丹參多糖對肉雞藥物性腎損傷的保護(hù)作用

盧春雨，張 璐，耿玉萌 ，李淑穎，史萬玉,2*，翟向和* (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 07000；2.河北省生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 07000)

氟苯尼考(flufenicol,FFC)，又稱氟甲砜霉素，是一種新型的廣譜抗生素。于1988年在美國被Schering-Plough公司研制成功[1]。FFC最早應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，后廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，使用劑型主要有水針劑、粉散劑、溶液及預(yù)混劑等，適用于各類動(dòng)物疾病防治需要[2]。我國于1999年批準(zhǔn)該藥為二類新獸藥，用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)多種細(xì)菌性疾病[3]。由于FFC大量用于家禽養(yǎng)殖，是禽蛋及禽肉中藥殘檢出率較高的藥物之一[4-5]，使FFC通過飲食進(jìn)入人體產(chǎn)生蓄積，對機(jī)體造成一定程度的損傷。現(xiàn)有研究證明，推薦使用劑量的FFC對肉雞具有明顯的腎臟損傷[6]。FFC不僅可以影響腎臟組織的形態(tài)和功能，還可以升高腎功能指標(biāo)[7-8]。王霄等[9]發(fā)現(xiàn)FFC抑制Nrf2下游信號(hào)通路，下調(diào)抗氧化酶表達(dá)，進(jìn)一步降低機(jī)體抗氧化能力，引起腎臟氧化應(yīng)激。此外，F(xiàn)FC還可誘導(dǎo)肉仔雞腎凋亡相關(guān)因子表達(dá)，導(dǎo)致腎細(xì)胞過度凋亡，加重腎損傷程度。

丹參為唇形科植物丹參 (SalviamiltiorrhizaBge．)的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止血、清心除煩、涼血消癰等功效[10]。丹參中主要的活性成分有丹參酮、丹酚酸以及丹參多糖(Salviamiltiorrhizapolysaccharides，SPMS)等。SPMS是重要的活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等藥理作用[11]。體外試驗(yàn)表明SPMS顯著抑制了脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、iNOS、COX-2的mRNA轉(zhuǎn)錄[12]。動(dòng)物試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)SMPS能明顯減輕肝臟組織的病理改變，有效抑制LPS致小鼠肝臟損傷的TLR4/MyD88炎癥信號(hào)通路[13]。此外，研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加1.5 g/kg丹參藥渣多糖可顯著提高斷奶仔豬血清和肝臟組織總抗氧化能力和超氧化物歧化酶活力，降低血清和肝臟組織丙二醛含量[14]。大量研究表明SPMS具有肝保護(hù)，本課題組試圖通過中醫(yī)肝腎同源理論探究SPMS是否也具有腎保護(hù)，利用0.15 g/L FFC制造肉雛雞腎損傷模型[6]，給予不同劑量的SPMS進(jìn)行干預(yù)，通過研究氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎性因子和NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用，探究SPMS緩解藥物性腎損傷的作用機(jī)制，為SPMS在腎保護(hù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑FFC溶液(市售獸用臨床非處方藥物，純度≥10%)，購自山東神牛動(dòng)物藥業(yè)有限公司)；蘇木精、伊紅染色液購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司)；尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、脂質(zhì)過氧化物(LPO)和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)，均購自南京建成生物工程研究所；IL-6、IL-1β、TNF-α、ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Go Taq?PCR Master Mix(A6001 Promega,USA)；Go ScriptTMReverse Transcription System(A5001,Promega,USA)；Eastep?Super總 RNA提取試劑盒(LS1040,Promega,北京)。

1.2 模型建立及動(dòng)物分組和處理150只1日齡肉雞隨機(jī)分成空白組(K)、模型組(M)、SPMS低劑量組(D)、SPMS中劑量組(Z)、SPMS高劑量組(G)。每組30只?？瞻捉M：自由飲用自來水。除空白組外，其余各組飲用0.15 g/L FFC水，連續(xù)給藥5 d。SPMS組：分低、中、高劑量組，分別混水給予1.25，2.50，5.00 g/L。6日齡，停止用藥(表1)。于21日齡，翅下靜脈采血，在4℃低溫條件下以3 500 r/min離心10 min，分離出血清。并取出腎組織稱質(zhì)量，將腎組織分為兩部分，一部分用4%的多聚甲醛溶液固定，一部分于-80℃冰箱冷凍保存。

表1 肉雞試驗(yàn)分組及處理

1.3 基礎(chǔ)指標(biāo)的測定每天飼喂前，對各組肉雞測體質(zhì)量并記錄，并計(jì)算平均日增體質(zhì)量。

1.4 HE染色取甲醛溶液固定好的腎組織，經(jīng)過梯度濃度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片和蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下，觀察腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.5 腎臟指標(biāo)的測定分離的血清按UA、BUN、CRE生化試劑盒按說明書操作，計(jì)算血清中各指標(biāo)含量。

1.6 腎組織氧化指標(biāo)的測定精確稱取0.1 g腎組織，加入0.9 mL生理鹽水，制成10%組織勻漿。12 000 r/min 離心10 min，保留上清液。用GSH-Px、LPO試劑盒進(jìn)行測定。

1.7 腎組織炎癥因子的檢測制備10%腎組織勻漿，按IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒操作，計(jì)算腎組織中炎癥因子的含量。

1.8 qPCR測定腎臟組織中相關(guān)p65、IκBα、IκKβ mRNA含量使用總RNA提取試劑盒提取腎臟總RNA。吸取1 μL提取的總RNA在RNA測定儀器上檢測，根據(jù)D260/D280值、D260/D230值鑒定RNA是否存在污染、降解現(xiàn)象。根據(jù)所測得數(shù)據(jù)，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。以β-action作為內(nèi)參基因，用RT-qPCR法對p65、IκBα、IκKβ基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，引物由TaKaRa(大連，中國)設(shè)計(jì)并合成。使用LightCycler?96全自動(dòng)熒光定量PCR儀設(shè)置程序如下：預(yù)變性95℃ 30 s;95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s擴(kuò)增4個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt計(jì)算各目的基因相對轉(zhuǎn)錄水平(表2)。

表2 引物和基因序列

2 結(jié)果

2.1 SPMS對FFC誘導(dǎo)的腎損傷肉雞平均日增體質(zhì)量的影響各組初始體質(zhì)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，對其進(jìn)行造模后出現(xiàn)差異。與空白組相比，21 d模型組最終體質(zhì)量、平均日增體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，SMPS高劑量組體質(zhì)量、平均日增體質(zhì)量顯著增加(P<0.01)(表3)。

2.2 SPMS對FFC誘導(dǎo)的腎損傷肉雞腎臟組織HE染色影響在光學(xué)顯微鏡下，空白組肉雞腎組織結(jié)構(gòu)完整清晰，腎小管形狀規(guī)則，未見炎性細(xì)胞浸潤和出血現(xiàn)象。模型組肉雞腎組織結(jié)構(gòu)損傷較為嚴(yán)重，可見明顯的腎小管上皮細(xì)胞崩解，刷狀緣脫落，細(xì)胞碎片進(jìn)入腎小管管腔。腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤，腎臟組織形態(tài)學(xué)的變化進(jìn)一步說明造模成功。與模型組相比，治療組肉雞經(jīng)SPMS預(yù)處理后，腎小管內(nèi)皮細(xì)胞排列相對整齊，炎性浸潤較輕微。并且在治療組中、高劑量效果較好，細(xì)胞炎性浸潤程度較輕，與空白組肉雞腎組織形態(tài)相接近。低劑量組與模型組相比，細(xì)胞炎癥浸潤程度也較輕(圖1)。

2.3 SPMS對FFC誘導(dǎo)的腎損傷肉雞血清CRE、UA、BUN的影響與空白組比較，模型組肉雞血清CRE、UA、BUN水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組相比，SMPS各劑量組BUN水平顯著下降(P<0.05或P<0.01)；SMPS高劑量組UA水平顯著下降(P<0.05)；SMPS各劑量組CRE水平?jīng)]有變化(圖2)。

2.4 SPMS對FFC誘導(dǎo)的腎損傷肉雞腎臟IL-6、IL-1β、TNF-α的影響與空白組比較，模型組肉雞腎臟細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平極顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，SPMS高劑量組可以極顯著降低細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平(P<0.01)；中劑量組可以顯著降低細(xì)胞因子TNF-α水平(P<0.05)；低劑量組細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平有下降趨勢(P>0.05)(圖3)。

A.空白組；B.造模組；C.SPMS低劑量組;D.SPMS中劑量組;E.SPMS高劑量組。黑色箭頭.所指處上皮細(xì)胞脫落；紅色箭頭.所指處有炎性細(xì)胞浸潤

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，#P<0.05，##P<0.01。下同

圖3 試驗(yàn)肉雞腎臟組織IL-6、IL-1β、TNF-α的含量

2.5 SPMS對FFC誘導(dǎo)的腎損傷肉雞腎臟氧化指標(biāo)的影響與空白組相比，模型組肉雞腎組織勻漿氧化指標(biāo)GSH-Px活力極顯著下調(diào)(P<0.01)，LPO水平極顯著上調(diào)(P<0.01)。與模型組相比，SPMS各劑量組GSH-Px活性顯著或極顯著上調(diào)(P<0.05或P<0.01)；SMPS各劑量組LPO極顯著下調(diào)(P<0.01)(圖4)。

圖4 試驗(yàn)肉雞腎臟組織GSH-Px、LPO的含量

2.6 SPMS對FFC誘導(dǎo)的腎損傷肉雞腎組織中p65、IκBɑ和IκKβ表達(dá)的影響與正常組比較，模型組腎臟組織NF-κB、p65和IκKβ mRNA的表達(dá)均升高,IκBɑ mRNA的表達(dá)下降(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，SMPS組肉雞NF-κB、p65和IκKβ mRNA的表達(dá)量均降低，IκBɑ mRNA的表達(dá)升高(P<0.05或P<0.01)(圖5)。

圖5 試驗(yàn)肉雞腎臟組織p65、IκBɑ和IκKβ mRNA表達(dá)量

3 討論

平均日增體質(zhì)量是衡量肉雞生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)之一[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，使用FFC的肉雞平均日增體質(zhì)量出現(xiàn)明顯下降。這可能與FFC引起腸黏膜屏障損傷，抑制有益菌群的活性，造成胃腸道功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體消化吸收功能異常[16]。試驗(yàn)結(jié)果表明，SPMS高劑量(5.00 g/L)組可以顯著提高肉雞的平均日增體質(zhì)量。SPMS能夠促進(jìn)肉雞的生長性能，分析原因是多糖中含有的多種生物活性成分，提高食欲并調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡，促進(jìn)動(dòng)物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝。

血清中CRE和BUN是檢測腎臟疾病的典型指標(biāo)[17]。UA是雞體內(nèi)嘌呤類化合物代謝的最終產(chǎn)物，嘌呤合成與分解發(fā)生紊亂,則形成UA過多。當(dāng)超出腎臟排泄能力時(shí),經(jīng)過積累形成尿酸鹽,沉積在組織臟器中[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組肉雞血清中CRE、BUN、UA含量顯著高于空白組，并且腎臟上皮細(xì)胞出現(xiàn)脫落，炎癥浸潤現(xiàn)象。上述結(jié)果證明，腎損傷模型構(gòu)建成功，并推斷肉雞腎小管上皮細(xì)胞有一定程度的損傷，使腎小球的濾過率降低，進(jìn)而引起機(jī)體代謝紊亂。而給予SMPS可以顯著降低FFC誘導(dǎo)的血清BUN、CRE、CRE含量的增高，表明SMPS對FFC誘導(dǎo)的腎功能損傷具有保護(hù)作用。

一般情況下，機(jī)體代謝所產(chǎn)生的自由基可被自身的抗氧化系統(tǒng)所中和，但在應(yīng)激狀態(tài)下，自由基產(chǎn)生與消除之間的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，自由基在機(jī)體內(nèi)積蓄造成氧化損傷[19]。LPO是飽和脂肪酸在氧自由基作用下形成的細(xì)胞毒性過氧化物。在病理情況下，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)可導(dǎo)致LPO升高，破壞生物膜和損害細(xì)胞的功能[20]。GSH-Px是一種重要的過氧化物酶類,它能將體內(nèi)產(chǎn)生的過氧化物通過還原反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成無毒的羥基化合物，還可催化H2O2分解為H2O和O2分子，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能[21]。模型組GSH-Px活力下調(diào)，LPO水平上調(diào)。說明在FFC誘導(dǎo)下，動(dòng)物體內(nèi)自由基的相對平衡被打破，對動(dòng)物器官組織造成嚴(yán)重的損傷，與王霄等[8]研究一致，確定了FFC誘導(dǎo)腎組織氧化應(yīng)激。試驗(yàn)結(jié)果表明：SPMS各劑量組中GSH-Px活性上調(diào)，LPO水平下調(diào)，說明SPMS可增強(qiáng)和恢復(fù)細(xì)胞的抗氧化酶防御系統(tǒng)。

氧化應(yīng)激可以直接激活NF-κB信號(hào)通路[22]。有研究將NF-κB信號(hào)通路視為炎癥反應(yīng)鏈的“基因開關(guān)”，能調(diào)控多種細(xì)胞因子和炎癥因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)，加速腎臟損傷[23]。在細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，IκB和 NF-κB 結(jié)合形成復(fù)合物，抑制 NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，此復(fù)合體無活性，當(dāng)外界信號(hào)刺激細(xì)胞后，激活 IκB 激酶復(fù)合體(IκK)，使 IκB 磷酸化，NF-κB 成為游離狀態(tài)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合特異性基因序列并誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示模型組NF-κB炎癥信號(hào)通路中，NF-κB-p65、IκKβ蛋白磷酸化顯著增加，同時(shí)，腎組織中TNF-α、IL-6、IL-1β基因表達(dá)水平也上調(diào)，說明該條通路活性上調(diào)。韓超等[22]研究發(fā)現(xiàn)SPMS能有效抑制炎癥反應(yīng)，并減少炎性因子的釋放。在本試驗(yàn)中，給予SMPS后，NF-κB-p65、IκKβ蛋白磷酸化水平下降，抑制IκBα 的降解，明顯降低FFC誘導(dǎo)的肉雞腎臟中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平。提示是由于上游炎癥通路蛋白磷酸化水平下降，抑制下游炎癥因子表達(dá)，從而抑制了這條通路的活性。

本試驗(yàn)表明，SPMS能顯著提高日增體質(zhì)量，改善腎臟組織的病理變化，降低BUN和UA水平，調(diào)節(jié)腎臟的氧化功能，下調(diào)腎組織中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子的表達(dá)，從而起到保護(hù)腎臟功能的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，SPMS對FFC造成的肉雞腎損傷具有顯著地緩解作用，其中以5.00 g/L的SPMS療效顯著。該研究結(jié)果為SPMS用于藥物性腎損傷保護(hù)增加了理論依據(jù)。