棗多糖提取物對環(huán)磷酰胺所致的蛋雛雞腸黏膜機械損傷的修復作用

郭林霞，李樹鵬，趙國先 (河北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071000)

近年來，由于抗菌類藥物的使用不當、飼料中霉菌毒素的影響以及免疫抑制病的廣泛存在，使得動物免疫抑制越來越嚴重，很大程度上阻礙了畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1]。因此，為了消除或緩解免疫抑制、提高機體抗病力、增強動物免疫力，免疫增強劑得以廣泛運用。腸道是體內(nèi)最大的淋巴組織，腸道免疫作用主要通過腸黏膜屏障(機械、化學、生物和免疫屏障)功能實現(xiàn)，其中機械屏障是腸黏膜屏障中最重要的屏障，緊密連接是維持機械屏障的結構基礎[2]，由黏蛋白構成的黏液層覆蓋腸上皮細胞，對緊密連接具有保護作用。有研究表明，免疫抑制會導致畜禽腸黏膜受損，緊密連接蛋白的表達量降低，腸通透性增加[3-4]，而植物多糖則可以有效修復這種損傷，但是目前棗多糖提取物(jujube polysaccharide extract,JPE)對蛋雛雞腸黏膜緊密連接蛋白的影響研究鮮見報道。因此本試驗旨在通過探究JPE對環(huán)磷酰胺(Cy)所致的免疫抑制蛋雛雞空腸緊密連接蛋白表達的影響，為JPE作為免疫增強劑的開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試驗材料1日齡京紅1號蛋雛雞，由河北環(huán)山農(nóng)牧有限公司提供；JPE采用水提醇沉法提取[5]，采用蒽酮-硫酸法測定[6]，純度為21.73%。相對分子質量為27.4 kDa，由森博材料技術研發(fā)中心檢測(液相色譜法)；單糖組成為葡萄糖(43.46%)、果糖(19.95%)、阿拉伯糖(16.45%)、半乳糖(8.35%)、半乳糖醛酸(3.71%)、木糖(3%)、甘露糖(2.8%)、鼠李糖(1.52%)、海藻糖(0.53%)和葡萄糖醛酸(0.24%)，由武漢華士特工業(yè)生物技術開發(fā)有限公司進行測定(液相色譜法)；Cy純度98%，購自上海邁瑞爾化學技術有限公司。

1.2 試驗設計本試驗采用單因子完全隨機試驗設計，另設空白對照組(BC組)，選取體質量相近且健康的1日齡京紅1號蛋雞750只，適應性飼養(yǎng)6 d后隨機分為5組，每組6個重復，每個重復25只雞。Ⅰ組為空白對照組，在7～9日齡時皮下注射0.35 mL 生理鹽水，飼喂基礎日糧。Ⅱ～Ⅴ組在8～10日齡時皮下注射100 mg/kg Cy[7]，1次/d，誘導腸黏膜屏障損傷。分別在基礎日糧中添加0，400，800和1 600 mg/kg JPE[8-9]，試驗期為5周?；A飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎) %

1.3 飼養(yǎng)管理進雛前對雞舍進行全面沖洗及消毒。試驗過程按養(yǎng)雞場的常規(guī)管理程序進行免疫、驅蟲、采光和通風。采食方式、飲水方式和雞群密度按雞場程序調整。各組均勻分布于4層階梯式雞籠，消除位置引起的誤差。試驗期內(nèi)每天08:00和15:00各喂1次料，自由采食和飲水。每天觀察雞群健康狀況，記錄死雞和病雞數(shù)量。

1.4 測定指標及方法

1.4.1空腸分泌因子含量 于試驗的最后1 d從每個重復中選取1只與平均體質量相近的雞，頸部放血致死，剖開腹腔，迅速截取3 cm左右回腸，用生理鹽水沖洗干凈，放入凍存管中，-80℃保存。根據(jù)ELISA試劑盒說明書進行IL-1β和TNF-α含量測定。

1.4.2空腸緊密連接蛋白和黏蛋白的表達量 樣品采集如上1.4.1，利用TRIzol法提取總RNA，電泳檢測質量，使用Nanodrop 2000超微量分光光度計測定RNA濃度及純度后，進行逆轉錄獲得cDNA，再以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)，每組3個重復。參考GenBank雞Occludin、Claudins-1、ZO-1和Mucin-2基因mRNA序列，利用Primer Premier 5.0 軟件進行引物設計，以GAPDH為內(nèi)參基因。引物由武漢塞維爾生物科技有限公司合成，引物信息見表2。

表2 引物信息

2 結果

由表3可知，就Claudin-1表達量而言，與Ⅰ組比，Ⅱ～Ⅴ組降低(P<0.01)；與Ⅱ組比，Ⅲ～Ⅴ組表達升高，其中Ⅲ組差異顯著(P<0.05)，其他差異極顯著(P<0.01)；Ⅳ(P<0.05)和Ⅴ組(P<0.01)比Ⅲ組高，Ⅳ和Ⅴ組組間差異不顯著(P>0.05)。對Occludin而言，與Ⅰ組比，Ⅱ和Ⅲ組降低(P<0.01)，Ⅳ和Ⅴ組升高(P<0.01)；與Ⅱ組比，Ⅳ和Ⅴ組升高(P<0.01)；Ⅳ和Ⅴ組比Ⅲ組高(P<0.01)；其他組間差異不顯著(P>0.05)。對ZO-1而言，組間差異不顯著(P>0.05) 。

表3 JPE對免疫抑制蛋雛雞空腸緊密連接蛋白mRNA表達量的影響

由表4可知，對Mucin-2表達量而言，與Ⅰ組比，Ⅳ和Ⅴ組表達升高(P<0.05)；與Ⅱ組比，Ⅳ(P<0.05)和Ⅴ組(P<0.01)升高；Ⅳ(P<0.05)和Ⅴ組(P<0.01)比Ⅲ組高；其他組間差異不顯著(P>0.05)。

表4 JPE對免疫抑制蛋雛雞空腸黏蛋白mRNA表達量的影響

由表5可知，就IL-1β表達量而言，與Ⅰ組比，Ⅳ組降低(P<0.01)；與Ⅱ組比，Ⅲ(P<0.05)和Ⅳ組(P<0.01)降低；Ⅴ組比Ⅲ和Ⅳ組高(P<0.01)，Ⅲ組比Ⅳ組高(P<0.05)；其他組間差異不顯著(P>0.05)。就TNF-α而言，與Ⅰ組比，Ⅲ和Ⅳ組降低(P<0.01)；與Ⅱ組比，Ⅲ和Ⅳ組降低(P<0.01)；Ⅴ組比Ⅲ(P<0.01)和Ⅳ組(P<0.05)高；其他組間差異不顯著(P>0.05)。

表5 JPE對免疫抑制蛋雛雞空腸IL-1β和TNF-α的影響 ng/g

3 討論

機械屏障是腸黏膜屏障中最重要的屏障，緊密連接是其結構基礎[2]。緊密連接是一種不通透連接，只允許水分和離子選擇性通過，有效抑制腸道病原微生物、有害大分子等的入侵，有效保護腸黏膜屏障的完整性[10-11]。細胞間的緊密連接蛋白的表達量越高，腸通透性越低[12]，腸道通透性增加則會使腸道免疫系統(tǒng)接觸到外來抗原，進而影響免疫屏障功能；緊密連接蛋白表達受阻會破壞腸黏膜屏障的完整性，造成營養(yǎng)代謝功能障礙，從而抑制畜禽生長[13]。

研究表明，Cy可以抑制ZO-1、Occludin和 Claudin-1 mRNA 表達[3-4]，本試驗結果與此基本一致，說明Cy可以通過增加黏膜細胞間的通透性，破壞腸道的完整性，進而增加局部免疫系統(tǒng)接觸外來抗原的可能性，破壞腸道免疫系統(tǒng)。另外有研究表明，魷魚墨多糖可以顯著增加ZO-1和Occludin的mRNA表達量[4]，冬蟲夏草多糖[14]、火麻仁多糖[3]、海藻多糖[15]、白術多糖和牛膝多糖等[16]均顯著增加腸道Occludin、ZO-1和Claudin-1的基因表達量。本試驗結果顯示，與Cy組比，中高劑量組的Occludin和 Claudin-1表達量均顯著增加，說明JPE可以通過促進緊密連接蛋白的表達來降低腸道的通透性，與上述結果一致。中高劑量JPE組的Occludin恢復到了BC組水平，即JPE對緊密連接蛋白表達的影響與劑量有關，800～1 600 mg/kg效果最好。

促炎因子IL-1β和TNF-α會導致腸黏膜緊密連接蛋白表達和分布發(fā)生變化，引起腸道通透性增加[17]。為了驗證JPE對緊密連接蛋白的促進作用是否與IL-1β、TNF-α有直接關系，本試驗測定了腸道中這2種細胞因子的含量。YING等[18]在試驗8～10 d給小鼠注入80 mg/kg的Cy，模型組小腸中IL-1β、TNF-α及緊密連接蛋白表達量均顯著降低。本試驗中Cy對IL-1β和TNF-α的分泌均沒有顯著影響，與緊密連接蛋白的變化不一致。得出Cy對腸道通透性的影響可能與IL-1β和TNF-α的分泌無關，具體機理還需進一步探討。尚慶輝等[6]研究表明，500 mg/kg苜蓿多糖可顯著降低仔豬空腸和回腸TNF-α和IL-1α的表達量，顯著提高小腸各段Occludin以及回腸ZO-1表達量；400,600 mg/L 的沙棘多糖顯著升高Occludin、ZO-1和Claudin-1表達量同時顯著降低IL-1β和TNF-α的水平[19]。本試驗結果顯示，與Cy組比，低中劑量JPE組的IL-1β和TNF-α表達量顯著降低，與上述結果相似。且JPE各個劑量組IL-1β和TNF-α的含量均達到了BC組水平，且就TNF-α含量而言，添加量為400～800 mg/kg效果較好； IL-1β含量隨著JPE添加量的增加呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，即存在最佳添加量(800 mg/kg)。

黏蛋白是構成腸道化學屏障的重要骨架，由杯狀細胞分泌[20]。由黏蛋白構成的黏液層覆蓋在腸上皮細胞上，對緊密連接具有保護作用[21]。付羽萍等[22]試驗顯示，Cy對小鼠空腸和回腸中Mucin-2 mRNA表達水平?jīng)]有顯著性影響，本試驗結果也是如此。而薛然等[3]和BAI等[23]試驗顯示，Cy使小鼠腸道中Mucin-2的表達水平降低，可能與Cy的注射時間及濃度有關。研究表明，滸苔多糖[24]和龍眼肉多糖[23]均可以促進小鼠腸道黏蛋白Mucin-2 mRNA表達；苜蓿多糖[6]可以提高仔豬空腸和回腸Mucin-2 mRNA表達水平。本試驗結果顯示，與Cy組比，中高劑量JPE組Mucin-2 mRNA表達顯著升高，由此說明，JPE可以提高腸黏膜化學屏障功能，與上述結果一致。JPE的各個劑量組均達到了BC組水平，且JPE的劑量為800～1 600 mg/kg時效果較好。

JPE對黏蛋白的影響與緊密連接蛋白變化基本一致，說明JPE可能通過提高Mucin-2 mRNA表達來保護緊密連接，維持腸黏膜屏障的完整性。