一步水熱法制備氮摻雜碳點(diǎn)用于Fe3+檢測(cè)及細(xì)胞成像

齊海燕，黃德敏，衣同輝，劉立琨，劉春彤

（1.齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 科研處，黑龍江 齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 醫(yī)藥科學(xué)研究院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾大學(xué)黑龍江省工業(yè)大麻加工技術(shù)創(chuàng)新中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

鐵（Fe）作為生物體不可缺少的痕量金屬元素之一，在氧攝取、氧代謝和電子轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，F(xiàn)e 缺乏或過(guò)量均會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。Fe 缺乏會(huì)引起貧血癥，F(xiàn)e 超標(biāo)則會(huì)引起胰腺、心臟、肺部等功能器官障礙。有研究表明，阿爾茲海默疾病和帕金森癥與Fe 有密切關(guān)系［1］。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（UEPA）和世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定飲用水中Fe含量不得超過(guò)5 μmol/L［2］，故準(zhǔn)確、定量檢測(cè)Fe3+對(duì)環(huán)境保護(hù)和人類健康具有重要意義。

目前，已有多種方法可以實(shí)現(xiàn)金屬離子的檢測(cè)，如原子吸收光譜法［3］、電化學(xué)法［4］、電感耦合等離子體質(zhì)譜法［5］等。雖然這些方法具有較高的靈敏度，但其操作較復(fù)雜、耗時(shí)，測(cè)試成本高，且選擇性和穩(wěn)定性差，樣品制備繁雜。熒光傳感分析法是利用被測(cè)離子與熒光傳感器接觸后發(fā)生熒光增強(qiáng)、猝滅或波長(zhǎng)改變進(jìn)行檢測(cè)的一種分析方法，具有操作簡(jiǎn)單、分析迅速，穩(wěn)定性和選擇性較高等優(yōu)點(diǎn)，并且樣品前處理簡(jiǎn)單、測(cè)試響應(yīng)時(shí)間短，已受到越來(lái)越多的關(guān)注。

碳點(diǎn)是一種具有熒光特性的碳基納米顆粒，光學(xué)性能優(yōu)異，穩(wěn)定性較好，并且具有合成簡(jiǎn)便［6］、生物毒性低［7］、生物相容性好［8］、水溶性好［9］、易于表面修飾和復(fù)合［10］等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于生物體內(nèi)載藥治療［11-13］、生物成像［14-15］、分析檢測(cè)［16-21］、能源轉(zhuǎn)化［22］等領(lǐng)域。由于碳點(diǎn)表面含有豐富的羧基、羥基、氨基等基團(tuán)，賦予了其在分析檢測(cè)領(lǐng)域的眾多優(yōu)異性能。碳點(diǎn)可通過(guò)靜電作用力、電子或能量轉(zhuǎn)移及共價(jià)鍵等作用，或是表面改性，實(shí)現(xiàn)生物分子、離子、微生物、藥物分子等的特異性檢測(cè)。多種物質(zhì)（如金屬離子、陰離子、糖類、黃酮類等）對(duì)碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度有明顯的猝滅作用，因此可以碳點(diǎn)作為熒光探針對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)有的熒光碳點(diǎn)雖可靈敏檢測(cè)Fe3+，但存在熒光量子產(chǎn)率不高、檢出限不夠低等問(wèn)題［23］，因此制備一種熒光產(chǎn)率高且能靈敏檢測(cè)Fe3+的熒光碳點(diǎn)具有重要意義。

氨基酸結(jié)構(gòu)中具有氨基和羧基，作為碳源可在碳點(diǎn)制備過(guò)程中實(shí)現(xiàn)氮原子摻雜，提升熒光量子產(chǎn)率。氨基酸作為一種生物分子，以其為前驅(qū)體所制備的碳點(diǎn)具有更好的生物相容性，可用于細(xì)胞標(biāo)記或細(xì)胞成像。本研究以人體必需氨基酸色氨酸和蘇氨酸為碳源，采用一步水熱法合成了氮摻雜碳點(diǎn)（N-CDs），該碳點(diǎn)水溶性好、熒光量子產(chǎn)率高、生物相容性好、毒性低，對(duì)Fe3+有較好的選擇性和靈敏度，可用于實(shí)際生活飲用水中Fe3+的檢測(cè)。同時(shí)進(jìn)行了碳點(diǎn)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞成像研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

色氨酸、蘇氨酸（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；硫酸奎寧（北京伊諾科技有限公司）；溴化鉀、CuSO4、MnSO4、NiSO4、SrCl2（天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心）；鹽酸、HgCl2、CoCl2、SnCl2、Al2（SO4）3、PbSO4、CdSO4、HCl、NaOH、錫（北京化工廠）；硫酸（吉林省高端化學(xué)工業(yè)有限責(zé)任公司）；FeNH4（SO4）2·12H2O、Na2CO3（西安化學(xué)試劑廠）；Zn粉（中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司）；KCl、CaCl2、NaNO2、Zn（NO3）2（天津市化學(xué)試劑一廠）；MgCl2、NaCl、NaF（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；H2O2（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；NaClO（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。以上試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

人正常肝細(xì)胞株HL-7702（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（北京索萊寶科技有限公司）；CCK-8試劑盒和PBS緩沖液（安徽蘭杰柯科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國(guó)康寧生命科學(xué)有限公司）；玻底培養(yǎng)皿（安徽蘭杰柯科技有限公司）。

島津TU-1901 紫外可見(jiàn)光譜儀、GMB-2 凈水器（北京普析通用儀器有限公司）；島津RF4301-PC 熒光分光光度計(jì)（日本島津責(zé)任有限公司）；傅里葉變換紅外光譜儀（美國(guó)尼高力公司）；ESCALAB250Xi 型X 射線光電子能譜儀（XPS）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；德國(guó)D8-FOCUS型X 射線粉末衍射儀（XRD，德國(guó)BRUKER-AXS 公司）；JEM-2100F 型透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社）；AMR-100全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）；Axio Observer熒光倒置顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司）；K78水熱反應(yīng)釜（上海鞏義市英峪實(shí)驗(yàn)儀器中心）；移液槍（德拉貢實(shí)驗(yàn)儀器（美國(guó)）有限公司）；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)PE20（梅特托利多儀器（上海）有限公司）；WD-9403E紫外燈（北京市六一儀器廠）。

1.2 碳點(diǎn)的制備

以色氨酸和蘇氨酸為碳源，采用水熱法制備碳點(diǎn)。分別稱取0.511 0 g 色氨酸和0.894 0 g 蘇氨酸（摩爾比1∶3），溶于50 mL pH 2.0 的水溶液中，轉(zhuǎn)入5 個(gè)30 mL 的聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，置于烘箱于180 ℃反應(yīng)8 h，待其自然冷卻至室溫后得到黃棕色的碳點(diǎn)水溶液。將該碳點(diǎn)溶液經(jīng)5 000 r/min 離心10 min，除去大顆粒雜質(zhì)，再通過(guò)分子量為500 D的透析袋連續(xù)透析65 h，得到粉紅色碳點(diǎn)水溶液，經(jīng)冷凍干燥后得到淺黃色碳點(diǎn)粉末N-CDs。

1.3 Fe3+離子檢測(cè)

以FeNH（4SO4）·212H2O 為離子源，其溶解后電離產(chǎn)生的NH4+能很好地抑制Fe3+的水解。稱取FeNH4（SO4）·212H2O 固體配制成0.01 mol/L 的儲(chǔ)備液，取少量逐級(jí)稀釋至所需濃度。依次向2 mL 質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL的碳點(diǎn)溶液中加入3 μL不同濃度的Fe3+，使Fe3+的終濃度分別為0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol/L，共同孵育60 s后，以370 nm激發(fā)，記錄熒光發(fā)射光譜，繪制線性曲線。

1.4 選擇性實(shí)驗(yàn)

以各金屬離子（Fe3+、Cu2+、K+、Mn2+、Mg2+、Sr2+、Na+、Co2+、Cd2+、Ca2+、Hg2+、Pb2+、Ni2+、Zn2+、Al3+和Sn2+）和氧化性、還原性離子（Cl-、NO?2、F-、NO?3、ClO-、CO）的可溶性鹽以及H2O2配制濃度均為0.01 mol/L 的檢測(cè)溶液。向2 mL質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL的碳點(diǎn)溶液中加入金屬離子溶液，使其終濃度為0.5 mmol/L，共同孵育60 s后，以370 nm激發(fā)，記錄熒光發(fā)射光譜。

1.5 生活飲用水中Fe3+的測(cè)試

以本地市售瓶裝飲用礦泉水為實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)，直接使用。將4 mL 礦泉水與10 μL 質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的碳點(diǎn)溶液共同孵育60 s，記錄370 nm 激發(fā)波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度，將該值帶入“1.3”獲得的線性方程，得到瓶裝飲用水中Fe3+的濃度。

1.6 細(xì)胞毒性及細(xì)胞成像

HL-7702 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：人正常肝細(xì)胞株HL-7702 采用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用胰蛋白酶-EDTA 消化液消化，用10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液后，按照0.5×104/孔的密度將細(xì)胞接種于96 孔板中，置37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，待細(xì)胞鋪滿后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

碳點(diǎn)用DMEM 高糖培養(yǎng)基溶解并無(wú)菌過(guò)濾后，以DMEM 培養(yǎng)基梯度稀釋為6 個(gè)質(zhì)量濃度（100、200、300、400、500、600 μg/mL）；按100 μL/孔加入HL-7702 細(xì)胞中，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入相同體積DMEM 高糖培養(yǎng)基。置于37 ℃孵育24 h后，按20 μL/孔加入CCK-8檢測(cè)試劑，孵育1 h后于450 nm測(cè)定吸光度。進(jìn)行細(xì)胞存活率測(cè)定：存活率=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%［24］。

HL-7702細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)：按細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)相同方式培養(yǎng)HL-7702細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)按照1×106個(gè)/皿接種于玻底培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞增長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的80%底面積左右時(shí)，按1 mL/孔加入質(zhì)量濃度為300 μg/mL的碳點(diǎn)溶液。培養(yǎng)24 h后，以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌2次去除殘留碳點(diǎn)，然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。加入終質(zhì)量濃度為10、20、40 μg/mL的Fe3+繼續(xù)孵育5 min后，觀察Fe3+的猝滅效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)表征

N-CDs 的透射電鏡表征結(jié)果顯示，碳點(diǎn)呈近似球形（圖1A），高分辨率透射電鏡圖（圖1B）顯示其晶格間距為0.21 nm，粒徑分布在3～5 nm之間，平均粒徑為4.1 nm（圖1A插圖）。N-CDs的XRD譜如圖1C所示，在23°附近有一個(gè)明顯的衍射峰，對(duì)應(yīng)石墨結(jié)構(gòu)碳的（002）晶面，證明所制備的碳點(diǎn)具有與石墨類似的結(jié)構(gòu)［22］。圖1D 為碳點(diǎn)的紅外吸收光譜，由圖可知，3 410 cm-1處為—OH 的伸縮振動(dòng)；2 930 cm-1和2 890 cm-1處的吸收峰為飽和C—H 鍵的伸縮振動(dòng)，1 630 cm-1處為N—H 的變形振動(dòng)，1 513～1 410 cm-1之間的3 個(gè)峰為吲哚環(huán)的吸收峰，1 335～1 200 cm-1處的弱吸收帶為N—H 彎曲振動(dòng)與C—N伸縮振動(dòng)偶合形成的酰胺帶，1 112 cm-1處是C—O的伸縮振動(dòng)峰。

圖1 N-CDs的高分辨率透射電鏡圖（A）、晶格條紋（B）、X射線衍射光譜（C）和FTIR譜圖（D）Fig.1 High-resolution TEM（A），lattice fringes（B），XRD（C）and Fourier transform infrared（FTIR）spectrum（D）of N-CDs

碳點(diǎn)的XPS表征結(jié)果見(jiàn)圖2A，全掃描譜中，532.2、399.8、285.0 eV處分別為O1s、N1s和C1s的特征峰，說(shuō)明該碳點(diǎn)主要由C、N、O 3種元素組成；C、N和O的原子比為70.8%、8.4%和20.8%。對(duì)C1s的特征峰進(jìn)行分解，得到284.5、286.4、288.5 eV 3個(gè)峰（圖2B），分別與C—C/C===== C、C—O、C===== O官能團(tuán)對(duì)應(yīng)。N1s的分解峰在399.8、402.2 eV處（圖2C），表明氮元素主要以C—N鍵和N—H鍵的形式存在。在530.9、532.6 eV處的O1s峰（圖2D）分別歸屬于C===== O和O—C鍵［25-27］。結(jié)合紅外吸收光譜，可以證明碳點(diǎn)表面含有—OH、—COOH、—NH2、吲哚等結(jié)構(gòu)，因此制備的碳點(diǎn)易于修飾且具有良好的水溶性。

圖2 N-CDs的XPS全譜圖（A）與C1s（B）、N1s（C）、O1s（D）的高分辨率XPS譜圖Fig.2 XPS（A）and C1s（B），N1s（C），O1s（D）high-resolution XPS patterns of N-CDs

2.2 碳點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)

通過(guò)測(cè)定得到所制備碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率為87.09%。N-CDs 在水溶液中的紫外吸收光譜如圖3A所示，在278 nm 處的強(qiáng)吸收峰為B 吸收帶（π→π*），表明碳點(diǎn)具有C===== C 共軛結(jié)構(gòu)；在360 nm 處的弱吸收峰為R 吸收帶（n→π*），說(shuō)明碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)中具有n電子的生色基團(tuán)（羰基）且存在與其共軛的結(jié)構(gòu)。圖3A 插圖為N-CDs 水溶液的圖片，其在自然光下呈淡粉色，在365 nm 紫外燈照射下則發(fā)出藍(lán)色熒光。由圖3B 可知，N-CDs 的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為370 nm，發(fā)射峰位置為440 nm，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在最佳激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行。圖3C 顯示，激發(fā)波長(zhǎng)在320～400 nm 內(nèi)改變時(shí)，熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，但其發(fā)射峰位置未發(fā)生變化，與文獻(xiàn)［28］的結(jié)果對(duì)比可知此碳點(diǎn)無(wú)激發(fā)波長(zhǎng)依賴性。

圖3 N-CDs的紫外吸收光譜（A）、熒光光譜（B）和熒光發(fā)射光譜（C）Fig.3 UV spectra（A），fluorescence spectra（B）and fluorescence emission spectra（C）of N-CDs

2.2.1 離子強(qiáng)度的影響為了研究離子強(qiáng)度對(duì)N-CDs 熒光強(qiáng)度的影響，在3 mL 不同濃度的NaCl（pH 7.0）溶液中加入3 μL 質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL 的碳點(diǎn)溶液，使碳點(diǎn)的終質(zhì)量濃度為0.083 3 μg/mL，記錄熒光強(qiáng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度的增加，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度未發(fā)生顯著變化，表明制備的碳點(diǎn)具有較好的耐鹽性。進(jìn)一步考察了碳點(diǎn)的光學(xué)穩(wěn)定性，取2 μL質(zhì)量濃度為0.25 μg/mL的碳點(diǎn)溶液，加入2 mL（pH 7.0）超純水中，使碳點(diǎn)的終質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，N-CDs 的熒光強(qiáng)度在一周之內(nèi)基本不變，證明該碳點(diǎn)有較好的光學(xué)穩(wěn)定性。

2.2.2 pH 值的影響將碳點(diǎn)用于實(shí)際檢測(cè)時(shí)，環(huán)境中的pH 值將會(huì)對(duì)碳點(diǎn)產(chǎn)生影響，因此需對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的pH值進(jìn)行優(yōu)化以提高檢測(cè)靈敏度。在3 mL pH 值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 的一系列鹽酸溶液中，以及pH值為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0的氫氧化鈉溶液中，加入3 μL 質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL的碳點(diǎn)溶液，使其終質(zhì)量濃度為0.041 7 μg/mL，記錄熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖4 所示。隨著酸性增強(qiáng)，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度有所減弱；隨著堿性增強(qiáng)，熒光則顯著猝滅，表明該碳點(diǎn)適用于弱酸和中性條件。

圖4 pH值對(duì)N-CDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of pH value on fluorescence intensity of N-CDs

2.3 N-CDs檢測(cè)Fe3+離子的原理

根據(jù)FTIR 數(shù)據(jù)可知，N-CDs 表面存在羧基、氨基或羥基等有機(jī)基團(tuán)，這些基團(tuán)增強(qiáng)了N-CDs 對(duì)Fe3+的親和性。Fe3+有3 個(gè)正電荷，有利于光誘導(dǎo)電子從N-CDs 轉(zhuǎn)移到Fe3+的d 軌道，與Fe3+選擇性配位形成配位鍵（圖5），形成的配合物可以改變N-CDs的電子結(jié)構(gòu)，影響激發(fā)電子的分布，并通過(guò)有效的光電子或能量轉(zhuǎn)移加速激發(fā)電子的非輻射重組，進(jìn)一步導(dǎo)致熒光猝滅［29-31］。

圖5 N-CDs檢測(cè)Fe3+離子的猝滅原理圖Fig.5 Schematic of quenching mechanism of N-CDs for Fe3+ion detection

2.4 線性關(guān)系及檢出限

考察了N-CDs 對(duì)Fe3+的響應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著鐵離子濃度的增加，碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度逐漸降低，這是因?yàn)镕e3+離子濃度越大，越容易與碳點(diǎn)表面的含氧官能團(tuán)進(jìn)行配位，熒光猝滅越明顯。分別以I0和I表示Fe3+加入前后N-CDs的熒光強(qiáng)度，以I0/I對(duì)鐵離子濃度作圖，結(jié)果顯示，F(xiàn)e3+濃度在1～20 μmol/L和20～50 μmol/L 范圍內(nèi)與I0/I具有良好的線性關(guān)系，其線性方程分別為I0/I=0.001 09［Fe3+］+1.011 7、I0/I =0.003 81［Fe3+］+0.954 9，相關(guān)系數(shù)分別為r2=0.999 4、r2=0.997 3。對(duì)Fe3+的檢出限（S/N=3）為0.36 μmol/L。與文獻(xiàn)報(bào)道的Fe3+的檢測(cè)方法相比（表1），本方法具有較低的檢出限。

表1 不同熒光檢測(cè)法對(duì)Fe3+檢測(cè)性能的比較Table 1 Comparison of performance of different fluorescence methods for detection of Fe3+

2.5 選擇性

進(jìn)一步考察了N-CDs 對(duì)Fe3+的選擇性，在N-CDs溶液中分別加入相同濃度的金屬離子以及具有氧化性和還原性的物質(zhì)。結(jié)果顯示N-CDs 對(duì)Fe3+的響應(yīng)最為顯著（圖6），證明該碳點(diǎn)對(duì)Fe3+具有良好的選擇性，可用于實(shí)際樣品中Fe3+的檢測(cè)。

圖6 N-CDs對(duì)Fe3+的選擇性Fig.6 Selectivity of N-CDs to Fe3+

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

為評(píng)估該方法的可行性，將N-CDs用于生活飲用水中鐵離子的檢測(cè)，水樣為當(dāng)?shù)爻惺圪u的某瓶裝飲用礦泉水。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該碳點(diǎn)對(duì)該瓶裝礦泉水無(wú)明顯響應(yīng)，即未檢出Fe3+。利用原子吸收光譜法對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)，同樣未檢測(cè)到鐵離子。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，向待測(cè)水樣中加入不同濃度（5、10、15 μmol/L）的鐵離子標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。瓶裝礦泉水中Fe3+的回收率為97.3%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不大于2.0%。國(guó)標(biāo)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 5749-2006）中的鐵含量為0.3 mg/L（即5 μmol/L）［37］，高于本方法的檢出限，證明該方法可以用于生活飲用水中鐵離子濃度的檢測(cè)。

表2 生活飲用水中Fe3+的加標(biāo)回收率Table 2 Recoveries of Fe3+spiked in drinking water

2.7 細(xì)胞毒性及細(xì)胞成像

熒光碳點(diǎn)由于具有優(yōu)異的光學(xué)性能、較低的毒性以及良好的生物相容性，被廣泛應(yīng)用于熒光探針領(lǐng)域。N-CDs 具有高的熒光量子產(chǎn)率，適合作為熒光探針標(biāo)記HL-7702 細(xì)胞。材料能否作為生物探針的一個(gè)重要指標(biāo)是細(xì)胞毒性的高低。采用CCK-8 比色法測(cè)試碳點(diǎn)的生物毒性。如圖7A 所示，將HL-7702 細(xì)胞分別在不同質(zhì)量濃度（100、200、300、400、500、600 μg/mL）的碳點(diǎn)中培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)即使碳點(diǎn)質(zhì)量濃度為600 μg/mL，細(xì)胞活性仍高達(dá)94.46%。表明該碳點(diǎn)具有相當(dāng)?shù)偷募?xì)胞毒性，是作為熒光探針標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)的理想材料，且其最佳質(zhì)量濃度為300 μg/mL（圖7A）。

將碳點(diǎn)與HL-7702 細(xì)胞共同孵育后，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)HL-7702 細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化（圖7B），說(shuō)明該碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞沒(méi)有損傷，具有良好的生物相容性；在365 nm條件下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)均有強(qiáng)烈熒光（圖7C），表明該碳點(diǎn)很容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，有望運(yùn)用于載藥治療領(lǐng)域［38］。該碳點(diǎn)能夠特異性識(shí)別Fe3+，在細(xì)胞內(nèi)與Fe3+共同孵育時(shí)，隨著Fe3+濃度升高，熒光逐漸猝滅（圖7D-F）。實(shí)驗(yàn)表明該碳點(diǎn)可用于細(xì)胞成像，且能實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)鐵離子的可視化。

圖7 N-CDs的細(xì)胞毒性（A），HL-7702細(xì)胞與300 μg/mL碳點(diǎn)孵育后的圖像（B），HL-7702細(xì)胞與300 μg/mL碳點(diǎn)孵育后的熒光圖像（C），HL-7702細(xì)胞與300 μg/mL碳點(diǎn)以及10 μg/mL（D）、20 μg/mL（E）、40 μg/mL（F）Fe3+共孵育的熒光圖像Fig.7 Cytotoxicity of N-CDs（A），the image of HL-7702 cells incubated with 300 μg/mL carbon dots（B），the fluorescence image of HL-7702 cells incubated with 300 μg/mL carbon dots（C），the fluorescence images of HL-7702 cells incubated with 300 μg/mL carbon dots with 10 μg/mL（D），20 μg/mL（E），40 μg/mL（F）Fe3+

3 結(jié) 論

采用生物相容性優(yōu)異的天然氨基酸分子色氨酸和蘇氨酸作為前驅(qū)體，利用一步水熱法制備了具有高熒光量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性和耐鹽性好的N 摻雜熒光碳點(diǎn)?；谔键c(diǎn)對(duì)Fe3+的高選擇性猝滅響應(yīng)，建立了鐵離子的檢測(cè)方法。該方法在1～20 μmol/L 和20～50 μmol/L 范圍內(nèi)具有良好的線性，檢出限（S/N=3）為0.36 μmol/L。方法準(zhǔn)確性高，可用于實(shí)際水樣中鐵離子的檢測(cè)。該碳點(diǎn)細(xì)胞毒性低，已成功用于生物體外細(xì)胞成像且實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)Fe3+的可視化，為生物體內(nèi)Fe3+可視化定量檢測(cè)提供了一種可能的途徑。