結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討扶正化瘀方對(duì)肺纖維化小鼠PI3K-Akt信號(hào)通路的影響

景菲，胡旭東，彭淵，邢楓，陶艷艷，劉成海，3

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；3.上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

肺纖維化病因復(fù)雜，是多種肺疾病的共同結(jié)局，中位生存時(shí)間僅3～8年，嚴(yán)重影響患者存活率及生活質(zhì)量。近年來(lái)，我國(guó)肺纖維化患者數(shù)量呈明顯增多趨勢(shì)，中醫(yī)治療該病取得了一定成效。目前尚無(wú)治療肺纖維化的特效藥物，臨床治療的主要目標(biāo)是減輕癥狀、延緩疾病進(jìn)展和提高生活質(zhì)量。

扶正化瘀方由丹參、冬蟲(chóng)夏草、絞股藍(lán)、桃仁、松花粉、五味子組成，適用于瘀血阻絡(luò)、肝腎不足者，臨床常用于肝纖維化的治療。本課題組前期研究表明，扶正化瘀方可減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型大鼠的肺間質(zhì)炎癥和纖維化，臨床觀察發(fā)現(xiàn)其可明顯改善慢性阻塞性肺疾病患者的肺功能，但該方治療肺纖維化的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析和小鼠肺纖維化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，探討扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（https://www.tcmsp-e.com/，TCMSP）檢索扶正化瘀方組方藥物丹參、桃仁、冬蟲(chóng)夏草、北五味子、絞股藍(lán)、松花粉的化學(xué)成分，以口服利用度（OB）≥30%且類(lèi)藥性（DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選，獲得活性化合物及其作用的蛋白靶點(diǎn)，并根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測(cè)到的活性化合物的已知靶點(diǎn)。

1.2 疾病相關(guān)基因篩選

以“pulmonary fibrosis”“fibrosing alveolitis”“idiopathic pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards（ https://www.genecards.org）、 OMIM（http://www.omim.org）數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取肺纖維化的疾病相關(guān)基因。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

通過(guò)STRING平臺(tái)（https://string-db.org）將扶正化瘀方相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名轉(zhuǎn)換成基因名，再與肺纖維化疾病靶點(diǎn)基因集合取交集，獲得交集基因。將交集基因所對(duì)應(yīng)的蛋白通過(guò)STRING平臺(tái)進(jìn)行蛋白相互作用（PPI）分析，將生物種類(lèi)設(shè)定為“homo sapiens”，最小相互作用閾值設(shè)定為“highest confidence”（＞0.9），其余均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI網(wǎng)絡(luò)及數(shù)據(jù)；將PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape3.8.0軟件，運(yùn)用 Network Analyze工具分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，靶點(diǎn)蛋白的節(jié)點(diǎn)度（degree）越大其在PPI網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.4 KEGG通路富集分析

利用 R 語(yǔ)言的“colorspace”“stringi”“ggplot2”“clusterProfiler”“enrichplot”“org.Hs.EG.db”數(shù)據(jù)包對(duì)扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在核心作用靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，設(shè)定顯著性為＜0.05。

1.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 動(dòng)物及藥物

C57BL/6小鼠46只，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量（24±2）g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0001。于獨(dú)立通氣籠中適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)已獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（PZSHUTCM200821006）。

扶正化瘀方干膏粉，上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)200414；甲潑尼龍片，Pfizer Italia Srl公司，批號(hào)DL2665。

1.5.2 主要試劑與儀器

硫酸博來(lái)霉素（批號(hào)CSN10472），美國(guó)Csnpharm公司；生理鹽水（批號(hào)W180403G1），青島華仁藥業(yè)股份有限公司；Masson三色染色液（批號(hào)ab150686），英國(guó)Abcam公司；HE染色試劑盒（批號(hào)10004160），南京建成生物工程研究所有限公司；總RNA抽提試劑盒（貨號(hào) B511321）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimescriptRTreagent Kit with gDNA Eraser（貨號(hào) RR047A）、TBGreenPremix EX Taq擴(kuò)增試劑盒（貨號(hào)RR420A），日本TaKaRa公司。

小動(dòng)物喉鏡、液體定量霧化器（上海伯建生物科技有限公司），3-18KS型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司），BSA3202SCW型電子天平（德國(guó)Sartorius公司），BX51型顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（日本Olympus公司），ASP300全自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)徠卡公司），EG1140石蠟包埋機(jī)（德國(guó)徠卡公司），Leica RM2235石蠟切片機(jī)（德國(guó)徠卡公司），HI1210展片機(jī)（德國(guó)徠卡公司），HI1220烤片機(jī)（德國(guó)徠卡公司）。

1.5.3 模型制備及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將 46只小鼠分為正常對(duì)照組10只、模型組12只、扶正化瘀組12只、甲潑尼龍組12只。除正常對(duì)照組外，其余組小鼠應(yīng)用小動(dòng)物喉鏡及液體定量霧化器進(jìn)行一次性氣管內(nèi)霧化噴入博來(lái)霉素2 mg/kg。正常對(duì)照組氣管內(nèi)霧化等體積生理鹽水。造模次日起，扶正化瘀組和甲潑尼龍組分別灌胃扶正化瘀干膏粉（5.6 g/kg）、甲潑尼龍（10 mg/kg），每日1次。至第21日，以戊巴比妥鈉麻醉小鼠，打開(kāi)胸腔，一側(cè)肺組織浸入福爾馬林中固定，另一側(cè)肺組織先置于液氮中，后放于-80 ℃冰箱冷凍保存。各組隨機(jī)選取5只小鼠肺組織進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

1.5.4 肺組織病理學(xué)觀察

取經(jīng)福爾馬林固定的肺組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，貼附于載玻片上，脫蠟至水，酒精梯度脫水，采用HE染色試劑盒進(jìn)行HE染色，采用Masson三色染色液進(jìn)行Masson染色，中性樹(shù)膠封片，于顯微鏡下觀察并拍片。

1.5.5 qRT-PCR檢測(cè)肺組織PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表達(dá)

肺組織勻漿后，使用總RNA提取試劑盒提取組織總 RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。使用 Primier5.0軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)基因的引物（見(jiàn)表1），使用SYBR Green嵌合熒光法于Roche480機(jī)器進(jìn)行qRT-PCR。

表1 各基因qRT-PCR引物序列

1.5.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 扶正化瘀方活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)

經(jīng)TCMSP檢索并篩選，分別得到丹參、桃仁、冬蟲(chóng)夏草、北五味子、絞股藍(lán)、松花粉的活性成分65、23、7、8、24、2個(gè)，相應(yīng)靶點(diǎn) 135、53、71、21、164、62個(gè)，去除重復(fù)后共得到125個(gè)化學(xué)成分、221個(gè)靶點(diǎn)基因。

2.2 肺纖維化疾病靶點(diǎn)

通過(guò)GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，分別獲得“pulmonary fibrosis”“fibrosing alveolitis”“idiopathic pulmonary fibrosis”相關(guān)基因5 492、256、3 236個(gè)，合并去除重復(fù)基因，共獲得肺纖維化疾病靶點(diǎn)基因5 897個(gè)。

2.3 潛在核心靶點(diǎn)生物信息學(xué)分析

對(duì)扶正化瘀方靶點(diǎn)基因和肺纖維化疾病靶點(diǎn)基因取交集，獲得扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在靶點(diǎn)基因191個(gè)。利用STRING平臺(tái)對(duì)交集基因?qū)?yīng)的蛋白進(jìn)行PPI分析，扶正化瘀方治療肺纖維化靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖1。利用Cytoscape3.8.0軟件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，節(jié)點(diǎn)度排序前30位的核心靶點(diǎn)見(jiàn)圖2。其中AKT1居首位，提示AKT1可能是扶正化瘀方治療肺纖維化最關(guān)鍵蛋白。

圖1 扶正化瘀方治療肺纖維化靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 扶正化瘀方治療肺纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4 核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析顯示，AGE-RAGE信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路等是扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在信號(hào)通路（見(jiàn)圖3、表2）。

圖3 扶正化瘀方治療肺纖維化核心靶點(diǎn)KEGG通路

表2 扶正化瘀方治療肺纖維化核心靶點(diǎn)KEGG通路富集分析結(jié)果

結(jié)合PPI網(wǎng)絡(luò)分析和KEGG通路富集分析結(jié)果，扶正化瘀方可能通過(guò)調(diào)控 PI3K-Akt信號(hào)通路及通路中的AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2等基因表達(dá)發(fā)揮抗肺纖維化作用（見(jiàn)圖4）。

圖4 扶正化瘀方治療肺纖維化的PI3K-Akt信號(hào)通路

2.5 扶正化瘀方對(duì)模型小鼠肺組織形態(tài)的影響

正常對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，部分肺間隔輕度增厚，間質(zhì)可見(jiàn)少量慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠可見(jiàn)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)，肺泡壁增厚及肺泡間隔增寬，在肺間質(zhì)區(qū)域內(nèi)可見(jiàn)成纖維細(xì)胞聚集和膠原基質(zhì)沉積增加，肺實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)紊亂；與模型組比較，扶正化瘀組和甲潑尼龍組小鼠肺泡壁增厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況有所緩解。見(jiàn)圖5。

2.6 扶正化瘀方對(duì)模型小鼠肺組織纖維化的影響

正常對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見(jiàn)纖維組織增生；模型組小鼠肺泡間隔增厚，肺泡塌陷萎縮，可見(jiàn)大量膠原纖維沉積；與模型組比較，扶正化瘀組與甲潑尼龍組小鼠纖維組織增生有所減輕。見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠肺組織形態(tài)（Masson染色，×100）

2.7 扶正化瘀方對(duì)模型小鼠肺組織PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織 PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表達(dá)均明顯升高；與模型組比較，扶正化瘀組和甲潑尼龍組上述基因表達(dá)均顯著降低。見(jiàn)表3。

表3 PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量各組比較（±s）

3 討論

纖維化是肺臟損傷后過(guò)度修復(fù)的病理過(guò)程，早期主要表現(xiàn)為肺泡炎癥，后期可發(fā)展為大量成纖維細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積。其發(fā)病機(jī)制主要與機(jī)體免疫失調(diào)及炎癥有關(guān)。肺纖維化屬中醫(yī)學(xué)“肺痿”“肺痹”等范疇，可從“虛、瘀、痰、毒”角度進(jìn)行闡述，為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛以氣虛為主，標(biāo)實(shí)以血瘀為重。雖然肺纖維化的病因病機(jī)復(fù)雜多變，但氣虛血瘀貫穿整個(gè)病程，故應(yīng)以扶正化瘀通絡(luò)為基本治法，虛實(shí)、標(biāo)本同治。扶正化瘀方原用于治療肝纖維化，慢性肝病及肺病均有“正虛血瘀”的病機(jī)特點(diǎn)，存在異病同治、補(bǔ)虛化瘀的理論基礎(chǔ)及方-證效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，扶正化瘀方可通過(guò)抑制 MMP-2/9蛋白活性減少肺組織的炎癥破壞，起到抗大鼠肺纖維化的作用。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在作用機(jī)制。得到扶正化瘀方活性成分125種、相應(yīng)靶點(diǎn)基因221個(gè)，以及肺纖維化疾病相關(guān)靶點(diǎn)5 897個(gè)，交集基因191個(gè)。潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，扶正化瘀方治療肺纖維化的最重要靶點(diǎn)為AKT1；KEGG富集分析顯示，PI3K-Akt信號(hào)通路可能是扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在作用通路。PI3K-Akt信號(hào)通路具有調(diào)控細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡等功能，與肺纖維化關(guān)系密切。PI3K是生長(zhǎng)因子受體超家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要組成部分，激活后的PI3K可特異性催化磷脂酰肌醇環(huán)上的 3位羥基磷酸化，引起下游蛋白磷酸化，促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而形成肺纖維化。AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，可參與調(diào)控細(xì)胞增殖及代謝，促進(jìn)纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。王曉艷等觀察肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383細(xì)胞在染塵處理后的自噬情況，以 LY294002阻斷 PI3K途徑，發(fā)現(xiàn) PI3K-Akt信號(hào)通路參與了矽塵誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞的自噬過(guò)程。馬愛(ài)平等發(fā)現(xiàn)，肺纖維化組織存在Akt過(guò)度活化，活化的Akt激活下游的HIF-1α信號(hào)通路，抑制肺泡表面活性物質(zhì)產(chǎn)生和肺泡上皮細(xì)胞的正常修復(fù)，從而加重纖維化。核因子-κB（NF-κB）是重要的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子，在PI3K-Akt信號(hào)通路中，AKT活化可促進(jìn)NF-κB激活，啟動(dòng)下游的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等炎性因子，加重纖維化。細(xì)胞凋亡在肺纖維化發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，CASP9和Bcl2均是PI3K-Akt信號(hào)通路的下游靶蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，會(huì)刺激線粒體釋放細(xì)胞色素 C及凋亡小體，引起Caspases家族發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其中Caspase-9是細(xì)胞凋亡的激活劑。此外，孫曉芳等發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié) Bax/Bcl2蛋白和基因表達(dá)可抑制肺組織氣道上皮細(xì)胞凋亡，從而抑制小鼠肺纖維化的發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，扶正化瘀方可明顯減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷和肺纖維化，并顯著降低PI3K、AKT1、NF-κB、CASP9、Bcl2基因表達(dá)水平，推測(cè)扶正化瘀方可能通過(guò)調(diào)控 PI3K-Akt信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)抑制肺組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析扶正化瘀方治療肺纖維化的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號(hào)通路，并利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步驗(yàn)證，結(jié)果表明 PI3K-Akt信號(hào)通路可能是扶正化瘀方抗肺纖維化的關(guān)鍵信號(hào)通路，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。