凍藏條件對(duì)人乳脂質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

張麗娜，瞿婧妍，尹利昂，劉 君，孫趙娜，周 鵬,*

（1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.海爾智家股份有限公司，山東 青島 266101；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫婦幼保健院，江蘇 無錫 214002）

人乳是由乳腺上皮細(xì)胞合成分泌的汁液物質(zhì)，含有嬰兒生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)素，含量適中且比例恰當(dāng)，最易于嬰兒消化吸收且有助于改善循環(huán)及器官系統(tǒng)的功能，被譽(yù)為“白色血液”[1]。人乳中的脂肪含量約為3%～5%，在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保護(hù)功能方面具有重要作用。人乳脂肪可為嬰兒提供50%～60%的能量，促進(jìn)脂溶性化合物的運(yùn)輸和吸收并有助于構(gòu)成細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，還可針對(duì)細(xì)菌、病毒等致病微生物為機(jī)體提供保護(hù)作用[2]。另外，人乳也富含一系列長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸（docosa hexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosa pentaenoic acid，EPA）等，它們對(duì)嬰兒腦組織和視網(wǎng)膜的正常發(fā)育至關(guān)重要[3]。因此，人乳具有動(dòng)植物乳以及配方奶粉無可比擬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，人乳喂養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)不言而喻。

然而，母親們也可能因母嬰疾病或是職業(yè)工作等因素而無法及時(shí)進(jìn)行哺育。在此情況下，越來越多的女性選擇使用預(yù)存人乳喂養(yǎng)代替直接哺育[4]。人乳的預(yù)存方式主要分為冷藏和冷凍。兩者均通過低溫抑制人乳細(xì)菌繁殖并延緩某些理化特性的降解達(dá)到延長(zhǎng)保存期的目的[5]。冷藏能夠在短期貯藏期內(nèi)最大限度地保持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、活力和功能；冷凍能夠在保證人乳品質(zhì)安全的基礎(chǔ)上大大延長(zhǎng)貯藏期限，母親斷奶后仍可使用預(yù)存的冷凍人乳進(jìn)行喂養(yǎng)以最大程度地促進(jìn)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育[6-7]。從長(zhǎng)期貯藏的角度考慮，學(xué)者們更推薦使用凍乳。

已有研究表明，人乳脂質(zhì)特性在凍藏過程中會(huì)發(fā)生變化，主要集中在脂肪總量、脂肪分解、脂肪氧化等方面[8-10]，對(duì)于貯藏過程中脂肪酸組成及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成等方面的研究較少。此外，以往的研究多集中于探究-18～-20 ℃或-70～-80 ℃兩個(gè)溫度區(qū)間的變化，而-18～-20 ℃雖然是家庭最常見的貯藏溫度，但貯藏期有限；另一方面，-70～-80 ℃冰箱效果雖好，但造價(jià)昂貴且噪音較大，不適合應(yīng)用于家庭。近年來，越來越多的家用電器公司開始探索深低溫技術(shù)，嘗試開發(fā)專用于儲(chǔ)存母乳的-20～-70 ℃冰箱。與金槍魚、三文魚等高端食品低溫循環(huán)使用的商用冰箱一樣，-20～ -70 ℃可以最大限度地保持其質(zhì)地和風(fēng)味，滿足經(jīng)濟(jì)和實(shí)際需求。然而，目前還沒有關(guān)于人乳脂肪在-20～ -70 ℃冷凍過程中變化的信息。

因此，本研究將探尋人乳脂質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在不同凍藏條件下的變化。以新鮮人乳為對(duì)比，分別探究人乳脂質(zhì)在不同凍藏溫度（-18 ℃和-60 ℃）以及相同溫度下不同降溫速率（-60 ℃和-60 ℃快速冷凍（Q））的變化差異，為尋求研制合適、經(jīng)濟(jì)的人乳專用貯存冰箱條件提供科學(xué)依據(jù)，為凍乳的貯藏提供科學(xué)指導(dǎo)意見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本研究受江南大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)選擇人乳收集對(duì)象，所有參與本研究的母親均簽署了知情同意書。篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：

入選標(biāo)準(zhǔn)：產(chǎn)后1～9個(gè)月；一次性分泌大于50 mL乳汁；分娩健康足月新生兒（37～24 周），孕前和孕期身體健康。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有抽煙、酗酒和濫用毒品史；患有乳腺炎、傳染病或精神??；患腫瘤、癌癥、糖尿病等疾病。

無菌儲(chǔ)奶袋 積谷（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.2 試劑

正庚烷（色譜純）、14%三氟化硼-甲醇溶液（BF3-Methanol） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；十一碳酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%） 美國(guó)Nu-chek公司；尼羅紅染料 美國(guó)Sigma公司；非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acids，NEFA）試劑盒（A042-1-1）、脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxide，LPO）試劑盒（A106-1-2） 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BC/BD-318HD臥式冷凍柜、DW/BD-55W321E臥式單溫深冷凍柜 中國(guó)海爾集團(tuán)；UT322高精度接觸式溫度計(jì)（K型熱電偶） 優(yōu)利德集團(tuán)有限公司；EL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2700紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Microtrac S3500激光粒度分析儀 美國(guó)Microtrac公司；TCS SP8 STED 3X超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡 德國(guó)徠卡公司； SCIONSQ-456-GC氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 人乳收集與處理

本研究共收集了無錫市20 位母親的乳汁。乳汁由母親清潔雙手及乳房后，用電動(dòng)吸奶泵采集，并用無菌儲(chǔ)奶袋貯存。采集時(shí)間為上午8:00—10:00，所有樣品收集后立即放入冰盒，在2 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。所有樣品運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室后，在無菌燒杯中進(jìn)行混合，混合后按要求分裝至各無菌儲(chǔ)奶袋中。

新鮮樣品立即進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定；將分裝好的樣品分成3 組，先置于4 ℃預(yù)冷。其中2 組分別置于-18 ℃和 -60 ℃條件下冷凍貯存；在相同-60 ℃條件下放入風(fēng)機(jī)，調(diào)節(jié)風(fēng)速為2 m/s，將剩余一組置于其中貯存，記為-60 ℃（Q）組。將3個(gè)熱電偶探頭分別置于3 組儲(chǔ)奶袋的中心位置，監(jiān)測(cè)樣品從離開預(yù)冷狀態(tài)至冷凍4 h之間的中心溫度變化。以上樣品同時(shí)置于3 組冷凍條件開始進(jìn)行冷凍處理并開始溫度監(jiān)測(cè)，貯存60 d和180 d后取出，隨即置于45 ℃水浴環(huán)境，以振蕩方式使凍乳完全解凍，解凍后立即進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3.2 人乳脂肪含量測(cè)定

脂肪含量的測(cè)定參考羅茲-哥特里（Rose-Gottlieb）法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。脂肪酸成分的測(cè)定參考Lacomba等[9]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。吸取2.5 mL樣品于具塞試管中，加入0.4 mL氨水混勻30 s，于60 ℃水浴5 min，再振搖2 min，加入2.5 mL 96%乙醇溶液搖勻2 min，于冷水冷卻，依次加入6.25 mL乙醚振搖30 s，6.25 mL石油醚振搖30 s，靜置30 min，待上層液澄清后，讀取醚層體積。用移液管移取1 mL有機(jī)層到恒質(zhì)量的稱量瓶，于通風(fēng)櫥揮發(fā)30 min，再置于烘箱中于105 ℃干燥至恒質(zhì)量，記錄稱量瓶烘干前后質(zhì)量。人乳脂肪含量按式（1）計(jì)算：

式中：X為脂肪質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為樣品體 積/mL；m1為稱量瓶烘干后質(zhì)量/g；m2為稱量瓶烘干前質(zhì)量/g；V1為醚層上體積/mL；V2為醚層下體積/mL。

1.3.3 NEFA及LPO含量的測(cè)定

使用試劑盒測(cè)定，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.4 脂肪酸成分的測(cè)定

參考Lacomba等[9]的實(shí)驗(yàn)方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。取5 mL人乳，加入15 mL的三氯甲烷-甲醇混合液（2∶1，V/V）及2 mL 2 mg/mL的十一碳酸甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品，隨后渦流振蕩2 min；靜置10 min后加入5 mL 20%氯化鈉溶液，于25 ℃、3 500×g離心10 min；取下層氯仿層，于3 g無水硫酸鈉脫水后氮?dú)獯蹈?；吹干后加? mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，70 ℃回流10 min；加入5 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，70 ℃回流5 min；加入2 mL正庚烷及5 mL飽和氯化鈉溶液，混合后靜置10 min；取1 mL上層清液于0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾。

脂肪酸測(cè)定采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。氣相色譜條件：反式色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm），載氣為氦氣，載氣流速為1 mL/min，進(jìn)樣口溫度240 ℃，進(jìn)樣量200 μL，分流比為100∶1。采用程序升溫，初始溫度為60 ℃，保持1 min，然后以20 ℃/min升至120 ℃，保持1 min；然后以5 ℃/min升至240 ℃，保持15 min。質(zhì)譜條件：離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度240 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z50～500；溶劑延遲時(shí)間4 min。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

采用超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡觀察人乳脂肪球（human milk fat globule，HMFG）的形態(tài)。使用丙酮配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的尼羅紅染液。取200 μL乳樣，加入2 μL尼羅紅染液用以標(biāo)記脂肪，混勻后于室溫避光反應(yīng)20 min。取8 μL已標(biāo)記好的樣液置于載玻片上，隨后小心蓋上蓋玻片，封片處理。設(shè)定尼羅紅激發(fā)波長(zhǎng)為552 nm，使用20 倍物鏡進(jìn)行觀察。

1.3.6 揮發(fā)性風(fēng)味成分分析

參考Spitzer等[11]的方法，并進(jìn)行修改。取5 mL人乳，加入10 μL 50 mg/L 4-甲基-2-戊酮作為內(nèi)標(biāo)，萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS于60 ℃頂空萃取30 min。 吸附完成后將進(jìn)樣針插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀在250 ℃解吸6 min。

色譜條件：載氣為高純氦氣，不分流進(jìn)樣，流速為0.80 mL/min。采用DB-WAX彈性毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），40 ℃柱初溫條件下保持3 min，接著以5 ℃/min升溫至90 ℃，之后以6 ℃/min升溫至230 ℃并保持6 min。質(zhì)譜條件：進(jìn)樣口和接口溫度均為250 ℃；采用電子電離源；電離電壓和發(fā)射電流分別為70 eV和200 μA；溫度200 ℃；四極桿溫度150 ℃；檢測(cè)器電壓1 kV；質(zhì)量掃描范圍33～400 u。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

所有指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果均以±s表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用IBM SPSS Statistics 20版軟件進(jìn)行處理。方差使用通用線性模型程序，數(shù)據(jù)之間的顯著性差異使用Duncan模型在P值小于0.05水平進(jìn)行分析。

色譜原始文件用Xcalibur分析，經(jīng)檢索數(shù)據(jù)庫NIST 2005和Willey 7檢索后，選出純度與匹配度均大于800的檢測(cè)結(jié)果，各組分含量以μg/100 mL表示。按式（2）計(jì)算氣味活度值（odour activity value，OAV），用以評(píng)價(jià)該揮發(fā)性組分對(duì)人乳總體風(fēng)味的影響，OAV大于1的物質(zhì)對(duì)樣品風(fēng)味的形成具有重要貢獻(xiàn)。

式中：Cx為化合物x的質(zhì)量濃度/（μg/100 mL）；OTx為該化合物的感覺閾值/（μg/100 mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍結(jié)方式差異

由圖1A可知，-18、-60 ℃和-60 ℃（Q）三組人乳樣品到達(dá)各條件目標(biāo)溫度（-18 ℃/-60 ℃/ -60 ℃）的時(shí)間分別為117、72.5 min和55 min。在4 h監(jiān)測(cè)期內(nèi)，-18 ℃冷凍條件存在輕微的溫度波動(dòng)， -60 ℃兩組條件下溫度變化較為穩(wěn)定。由圖1B可知，當(dāng)樣品通過最大冰晶形成區(qū)時(shí)，樣品中心溫度在0～-1 ℃范圍內(nèi)下降速度最慢，3 組樣品通過0～-1 ℃溫度區(qū)間的時(shí)間分別為60、17.5 min和7.5 min。

圖1 不同凍藏條件下中心溫度變化曲線Fig. 1 Freezing curves of human milk under different freezing conditions

-18、-60 ℃和-60 ℃（Q）三種凍結(jié)方式的主要差異在于冷凍溫度及冷卻速率。在食品凍藏過程中，冰晶的形成和變化對(duì)食品品質(zhì)有至關(guān)重要的作用[12]。冰晶的大小與冷卻速率和成核溫度密切相關(guān)，冷卻速率越低，成核溫度越高，形成的冰晶越大[13]。本研究中設(shè)置的-18 ℃條件更貼合普通家用冰箱的冷凍環(huán)境，凍結(jié)速率緩慢且存在小幅溫度波動(dòng)；-60 ℃的2 組冷凍條件凍結(jié)速率顯著高于-18 ℃且達(dá)到恒溫冷凍效果， 其中-60 ℃（Q）條件在最大冰晶形成區(qū)的凍結(jié)速率約為-60 ℃條件的2 倍，這表明2 m/s風(fēng)機(jī)在本研究體系中成功應(yīng)用。

2.2 脂質(zhì)含量變化

圖2結(jié)果顯示，人乳樣品在-18 ℃條件下凍藏60 d后，脂肪含量出現(xiàn)明顯下降。而在-60 ℃條件下，以不同速率凍藏的2 組樣品，其脂肪含量在凍藏180 d后與新鮮樣品在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異。該結(jié)果與翟英辰[10]監(jiān)測(cè)-18 ℃與-80 ℃條件下人乳宏量營(yíng)養(yǎng)素變化的結(jié)果相似。目前已有的相關(guān)研究表明，無論是冷藏還是冷凍，低溫保存都可能引發(fā)乳中各營(yíng)養(yǎng)素的一系列物理化學(xué)變化。人乳中的脂肪，主要以乳脂肪球（milk fat globules，MFG）的形式存在于水相中，約98%的甘油三酯（triacylglycerol，TAG）呈層狀排列在內(nèi)部，由極性酯（如磷脂、膽固醇等）組成的膜包裹在MFG外部[14]。造成不同低溫條件下脂肪含量差異的原因主要是TAG分解程度不同，分解程度的關(guān)鍵在于脂肪酶活性的大小。此前有研究表明即使在-20 ℃條件下，脂肪酶也能夠保持一定活性，從而造成TAG的水解[15-16]。因此，相比于普通-18 ℃低溫條件，深低溫條件能夠更好地延緩脂肪的降解。另一方面，García-Lara等[17]測(cè)得超聲勻化復(fù)溫人乳的宏量營(yíng)養(yǎng)素含量高于手動(dòng)勻化樣品，指出人乳中的營(yíng)養(yǎng)素分子在凍融過程中可能附著于器壁表面。因此，除脂質(zhì)分解外，-18 ℃條件下也可能出現(xiàn)脂肪附著的現(xiàn)象，使測(cè)得的脂肪含量下降。

圖2 不同凍藏條件下人乳脂肪含量Fig. 2 Fat contents of human milk under different frozen storage conditions

2.3 NEFA含量變化

脂質(zhì)除98%甘油三酯外，0.5%～1%的脂質(zhì)含量由磷脂組成，0.2%的乳脂以甾醇的形式存在，極微量的游離脂肪酸、二甘油酯和單甘酯則以脂肪分解副產(chǎn)物的形式存在[18]。如圖3所示，新鮮人乳中的NEFA較少，濃度僅為0.37 mmol/L。在-18 ℃凍藏期內(nèi)，NEFA持續(xù)顯著增加，由60 d的12.68 mmol/L增加至180 d的33.07 mmol/L； 在-60 ℃凍藏期內(nèi)，NEFA含量增幅較小，維持在1.62～1.90 mmol/L范圍內(nèi)，且-60 ℃條件下的2種凍結(jié)速率對(duì)人乳脂解水平的影響并不顯著。這與Ahrabi[19]及Berkow[20]等的研究報(bào)道相符，表明-18 ℃條件下脂質(zhì)水解更嚴(yán)重（圖3）。NEFA含量的增加對(duì)人乳品質(zhì)及消化的影響尚無定論。一方面，Hernell等[21]指出當(dāng)嬰兒十二指腸內(nèi)膽鹽較低時(shí)，NEFA比酯化脂肪酸吸收更好，因此NEFA的增加有可能提高嬰兒的生物利用度；另一方面，NEFA也可能會(huì)在貯存過程中形成離子化脂肪酸，與乳中的鈣或其他成分結(jié)合，使其無法被吸收[22]。

圖3 不同凍藏條件下NEFA含量Fig. 3 Contents of non-esterified fatty acids under different frozen storage conditions

NEFA的形成主要源于脂肪酶的作用。人乳中含有2種脂肪酶，分別為膽鹽刺激脂肪酶（bile salt-stimulated lipase，BSSL）和脂蛋白脂肪酶或血清刺激脂肪酶（serum-stimulated lipase，SSL）[23]。BSSL能改善脂肪的消化和吸收，并在視黃醇酯、膽固醇酯等多種物質(zhì)的消化中發(fā)揮作用[24]。SSL在嬰兒消化中暫無相關(guān)功能報(bào)道，但其在乳腺中對(duì)循環(huán)脂肪酸的吸收有一定作用[25]。由于人乳中缺乏激活BSSL所需的膽鹽濃度，學(xué)者們更傾向于將脂解現(xiàn)象的發(fā)生歸因于SSL。目前有研究證實(shí)SSL與牛乳及人乳的脂解有關(guān)，且闡明了SSL在牛乳加工中的自發(fā)性和誘導(dǎo)性水解脂肪作用，而人乳貯藏過程的具體脂解機(jī)制還有待進(jìn)一步探究[26]。

2.4 LPO含量變化

人乳中含有大量抗氧化物質(zhì)，有助于新生兒應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激現(xiàn)象[27]。脂質(zhì)過氧化作為氧化應(yīng)激的一種指標(biāo)，是氧或其他氧化劑對(duì)不飽和脂肪酸直接作用的結(jié)果[8]。當(dāng)乳中自由基負(fù)荷超過抗氧化系統(tǒng)中和能力時(shí)，不飽和脂肪酸易受過氧化作用產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的LPO，其分解產(chǎn)物有丙二醛（malondialdehyde，MDA）和4-羥基烯烴類等物質(zhì)[28]。此前，Miranda等[8]對(duì)比了人乳在4 ℃下貯藏24 h和-20 ℃貯藏10 d的脂質(zhì)氧化情況，發(fā)現(xiàn)MDA只在冷藏乳中增加，而不在冷凍乳中增加；Silvestre等[29]發(fā)現(xiàn)人乳在-20 ℃和-80 ℃貯藏1個(gè)月后，MDA含量均保持穩(wěn)定，繼續(xù)貯藏1個(gè)月后穩(wěn)定性喪失。

本研究中的脂質(zhì)過氧化情況與脂解趨勢(shì)相似。新鮮人乳中LPO濃度約為1.33 μmol/L。-18 ℃條件下，LPO濃度持續(xù)顯著增加，由60 d的3.34 μmol/L增加至180 d的7.60 μmol/L；LPO含量在-60 ℃兩組條件下凍藏60 d后與新鮮樣品無差異，但凍藏180 d后出現(xiàn)少量增加，-60 ℃濃度為3.02 μmol/L，-60 ℃（Q）濃度為2.94 μmol/L。 一方面，冷凍會(huì)造成乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）不同程度的破壞，使脂質(zhì)暴露，加劇氧氣與其他氧化劑對(duì)脂肪酸的作用，同時(shí)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，LPO含量逐漸增加（圖4）。另一方面，乳中過氧化物的增加與抗氧化成分活性的下降有關(guān)[30]。本研究暫未探究相關(guān)活性的變化，但Miranda[8]和Silvestre[29]等均報(bào)道了在-20 ℃條件下，谷胱甘肽過氧化物酶活性下降的現(xiàn)象。因此，相比于普通-18 ℃條件，本研 究-60 ℃冷凍體系能夠更好保護(hù)脂質(zhì)免受過氧化傷害。然而，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)過氧化不可避免，如何評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化程度值得進(jìn)一步探討。

圖4 不同凍藏條件下LPO含量Fig. 4 Lipid peroxide contents under different frozen storage conditions

2.5 脂肪酸組成變化

如表1所示，共測(cè)得10種飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA），9種單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）和13種多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）?？傊舅嶂蠸FA以棕櫚酸（C16:0）為主，UFA以油酸（C18:1,ω-9）和亞油酸（C18:2,ω-6）為主。該結(jié)果與夏袁等[31]報(bào)道相似。

表1 不同凍藏條件下脂肪酸組成Table 1 Fatty acid compositions under different frozen storage conditions

目前關(guān)于凍藏條件下脂肪酸組成的研究較少。Lacomba等[9]觀察到-20 ℃冷凍30 d后人乳脂肪酸含量沒有顯著降低；Romeu-Nadal等[32]分析了脂肪酸在-20 ℃和-80 ℃條件下貯藏12個(gè)月的變化，結(jié)果表明脂肪酸不受冷凍過程的影響。與該結(jié)果類似，本研究中SFA和PUFA占比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有顯著差異，而-18 ℃凍藏180 d的人乳MUFA占比略有下降。然而，本研究發(fā)現(xiàn)一些UFA，如棕櫚油酸（C16:1,ω-7）、油酸、亞油酸和亞麻酸（C18:3,ω-3），在-18 ℃凍藏180 d后的絕對(duì)含量下降較為明顯，而花生四烯酸（C20:4,ω-6）、EPA（C20:5,ω-3）和DHA（C22:6,ω-3）在3種條件下凍藏180 d后均出現(xiàn)下降。該結(jié)果表明，冷凍處理可能不會(huì)影響人乳脂肪酸的總體組成占比，但會(huì)造成DHA等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸含量的下降。這種下降可能是貯藏過程中人乳脂質(zhì)水解和氧化反應(yīng)共同作用的結(jié)果。過長(zhǎng)的凍藏時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致人乳脂所具備的生理功能作用下降。

2.6 微觀結(jié)構(gòu)的變化

對(duì)不同凍藏條件下的HMFG微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定后，得到結(jié)構(gòu)變化如圖5所示。不同于新鮮樣品的均勻分布，冷凍后的HMFG均有不同程度的聚集，其中，-18 ℃條件下的HMFG聚集融合現(xiàn)象最為明顯。這主要是因?yàn)镠MGF的組織結(jié)構(gòu)對(duì)溫度和變溫速率高度敏感[33]。一方面，凍藏溫度越低，MFGM上各磷脂的降解速率越慢[34]。 同時(shí)，MFGM也會(huì)在冷卻過程中釋放一些蛋白和磷脂，造成穩(wěn)定性下降[14]。另一方面，在本研究?jī)鼋Y(jié)體系中，不同冷凍條件生成形態(tài)不一的冰晶，從而導(dǎo)致MFGM不同程度的破裂，而穩(wěn)定性降低的MFG會(huì)相互聚集或在膜破裂處進(jìn)行融合。由于-18 ℃屬于普通低溫而非深低溫條件且凍結(jié)速率緩慢，因此MFGM的結(jié)構(gòu)與組成在此條件下更易發(fā)生改變，微觀結(jié)構(gòu)與粒徑的變化比-60 ℃更為明顯（圖5）。

圖5 不同凍藏條件下乳脂肪球微觀結(jié)構(gòu)Fig. 5 Microstructure of milk fat globules under different frozen storage conditions

值得注意的是，MFGM結(jié)構(gòu)復(fù)雜獨(dú)特，其上存在的多種蛋白和脂質(zhì)在大腦發(fā)育與腸道微生物菌群等方面具有重要的生理學(xué)意義[35]。目前，有關(guān)人乳MFGM的研究多集中在物種差異或特定功能物質(zhì)等方面，其在貯藏過程中的變化機(jī)制及功能影響還有待研究。

2.7 揮發(fā)性物質(zhì)的變化

本研究體系共測(cè)得53種主要的揮發(fā)性成分，分別為19種烴類化合物、4種醇類化合物、9種醛類化合物、4種酮類化合物、6種酸類化合物、9種酯類化合物及2種含硫含氮化合物。各類化合物的具體組成如表2所示。

新鮮人乳含有的揮發(fā)性物質(zhì)含量較少，風(fēng)味特征并不明顯；隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各類物質(zhì)均有所增加。其中-18 ℃條件下?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的增幅最為明顯，而-60 ℃兩種條件下的增速則顯著放緩，增長(zhǎng)物質(zhì)以酸類及醛類為主，烴類物質(zhì)次之。

基于所有揮發(fā)性物質(zhì)的主成分分析（principal component analysis，PCA）評(píng)分結(jié)果（圖6A）顯示，在-60 ℃及-60 ℃（Q）條件下凍藏60 d的2 組樣品的得分點(diǎn)與新鮮樣品最為接近；其次是在-60 ℃及 -60 ℃（Q）條件下凍藏180 d的2 組樣品，其中-60 ℃（Q）相比于-60 ℃略顯優(yōu)勢(shì)；而在-18 ℃凍藏60 d與180 d的樣品得分點(diǎn)則明顯與其分開，且60 d與180 d的得分點(diǎn)按逆PC1方向逐漸分離，表明這2 組樣品的揮發(fā)性組成物質(zhì)存在顯著差異。該結(jié)果表明，凍藏溫度越低，時(shí)間越短，人乳原有風(fēng)味物質(zhì)保持越好。

計(jì)算各組分OAV并將OAV大于1的關(guān)鍵物質(zhì)進(jìn)行PCA后可知，各凍藏組得分的分布趨勢(shì)（圖6B）與基于所有揮發(fā)性物質(zhì)的得分點(diǎn)分布一致。結(jié)合表2及圖6B可知，醛類及酸類化合物含量高且閾值低，是凍藏過程中的主要揮發(fā)性化合物，2 類化合物的關(guān)鍵貢獻(xiàn)性物質(zhì)分別為己醛、庚醛、辛醛、壬醛、(E)-2-辛烯醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛，以及己酸、辛酸和癸酸。酮類及醇類化合物含量雖低，但由于個(gè)別物質(zhì)閾值較低，因而也對(duì)風(fēng)味有一定程度的貢獻(xiàn)，如1-辛烯-3-酮、2-壬酮及1-辛烯-3-醇。此外，烴類化合物雖增幅明顯，但因其風(fēng)味閾值較高，故在醛類及酸類等化合物風(fēng)味強(qiáng)度較明顯的情況下，其現(xiàn)有濃度對(duì)人乳風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度較弱。

表2 不同凍藏條件下的揮發(fā)性物質(zhì)組成Table 2 Composition of volatile compounds under different frozen storage conditions μg/100 mL

續(xù)表2 μg/100 mL

圖6 不同凍藏條件下?lián)]發(fā)性物質(zhì)的PCA評(píng)分圖 Fig. 6 Principal component analysis score plot of volatile compounds under different frozen storage conditions

具體分析看，烴類化合物來源復(fù)雜并且出現(xiàn)頻率不穩(wěn)定，它可能源自乳中游離脂肪酸的自動(dòng)氧化[36]。相比于烴類化合物，醇類及酮類化合物的變化相對(duì)穩(wěn)定，種類無明顯變化，但閾值較低的1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇含量在-18 ℃有所提升，這2種物質(zhì)具有蘑菇香氣。酯類化合物整體呈現(xiàn)甜香、果香等令人愉悅的氣味特征，OAV及PCA（圖6B）結(jié)果表明，酯類化合物中只有乙酸乙酯對(duì)整體氣味貢獻(xiàn)較大，且主要存在于新鮮人乳及 -60 ℃凍藏人乳中。在酸類化合物中，具有脂肪味、汗臭味的癸酸、辛酸、己酸對(duì)凍乳風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。醛類化合物是本研究中對(duì)氣味變化貢獻(xiàn)最大的一類化合物，主要呈現(xiàn)青草香、脂肪味及腐臭味。貢獻(xiàn)顯著的組分均主要存在于-18 ℃凍藏人乳中，按OAV評(píng)價(jià)貢獻(xiàn)依次為己醛、壬醛、辛醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、庚醛以及(E)-2-辛烯醛，其中，(E,E)-2,4-壬二烯醛以及(E)-2-辛烯醛僅存在于-18 ℃凍藏人乳中（表2）。雜環(huán)化合物中，表現(xiàn)出黃油味和青豆味的2-正戊基呋喃在-18 ℃凍藏180 d后，氣味特征開始顯現(xiàn)。

綜上所述，相比于-60 ℃兩種條件，-18 ℃凍藏人乳各類物質(zhì)增幅較大且更易產(chǎn)生青草香、脂肪味、腐臭味、汗臭味等異味物質(zhì)。具有青草香、脂肪味等氣味的物質(zhì)，其生成機(jī)制主要是脂質(zhì)的降解與氧化[37]。這些異味物質(zhì)的前體以PUFA為主，典型前體是亞油酸或亞麻酸，也包含EPA和DHA，可通過酶催化過程或自動(dòng)氧化機(jī)制形成相應(yīng)的羰基氧化物[11,38]。酮類和醇類異味物質(zhì)的產(chǎn)生主要源自亞油酸，亞油酸在脂肪氧化酶E2及裂解酶的作用下經(jīng)過一系列氧化降解反應(yīng)，生成C8及C10的羰基化合物，如1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇；醛類異味物質(zhì)的產(chǎn)生主要源自亞麻酸，亞麻酸在脂肪氧化酶、裂解酶、氫化酶及異構(gòu)酶的作用下可生成C6及C9的羰基化合物，如己醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛等。具有腐臭味和汗臭味物質(zhì)的增加可歸因于游離脂肪酸濃度的增加[39]。該結(jié)果與NEFA、LPO、PUFA含量的變化，均表明-60 ℃兩種條件可更好地維持人乳脂質(zhì)在凍藏過程中的性能。

然而，有學(xué)者指出，雖然嬰兒的嗅覺與味覺敏感度高于成人，但其對(duì)異味的接受度也高于成人，這主要與嬰兒早起接觸的環(huán)境與經(jīng)歷有關(guān)[40]。因此，即便是成人不可接受的風(fēng)味，對(duì)于嬰兒來說也可能在可接受范圍內(nèi)，這也為人乳風(fēng)味研究帶來了一定的難度。未來的研究可將對(duì)嬰兒喂養(yǎng)行為的觀察與風(fēng)味化合物的定量分析相結(jié)合，以確定嬰兒對(duì)異味風(fēng)味物質(zhì)的可接受閾值。

3 結(jié) 論

不同凍藏條件對(duì)人乳脂質(zhì)及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響具有顯著差異。與傳統(tǒng)的家庭-18 ℃冷凍條件相比， -60 ℃深低溫冷凍條件具有凍藏溫度低、凍結(jié)速度快、溫度波動(dòng)小的特點(diǎn)，有利于延緩脂質(zhì)的降解和過氧化水平的升高，減少冰晶對(duì)脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，減少醛類及酸類等異味物質(zhì)的產(chǎn)生，盡可能保持人乳脂所具備的生理功能。雖然-60 ℃（Q）的快速凍結(jié)方式在脂質(zhì)降解與氧化方面與-60 ℃無顯著差異，但-60 ℃（Q）的快速凍結(jié)能夠更有效地維持人乳的原有風(fēng)味。該結(jié)果為研制人乳專用貯藏冰箱提供數(shù)據(jù)支撐，也為進(jìn)一步研究人乳貯藏方式提供思路和依據(jù)。