復(fù)合乳酸菌和酵母菌對新生犢牛免疫和抗氧化功能的影響

劉 波，敖日格樂*，王純潔，斯木吉德，石林川，陳 浩，何利娜，趙鵬飛，皇甫明科 (.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008；.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 0008)

犢牛腹瀉是犢牛養(yǎng)殖過程中最常見的問題，犢牛飼養(yǎng)的好壞直接關(guān)系到奶牛業(yè)是否能良好健康發(fā)展，也是當(dāng)前畜牧業(yè)研究熱點。據(jù)報道我國致病微生物感染引起的犢牛腹瀉病發(fā)生率為50%～100%，特別是在規(guī)模化大群飼養(yǎng)犢牛中能達(dá)到90%～100%，死亡率50%以上[1-2]。犢牛腹瀉一年四季均可發(fā)生，尤其是新生犢牛發(fā)病率最高，由于其消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)還不夠健全，抵抗力差，在出生后的前2周，腹瀉最為頻繁，嚴(yán)重時可導(dǎo)致其死亡[3]。

目前，實際生產(chǎn)中治療腹瀉采用最多的方法是抗生素療法，但極易產(chǎn)生耐藥性和畜產(chǎn)品抗生素殘留，引發(fā)一系列負(fù)面問題。這使得人們意識到尋找新的替代品的迫切性，益生菌作為抗生素的替代品越來越受到關(guān)注[4-5]。新生犢牛消化道基本處于微生物空白狀態(tài)，此時添加益生菌可以幫助犢牛盡早建立微生物區(qū)系[6]。有研究發(fā)現(xiàn)在幼齡階段添加微生態(tài)制劑對于動物的生長發(fā)育有較為顯著的效果[7]。ETIENNE等[8]研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母菌可在小腸末端對病原菌產(chǎn)生殺菌作用。許多酵母菌能殺滅病原菌并耐受胃腸道環(huán)境，如克魯維酵母和馬克斯克魯維酵母等[9]。研究表明飼喂植物乳桿菌可以提高斷奶仔豬的生長性能和免疫功能[10-11]。LEE等[12]研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合飼喂植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌能夠降低犢牛腹瀉持續(xù)時間，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和預(yù)防犢牛腹瀉。KAWAKAMI等[13]發(fā)現(xiàn)飼喂含乳酸菌和酵母菌的代乳粉能顯著增加飼料轉(zhuǎn)化率、日增體質(zhì)量，減少糞便評分，抑制黑白花奶牛腹瀉并促進(jìn)生長。戊糖片球菌可提高肉仔雞肉品質(zhì)，增強機體清除自由基能力[14]。因此在犢牛出生后盡早飼喂益生菌，有利于優(yōu)勢菌群的建立，對消化道菌群的定植產(chǎn)生積極影響，對提高新生犢牛免疫、抗氧化能力和生長性能，改善胃腸道微生態(tài)環(huán)境進(jìn)而提高我國犢牛生產(chǎn)的經(jīng)濟效益具有重要意義。

然而，目前有關(guān)益生菌的研究多集中在對斷奶后犢牛的添加，對新生犢牛研究較少，且試驗多為對單一物質(zhì)添加效果的研究，對于復(fù)合添加效果的研究較少。因此，本試驗通過對新生犢牛飼喂復(fù)合益生菌，來較早干預(yù)犢牛胃腸道菌群，研究其對犢牛免疫和抗氧化功能的影響，以期防治犢牛腹瀉，提高犢牛生長性能和機體免疫功能，為下一步犢牛專用益生菌產(chǎn)品的研發(fā)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料復(fù)合乳酸菌：乳酸乳球乳亞種(≥2×108CFU/mL)、戊糖片球菌(≥2×108CFU/mL)、植物乳桿菌(≥2×108CFU/mL)；復(fù)合酵母菌：馬克斯克魯維酵母(≥2×108CFU/mL)、釀酒酵母(≥2×108CFU/mL)，所用菌株來自內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院牛生產(chǎn)實驗室從酸馬奶中分離獲得。

1.2 試驗設(shè)計本試驗在內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市騎士牧場進(jìn)行。選取出生3日齡以內(nèi)，體質(zhì)量相近(36±2.53)kg荷斯坦母犢牛40頭，隨機分為4組，每組10頭。分別為對照組(D組)、酵母菌組(S組)、乳酸菌+酵母菌組(LS組)以及乳酸菌組(L組)。在S組代乳粉中加入復(fù)合酵母菌(釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母)50 mL；在LS組代乳粉中加入復(fù)合益生菌(乳酸乳球乳亞種、戊糖片球菌、植物乳桿菌、釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母)50 mL；L組代乳粉中加入復(fù)合乳酸菌(乳酸乳球乳亞種、戊糖片球菌和植物乳桿菌)50 mL；空白組正常飼喂代乳粉，代乳粉營養(yǎng)成分見表1。飼養(yǎng)管理統(tǒng)一按照騎士牧場犢牛中心管理方法進(jìn)行管理，自由采食開食料，營養(yǎng)成分見表1，每天早晚給犢牛供2次溫水，定期驅(qū)蟲保健，母犢牛使用犢牛島(面積為1.3 m×3.5 m)單個培育。

表1 代乳粉和開食料營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ)) %

1.3 血清免疫及抗氧化指標(biāo)的測定在試驗1，15，45 d 清晨使用真空非抗凝采血管對試驗犢牛進(jìn)行空腹頸靜脈采血，靜置30 min，3 000 r/min 離心10 min，分離血清置于液氮中，送回實驗室-80℃保存，用于檢測血清抗氧化、免疫指標(biāo)。血清免疫及抗氧化指標(biāo)采用酶標(biāo)儀測定，包括丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，測定試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合益生菌對新生犢牛抗氧化指標(biāo)的影響由表2可知，在試驗期間，LS和L組的血清T-AOC含量呈顯著上升趨勢(P<0.05)，S組呈現(xiàn)上升趨勢，D組呈下降趨勢，但差異均不顯著(P>0.05)。15 d時，LS、L和S組顯著高于D組，45 d時LS組顯著高于其他3組(P<0.05)。LS和S組的血清SOD和GSH-Px均呈顯著上升趨勢(P<0.05)；L組的血清SOD含量在15 d時顯著高于1，45 d，GSH-Px呈顯著上升趨勢(P<0.05)。15 d 時LS和L組血清SOD含量顯著高于其他2組，45 d 時LS組顯著高于其他3組(P<0.05)。LS和L組血清MDA含量呈顯著下降趨勢(P<0.05)，S組雖然下降但差異不顯著，45 d時LS組血清MDA含量顯著低于其他3組(P<0.05)。

2.2 復(fù)合益生菌對新生犢牛免疫球蛋白的影響由表3可知，在試驗期間，LS組血清IgM，L、LS和S組血清IgG含量呈顯著上升趨勢(P<0.05)，L組血清IgA含量先升后降,15 d顯著高于1 d(P<0.05)。15 d 時，L、LS和S組血清IgA、IgM含量顯著高于D組；45 d時，LS組血清IgA含量顯著高于其他3組，L、LS和S組血清IgM含量顯著高于D組(P<0.05)。

2.3 復(fù)合益生菌對新生犢牛免疫細(xì)胞因子的影響由表4可知，在試驗期間，LS組血清TNF-α含量呈顯著下降趨勢(P<0.05)，D組顯著上升，L和S組有小幅上升趨勢但差異不顯著(P>0.05)，15和45 d 時LS組血清TNF-α含量均顯著低于其他3組(P<0.05)。LS和L組血清IL-10含量呈顯著上升趨勢，45 d時LS組顯著高于其他3組(P<0.05)。LS組血清IL-8含量呈顯著下降趨勢，15 d時顯著低于其他3組(P<0.05)。LS、L、S和D組血清IL-6均呈顯著下降趨勢，45 d時LS組血清IL-6顯著低于其他3組(P<0.05)。15 d時，LS組IL-4顯著高于其他3組(P<0.05)。LS、L和S組血清IL-2均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,15 d時LS組顯著高于其他3組(P<0.05)，45 d時LS、L和S組顯著高于對照組(P<0.05)。

表2 復(fù)合益生菌對新生犢?？寡趸笜?biāo)的影響

表3 復(fù)合益生菌對新生犢牛免疫球蛋白的影響

表4 復(fù)合益生菌對新生犢牛免疫細(xì)胞因子的影響 ng/L

續(xù)表4

3 討論

3.1 復(fù)合益生菌對新生犢?？寡趸笜?biāo)的影響研究顯示，在動物飼糧中添加益生菌可以有效消除體內(nèi)自由基，增強機體抗氧化能力[15]。T-AOC是衡量機體總抗氧化能力的重要指標(biāo)[16]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要終產(chǎn)物，其含量高低可以反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的水平，從而間接反映機體組織細(xì)胞的受損程度[17]。SOD和GSH-Px是機體內(nèi)主要抗氧化酶，其活性越高則清除自由基能力越強[18]。程連平等[19]研究表明在羔羊日糧中添加枯草芽孢桿菌和富硒酵母能顯著降低MDA的含量。添加糞腸桿菌可以提高肉雞肌肉的T-AOC水平，提高機體的抗氧化能力[20]。研究表明給仔豬飼喂嗜酸乳桿菌FT28，仔豬紅細(xì)胞中超氧化物歧化酶活性顯著提高[21]。本試驗結(jié)果表明，與對照組相比，LS組血清中T-AOC、SOD、GSH-Px含量顯著升高，且在15和45 d時LS組均高于或顯著高于L和S組。LS和L組血清中MDA含量均顯著下降，且LS組顯著低于L組。以上結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，表明給新生犢牛飼喂復(fù)合益生菌可顯著提高其機體抗氧化能力，且飼喂復(fù)合乳酸菌+酵母菌的抗氧化效果要好于飼喂復(fù)合乳酸菌和飼喂復(fù)合酵母菌。原因可能是通過飼喂使乳酸菌和酵母菌及時定植在犢牛胃腸道內(nèi)，幫助犢牛盡早建立良好的腸道微生態(tài)環(huán)境，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高了其抗氧化能力，但其具體作用機制尚不明確，將在后續(xù)試驗中深入研究。

3.2 復(fù)合益生菌對新生犢牛免疫球蛋白的影響血清中免疫球蛋白的濃度可以反映機體的免疫功能，它們在保護(hù)動物機體免受病毒感染中發(fā)揮著重要作用[22]。體液免疫是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，該系統(tǒng)由一系列參與病原體清除的免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)組成，主要由釋放抗體的B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)[23]。IgM 是免疫反應(yīng)最初階段產(chǎn)生的抗體,IgG 在系統(tǒng)免疫反應(yīng)中起著重要作用，是體液免疫反應(yīng)的主要抗體。IgA 是黏膜免疫的主要抗體，其主要功能是在非特異性免疫防護(hù)機制的協(xié)助下減少病原菌[24]。腸道中的免疫系統(tǒng)非常發(fā)達(dá)，攝入益生菌后，益生菌可以通過刺激動物腸道免疫系統(tǒng)，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，例如刺激B細(xì)胞分泌IgA，從而增強機體的體液免疫水平[25]。本試驗中，相比于試驗1 d，LS組血清中IgM、IgG含量在45 d時顯著升高，IgA含量也有升高趨勢。研究表明，益生菌還可以激活腸黏膜中相關(guān)淋巴組織，刺激分泌性免疫球蛋白，提高免疫識別能力，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，激活全身免疫系統(tǒng)，從而增強機體的免疫功能[26]。添加了酵母培養(yǎng)物的蛋雞具有較高的血清IgA和IgG濃度，且IgM有升高趨勢[27]。布拉氏酵母顯著增加豬腸道內(nèi)IgA抗體分泌[28]。以上結(jié)果均與本研究結(jié)果一致，說明飼喂復(fù)合益生菌可以提高犢牛免疫功能，相比于對照組，飼喂復(fù)合乳酸菌+酵母菌的犢牛顯著高于飼喂復(fù)合酵母菌和飼喂復(fù)合乳酸菌，可能是由于復(fù)合乳酸菌和復(fù)合酵母菌聯(lián)合作用刺激機體B細(xì)胞分泌 IgA，增加 IgG 的分泌，活化輔助性 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等對機體進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明，乳酸菌類益生菌進(jìn)入機體后，活化腸黏膜內(nèi)的相關(guān)淋巴組織，促使分泌型免疫球蛋白分泌量增加，提高免疫識別能力，并誘導(dǎo) T 細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，最后通過淋巴細(xì)胞再循環(huán)而活化全身免疫系統(tǒng)，進(jìn)而增強機體的非特異性和特異性免疫功能[29]。

3.3 復(fù)合益生菌對新生犢牛免疫細(xì)胞因子的影響血液中免疫細(xì)胞因子的濃度可以反映機體細(xì)胞免疫的狀態(tài)[30]。研究表明，益生菌可通過調(diào)控細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)局部炎癥，同時增強宿主免疫力[31]。IL-2、IL-6、TNF-α在介導(dǎo)炎性反應(yīng)方面具有重疊性，IL-4和IL-10 都能選擇性地阻止促炎因子的合成及與受體的結(jié)合，減輕炎性反應(yīng)對機體的傷害[32]。IL-4的主要功能是誘導(dǎo) B 細(xì)胞成熟并刺激其產(chǎn)生免疫球蛋白，對于體液免疫具有重要調(diào)節(jié)作用[33]。單核因子(如IL-6、IL-8、TNF-α等)在參與機體免疫應(yīng)答方面是炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑，使B細(xì)胞分化和誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖分化[34]。IL-8是一種趨化因子，能趨化中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和嗜酸粒細(xì)胞，使微循環(huán)血流淤滯，組織壞死，造成器官功能損傷[35]。有研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌PB6可以降低血清IL-6和TNF-α水平,從而減輕結(jié)腸黏膜炎癥[36]。陳生龍等[37]研究表明，斷奶仔豬血清中 IL-10 和 IL-4 含量隨干酵母添加水平增加而逐漸增加，說明干酵母能刺激抗炎因子產(chǎn)生，抑制炎性反應(yīng)。據(jù)研究，高水平的IL-2、IL-4和IL-10等細(xì)胞因子通過共刺激促使B淋巴細(xì)胞增殖和分化[38]。本研究結(jié)果顯示，與1 d相比，LS組在45 d時血清中IL-2、IL-10含量顯著升高，IL-4含量有升高趨勢但差異不顯著，IL-6、IL-8、TNF-α含量顯著下降；在15 d時，LS組IL-2含量顯著升高。試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致，說明飼喂復(fù)合益生菌能顯著降低IL-6、IL-8、TNF-α含量，促進(jìn)IL-2、IL-10含量升高，即激發(fā)抗炎因子的釋放、抑制促炎因子、減輕機體炎癥反應(yīng)，增強犢牛適應(yīng)性免疫應(yīng)答，提高腸黏膜屏障功能，從而減少腹瀉的發(fā)生，且復(fù)合乳酸菌+酵母菌效果好于另外兩組。

飼喂復(fù)合益生菌可以顯著提高新生犢牛機體免疫抗氧化能力，增加腸道有益菌定植，建立良好的腸道微生態(tài)環(huán)境，且飼喂復(fù)合乳酸菌加酵母菌效果最好。