能注釋

將組裝獲得的所有基因和轉(zhuǎn)錄本與 NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG六個常用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對（圖1），最終獲得有注釋信息的表達(dá)基因數(shù)目為 48660，各個數(shù)據(jù)庫注釋到的表達(dá)基因有較大的區(qū)別，其中NR數(shù)據(jù)庫注釋到47998個表達(dá)基因，占比98.64%，GO和COG分別有27880個和46411個表達(dá)基因，占比57.30%和95.38%，得到注釋最少的數(shù)據(jù)庫為KEGG，僅有22200個表達(dá)基因，占比為 45.62%。長度位于 300～1000 bp和長度≥1000 bp的數(shù)目分別有18310個和19233個（表2）。

表2 基因功能注釋統(tǒng)計Table 2 Functional annotation of ref genes

2.3 花生芽響應(yīng)超聲誘導(dǎo)DEGs數(shù)目的分析

為研究發(fā)芽花生響應(yīng)超聲誘導(dǎo)的基因表達(dá)情況，對超聲處理后的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析（圖2）。兩組樣品中共篩選出1104個DEGs，其中上調(diào)DEGs共有583個，用紅色點(diǎn)表示；下調(diào)DEGs共有521個，用綠色點(diǎn)表示；灰色點(diǎn)代表非差異表達(dá)基因。結(jié)果表明，上調(diào)DEGs的數(shù)目低于下調(diào)DEGs的數(shù)目。

2.4 DEGs的蛋白聚類分析

將DEGs和COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并對DEGs的功能進(jìn)行預(yù)測和統(tǒng)計歸類，結(jié)果顯示，共有 14497條DEGs與數(shù)據(jù)庫中的基因相似度高。根據(jù)功能分類，可初步將花生種子轉(zhuǎn)錄組中的差異基因分為21類（圖3），數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，DEGs的COG功能涉及大多數(shù)的生命活動，其中種類全面，數(shù)量最多的是轉(zhuǎn)錄類的基因，其次是碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、重復(fù)和修復(fù)及翻譯后修飾、蛋白代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等類別；輔酶的運(yùn)輸和代謝類數(shù)量最少，只有4個；與油脂轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝相關(guān)的基因有654個；此外仍有643個DEGs未知功能類別（圖3）。

2.5 基因功能分類分析

對超聲誘導(dǎo)下發(fā)芽花生的DEGs進(jìn)行了GO富集分析，共分為生物進(jìn)程（biological process）、分子功能（molecular functions）和細(xì)胞組分（cellular component）三個大類。在DEGs富集數(shù)目的共33個亞類中（圖4），生物進(jìn)程注釋到13個分支，DEGs主要集中在細(xì)胞組成或生物發(fā)生和細(xì)胞進(jìn)程，分別有292個和241個基因功能得到注釋，說明細(xì)胞組分類的相關(guān)基因在超聲誘導(dǎo)花生發(fā)芽的生物進(jìn)程中起著非常重要的作用。富集在細(xì)胞組分的DEGs主要分為10個分支，其中細(xì)胞組分包含的基因數(shù)目最多，共有217個，其次是膜的組成部分。在分子功能的9個分支中，參與催化活性和涉及結(jié)合功能的基因數(shù)量遠(yuǎn)超過參與其他生物過程的基因數(shù)，分別有338個和245個基因。

2.6 DEGs的代謝通路富集分析

為了進(jìn)一步探索DEGs的生物學(xué)功能，解析花生芽在超聲誘導(dǎo)下的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對 DEGs進(jìn)行了KEGG富集分析，共有327個DEGs富集到了97條通路中。在富集顯著的前20條代謝通路中（圖5），包含苯丙烷生物合成（24）、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（15）、胞吞作用（12）、植物與病原體的相互作用（11）、黃酮類生物合成（10）、淀粉和蔗糖代謝（8）、核糖體（8）、剪接體（7）、亞油酸代謝（6）、磷酸肌醇代謝（6）、谷胱甘肽代謝（6）、甘油磷脂代謝（6）、錯配修復(fù)（6）、同源重組（6）、基因復(fù)制（6）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（5）、類胡蘿卜素的生物合成（5）、氨?；鵷RNA的生物合成（5）、抗壞血酸和藻酸鹽代謝（5）、α-亞麻酸代謝（5）、精氨酸和脯氨酸代謝（5）、氨基糖和核苷酸糖代謝（5）、糖酵解/糖異生（5）、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)（5）、核苷酸切除修復(fù)（5）等。富集分析結(jié)果說明花生芽通過代謝、合成次生代謝物等途徑參與超聲誘導(dǎo)的響應(yīng)。

2.7 花生芽在超聲誘導(dǎo)下的轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物非生物脅迫抗性方面起著重要作用[11-13]，本研究分析超聲誘導(dǎo)下花生芽的DEGs，共屬于48個轉(zhuǎn)錄因子家族。其中B3家族包含293個基因，其次是MYB家族288個、bHLH家族281個，MYB_related家族261個以及ERF家族210個，說明這些家族轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)在發(fā)芽花生受超聲誘導(dǎo)下調(diào)控效果顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)B3轉(zhuǎn)錄因子是發(fā)芽花生在超聲處理下表達(dá)量變化最多的家族。研究表明已知MYB、B3、WRKY、bHLH、bZIP等轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化能提高植物適應(yīng)逆境的能力[14]。其中B3家族是一類含有B3功能域的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其功能域是一種可以和DNA特異結(jié)合且高度保守的結(jié)構(gòu)域[15]。B3家族轉(zhuǎn)錄因子除了有參與DNA結(jié)合B3結(jié)構(gòu)域外，還有其他保守的結(jié)構(gòu)域，包括AP2，生長素應(yīng)答因子，生長素/吲哚-3-乙酸等。bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的基因家族之一，廣泛的參與了植物代謝、發(fā)育及對各種脅迫的應(yīng)答機(jī)制[16]。MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與植物生理生化過程，包括植物表皮組織細(xì)胞分化、外界環(huán)境因素響應(yīng)、激素應(yīng)答等[17]。研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能多種多樣，對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要。例如，MYB轉(zhuǎn)錄因子可通過控制各個細(xì)胞分裂時期來實現(xiàn)對細(xì)胞周期的調(diào)控，也可通過調(diào)節(jié)植物次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)花青素、類黃酮等次生代謝產(chǎn)物的合成，在非生物脅迫和生物脅迫響應(yīng)中也扮演了重要的角色[15]。此外，MYB轉(zhuǎn)錄因子還能調(diào)控植株對植物激素的響應(yīng)[16]。

2.8 花生芽在超聲誘導(dǎo)下DEGs的苯丙烷類生物合成途徑

苯丙烷類生物合成途徑為DEGs富集數(shù)目最多的代謝通路，分析該調(diào)控途徑對研究玉米響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制具有重要意義（圖7）。發(fā)現(xiàn)共有21 DEGs得到富集，其中過氧化物酶（E1.11.1.7）注釋到10個，下調(diào)3個，上調(diào)7個；β-葡糖苷酶上調(diào)（EC3.2.1.21）1個；四氫大麻酸合酶上調(diào)1個；甘露醇脫氫酶上調(diào)2個；網(wǎng)狀氧化酶樣蛋白上調(diào)1個；4-香豆酸酯-CoA連接酶上調(diào)2個；亞精胺羥肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶上調(diào)1個；氰基β-葡萄糖苷酶上調(diào)1個，下調(diào)1個；咖啡酰-CoAO-甲基轉(zhuǎn)移酶上調(diào)2個；肉桂酰基-CoA還原酶上調(diào)2個。

前人研究報道白藜蘆醇在植物體內(nèi)是以苯丙氨酸為底物，通過苯丙烷途徑生成[18]，因此本研究所得的所有轉(zhuǎn)錄本與KEGG通路數(shù)據(jù)庫中的苯丙烷合成途徑（map00940）進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花生芽中arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DXZI51、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.VGN2GE、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.Y23DM6這三個基因顯著上調(diào)與白藜蘆醇合成途徑相關(guān)，其中arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DXZI51為肉桂?；o酶A還原酶（Cinnamoyl-CoA reductase 2）參與了肉桂酸的合成。苯丙氨酸（PHE，Phenylalanine）首先經(jīng)過苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanine ammonia lyase）脫氨基作用失去氨基之后轉(zhuǎn)化為肉桂酸（Cinnamic acid），肉桂酸再通過肉桂酸羥化酶（C4H，cinnamate-4-hydroxylase）發(fā)生羥基化磷脂反應(yīng)得到對香豆酸（Cinnamoyl-COA），在本通路結(jié)果中arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.VGN2GE、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.Y23DM6基因均為4-香豆酸酯-CoA連接酶（4-coumarate-CoA ligase），參與了由4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL，4-coenzyme A ligase）得到對香豆輔酶A的生物合成。前人報道香豆輔酶A（4-coumaroyl-COA）最后在外界因素刺激下，開啟白藜蘆醇生成途徑，由1分子的對香豆酰輔酶A和3分子的丙二酰輔酶A（Malonyl-COA）在芪合酶（STS，stilbene synthase）的催化作用下縮合生成1分子的反式白藜蘆醇[19]。由此可以說明在花生芽在超聲誘導(dǎo)下產(chǎn)生機(jī)械損傷，通過調(diào)控arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DXZI51、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.VGN2GE、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.Y23DM6促進(jìn)白藜蘆醇的富集。

本研究發(fā)現(xiàn)苯丙烷類生物合成途徑是富集數(shù)目最顯著的一條代謝通路，共有21個相關(guān)基因得到注釋。在植物次生代謝途徑中，所有黃酮類物質(zhì)、木質(zhì)素和白藜蘆醇等大部分酚類物質(zhì)均經(jīng)苯丙氨酸代謝途徑合成，研究已經(jīng)表明，植物體內(nèi)這些關(guān)鍵酶在應(yīng)對外界生物及非生物逆境時起到至關(guān)重要的調(diào)控次生代謝作用[20-23]。例如，PAL活性的提高增強(qiáng)了大豆根部木質(zhì)素的合成進(jìn)；甘草黃酮類物質(zhì)的提高與PAL、C4H基因及其酶活性的增加有著不可分割的聯(lián)系[24，25]。上述結(jié)果表明，超聲誘導(dǎo)提高了發(fā)芽花生苯丙烷類合成途徑中基因的表達(dá)，這意味著發(fā)芽花生苯丙烷代謝途徑中的下游產(chǎn)物也將可能被超聲誘導(dǎo)所改變，這也進(jìn)一步驗證了本研究在前期試驗中發(fā)現(xiàn)超聲誘導(dǎo)能夠顯著提高發(fā)芽花生的白藜蘆醇含量的結(jié)果[4-6]。殷向靜[26]利用超聲誘導(dǎo)葡萄富集白藜蘆醇，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇的富集受到白藜蘆醇合酶的轉(zhuǎn)錄控制，而超聲處理能夠引起白藜蘆醇合酶活性升高。此外，李淑瑩[27]的研究表明，超聲聯(lián)合苯丙氨酸誘導(dǎo)可對花生芽中白藜蘆醇的富集產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，原因是由于超聲可以提高肉桂酸-4-羥基化酶、4-香豆酸-輔酶A連接酶、類黃酮3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶4種酶的活性。Ling等[28]研究超聲處理（400 W，6 min）與0.4%過乙酸在20 ℃對枇杷貯藏過程中生理變化的影響，結(jié)果表明，聯(lián)合超聲和乙酸處理后，枇杷果實中總黃酮含量在第3 d達(dá)到最高值，且高于對照組。這可能是因為超聲聯(lián)合過乙酸在處理可以提高枇杷果實內(nèi)多酚氧化酶和過氧化物酶的活性，而這兩種酶則是參與苯丙烷途徑和氧化過程的重要酶，從而產(chǎn)生多種具有結(jié)構(gòu)和防御功能的酚類化合物[2]。此外，卞紫秀等[23]研究表明，利用超聲處理可以有效地促進(jìn)苦蕎麥種子的萌發(fā)，從而富集苦蕎芽苗中黃酮類化合物。這可能要?dú)w因于超聲處理能有效激活植物種子萌發(fā)期的各種酶類的活性[24]，顯著提高種子萌發(fā)率，同時誘導(dǎo)種子中一些生物活性成分的合成，這與本研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相一致，說明超聲誘導(dǎo)能夠調(diào)控發(fā)芽花生苯丙烷類生物合成代謝途徑的基因表達(dá)情況。

3 結(jié)論

為了揭示發(fā)芽花生如何應(yīng)答超聲外源場誘導(dǎo)，篩選在超聲誘導(dǎo)后起重要調(diào)節(jié)作用的基因，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，選出適宜富集白藜蘆醇的花生品種阜花23號為試驗原料，是較有代表性的一個研究材料，為此次研究奠定了良好的材料基礎(chǔ)。研究了經(jīng)超聲誘導(dǎo)后的發(fā)芽花生（CS）和未經(jīng)誘導(dǎo)處理的發(fā)芽花生（KB）的轉(zhuǎn)錄組差異，證實了超聲能夠影響發(fā)芽花生苯丙烷類物質(zhì)的生物合成，從兩組樣品中共篩選出1104個差異基因，其中上調(diào)583個，下調(diào)521個。通過與七大數(shù)據(jù)庫的比對分析，解析了發(fā)芽花生在超聲誘導(dǎo)下所涉及到的功能分類、代謝通路及生物進(jìn)程的調(diào)控，功能注釋表明差異基因主要富集在遺傳信息處理、代謝途徑和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換。并挖掘到 3個（arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.DXZI51、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.VGN2GE、arahy.Tifrunner.gnm1.ann1.Y23DM6）參與發(fā)芽花生苯丙烷類物質(zhì)的顯著基因，這些研究結(jié)果為揭示發(fā)芽花生苯丙烷類物質(zhì)的生物合成途徑提供一定的參考依據(jù)。但眾多基因復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及發(fā)芽過程中酚酸、木質(zhì)素及總黃酮等物質(zhì)在超聲誘導(dǎo)處理下的代謝機(jī)理需要進(jìn)一步深入探討，目的在于將來通過外援手段改變此類基因的調(diào)節(jié)功能，讓發(fā)芽花生的營養(yǎng)和功能性成分的變化向?qū)θ祟愑欣陌l(fā)現(xiàn)發(fā)展。