心血管轉(zhuǎn)化研究的若干進(jìn)展

陸 林， 代 楊， 王曉群， 吳立群， 張瑞巖， 沈衛(wèi)峰

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究所，上海 200025）

轉(zhuǎn)化研究一詞演化自20世紀(jì)90年代的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)，其含義是針對(duì)臨床科學(xué)問(wèn)題，通過(guò)多學(xué)科交叉合作，深入開(kāi)展基礎(chǔ)研究，并促進(jìn)研究成果得到快速應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)從“實(shí)驗(yàn)室到床邊”的轉(zhuǎn)化。繼而，從臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)新問(wèn)題，提出新設(shè)想、新思路，再回到實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展更為深入的研究，使后續(xù)研究不斷向徹底解決疾病的目標(biāo)靠攏。轉(zhuǎn)化研究即倡導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室與臨床研究的雙向轉(zhuǎn)化，解決臨床實(shí)際需求。轉(zhuǎn)化研究概念一經(jīng)提出，就引起基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)和生物制藥界，以及醫(yī)學(xué)科技規(guī)劃與管理等領(lǐng)域的極大關(guān)注。如今，轉(zhuǎn)化研究已從概念轉(zhuǎn)化為熱門(mén)研究模式。在心血管疾病領(lǐng)域，轉(zhuǎn)化研究取得了顯著成果，不少研究結(jié)果被運(yùn)用于臨床實(shí)踐，或處于臨床試驗(yàn)階段。本文就其中代表性方面進(jìn)行論述。

蛋白質(zhì)組學(xué)運(yùn)用于心血管疾病生物標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)

許多心腦血管疾病和代謝性疾病的心腦血管并發(fā)癥等都由遺傳和環(huán)境因素長(zhǎng)期共同作用導(dǎo)致。近數(shù)十年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)理論和檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟，其在這些疾病的發(fā)病機(jī)制、發(fā)病相關(guān)蛋白質(zhì)檢測(cè)和干預(yù)研究中起重要作用[1]。如發(fā)現(xiàn)對(duì)臨床診斷心力衰竭（心衰）有重要意義的N末端腦鈉肽前 體 （N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NTproBNP）和可溶性腫瘤發(fā)生抑制蛋白2（soluble suppression of tumorigenicity 2,sST2）等[2]，以及反映心血管炎癥和損傷指標(biāo)C-反應(yīng)蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）和肌鈣蛋白等[3]。蛋白質(zhì)組學(xué)在轉(zhuǎn)化研究中被廣泛運(yùn)用的緣由在于：①蛋白質(zhì)是疾病病理生理發(fā)展的主體，其水平改變與基因轉(zhuǎn)錄本水平間相關(guān)性并不強(qiáng)（10%～30%）[1]，蛋白水平較多受到翻譯后調(diào)控的影響；②疾病機(jī)制中許多重要蛋白質(zhì)分泌入血發(fā)揮致病效應(yīng)，因此更便于蛋白組學(xué)檢測(cè)；③疾病過(guò)程中蛋白質(zhì)翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的交互作用及蛋白質(zhì)降解也可通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)。但是，其也有不足之處，由于血漿3 000余種蛋白質(zhì)成分中存在眾多高峰度蛋白，如白蛋白、免疫球蛋白和纖維蛋白原等，使許多低峰度而有研究?jī)r(jià)值蛋白質(zhì)的檢測(cè)較為困難。

目前常用的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)策略有全體檢測(cè)（global discovery）、靶點(diǎn)鑒定（targeted proteomics）、靶向檢測(cè)（targeted discovery）。非靶向全體檢測(cè)方法是對(duì)疾病和對(duì)照蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行酶學(xué)降解后，用質(zhì)譜檢測(cè)樣本內(nèi)所有肽段并定量，如shortgun法。該方法能盡可能多地發(fā)現(xiàn)所有蛋白肽段，但缺乏敏感性，在檢測(cè)低峰度蛋白質(zhì)肽段時(shí)有一定困難。靶點(diǎn)鑒定是高敏感性和高特異性的質(zhì)譜檢測(cè)手段，主要檢測(cè)預(yù)知蛋白質(zhì)肽段的有限位點(diǎn)或片段信息，如蛋白質(zhì)位點(diǎn)的翻譯后修飾等。靶向檢測(cè)則是居于靶向和非靶向之間的策略，目的是以一定通量檢測(cè)一組靶向蛋白質(zhì)成分的信息，如基于抗體富集的芯片陣蛋白質(zhì)肽段檢測(cè)等[1]。

近年來(lái)，得益于蛋白質(zhì)組學(xué)和RNA測(cè)序等聯(lián)合運(yùn)用來(lái)針對(duì)不同組織和細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)不少與心血管疾病發(fā)生有密切關(guān)系的重要基因突變，以及蛋白質(zhì)表達(dá)水平、交互作用、翻譯后修飾等方面的異常，為心血管疾病檢測(cè)、預(yù)警和干預(yù)研究提供了重要幫助。

心肌纖維化的檢測(cè)和治療

心衰發(fā)生的病理生理過(guò)程中，纖維化起關(guān)鍵作用。廣義心肌纖維化是指心肌細(xì)胞間質(zhì)中基質(zhì)過(guò)度積累，按病理生理機(jī)制劃分為修復(fù)性纖維化和反應(yīng)性纖維化。修復(fù)性纖維化發(fā)生在心肌梗死（心梗）的壞死組織區(qū)域。當(dāng)炎性細(xì)胞清除壞死組織后，在促纖維化因子的作用下啟動(dòng)纖維化過(guò)程，成纖維細(xì)胞增殖，遷移、轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維細(xì)胞，用以替代壞死的心肌，心梗3～6周后梗死區(qū)膠原含量達(dá)到最高。反應(yīng)性纖維化發(fā)生在非缺血性心肌間質(zhì)或血管周?chē)?，如高血壓、衰老和射血分?jǐn)?shù)保留性心衰（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）中，由 于受炎性、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system，RAS）及其旁分泌、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等因素作用而發(fā)生的一種長(zhǎng)期適應(yīng)性病理過(guò)程，也是心肌重構(gòu)的表現(xiàn)之一。疾病進(jìn)程中，纖維化處于動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程，受下述因素影響：①成纖維細(xì)胞動(dòng)員并向肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變；②細(xì)胞間質(zhì)纖維化參與蛋白的翻譯后修飾等[4]。

心衰中，心肌纖維化病理過(guò)程不會(huì)自行終止，反而持續(xù)進(jìn)展。這與病因和誘因的復(fù)雜性和持續(xù)性有關(guān)，從而造成全身和局部炎癥持續(xù)存在，成纖維細(xì)胞持續(xù)增殖和激活，心肌纖維細(xì)胞凋亡降低。目前，關(guān)于心肌纖維化有3個(gè)問(wèn)題有待進(jìn)一步探究：①對(duì)不同心衰病理機(jī)制下心肌纖維化進(jìn)行定義，概念及基本病理生理機(jī)制有待進(jìn)一步深化。②需要有與纖維化特點(diǎn)相關(guān)聯(lián)的生物標(biāo)志物和影像學(xué)技術(shù)。血清學(xué)指標(biāo)如Ⅲ型前膠原N端前肽（N-terminal procollagenⅢpropeptide，PⅢNP）、半乳凝素3（galectin-3）、Ⅰ型前膠原C-端前肽（procollagen typeⅠC-terminal propeptide，CITP）、ST2、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）等。研究顯示除PⅢNP和CITP外，循環(huán)血中纖維化標(biāo)志物與組織中纖維化程度并不平行。對(duì)心肌纖維化的影像學(xué)檢測(cè)主要依靠超聲心動(dòng)圖和心臟磁共振。磁共振T1掃描可對(duì)心肌細(xì)胞外容積（extracellular volume，ECV）進(jìn)行定量，這對(duì)細(xì)胞間隙纖維化、水腫、蛋白降解或聚集、脂質(zhì)積累、鐵或淀粉沉積等均有反映。③對(duì)心肌纖維化病理過(guò)程的干預(yù)手段[4]。

以往研究和轉(zhuǎn)化研究發(fā)現(xiàn)，RAS抑制劑、醛固酮受體拮抗劑可減少纖維化。TIMP對(duì)纖維化的療效有限。在干預(yù)上游元素的臨床試驗(yàn)中，如TGF-β抑制劑吡非尼酮（pirfenidone）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）抑制劑、內(nèi)皮素受體阻斷劑、胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）抑制劑等。吡非尼酮能降低TGF-β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）等促纖維化因子，對(duì)心臟負(fù)荷過(guò)重或高血壓等纖維化有效，可降低心律失常發(fā)生。CTGF具有上調(diào)TGF-β、骨形態(tài)生成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、Wnt、血管生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和整合素等作用。CTGF單抗pamrevlumab（FG-3019）對(duì)400例糖尿病腎病、胰腺癌、原發(fā)性肺纖維化和肝纖維化患者使用后安全。半乳凝素-3與固有免疫炎癥有關(guān)，心衰時(shí)受炎性細(xì)胞誘導(dǎo)后增高，促進(jìn)心肌纖維化。用干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）或小分子抑制半乳凝素-3能有效抑制組織器官纖維化。半乳凝素-3抑制劑在臨床試驗(yàn)中。

非編碼RNA中，微RNA（microRNA，miRNA）-21抑制劑在Ⅱ期臨床試驗(yàn)中顯示能夠干預(yù)腎纖維化，miRA-29b更具心臟特異性，其抑制劑對(duì)心衰心肌纖維化的影響正在臨床試驗(yàn)中。

心房顫動(dòng)機(jī)制的認(rèn)識(shí)和干預(yù)

心房顫動(dòng)（房顫）是老年人群和心血管疾病患者中常見(jiàn)的合并疾病，陣發(fā)性、持續(xù)性或永久性房顫的發(fā)病機(jī)制有顯著差別。射頻消融進(jìn)行肺靜脈隔離手術(shù)治療房顫的療效和長(zhǎng)期預(yù)后差別很大[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)促發(fā)房顫的一些病理生理方面重要因素，如Ca2+介導(dǎo)的異位興奮性增高使心電沖動(dòng)產(chǎn)生異常，基礎(chǔ)疾病或心外膜脂肪代謝異常引起的心肌纖維化、心房重構(gòu)，細(xì)胞間傳導(dǎo)的離子連接蛋白（connexin）功能失調(diào)和Na+通道功能異常等導(dǎo)致基質(zhì)病變，導(dǎo)致興奮沖動(dòng)傳導(dǎo)異常，心電不應(yīng)期異常等，這些均有利于房顫發(fā)生和折返環(huán)的建立。另外，還發(fā)現(xiàn)不少房顫的促進(jìn)因素，包括Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin-dependent protein kinase-Ⅱ，Ca2+/CaMKⅡ）和NLRP3（NACHT、LRR、PYD domain-containing protein 3）-炎性小體途徑促發(fā)和維持折返機(jī)制與慢性房顫發(fā)生和持續(xù)有重要關(guān)系。此外，運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）和候選基因策略發(fā)現(xiàn)與房顫有關(guān)的致病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因（PRRX1、ZFHX3、GATA、TBX5、Pitx2、NFAT等），以及miRNA（miR-1、miR-26、miR-133等）經(jīng)改變Ca2+處理，降低傳導(dǎo)、縮短有效不應(yīng)期誘發(fā)促發(fā)和折返[6]。

基于上述發(fā)現(xiàn)，臨床轉(zhuǎn)化方向在于抑制全身/局部組織炎癥和氧化應(yīng)激；降低心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中Ca2+水平；尋找異位沖動(dòng)產(chǎn)生、傳導(dǎo)異常機(jī)制中的重要致病基因和通路，并進(jìn)行干預(yù)；抑制RAS、PDGF、CTGF、TGF和各種促進(jìn)心血管纖維化的危險(xiǎn)因素；糾正引發(fā)傳導(dǎo)異常有關(guān)的遺傳異常和重構(gòu)的連接蛋白等。

高脂血癥強(qiáng)效抑制劑：基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化的范例

前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）是低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）代謝過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)元素。LDL是動(dòng)脈粥樣硬化的重要病因。生理情況下，LDL與肝臟細(xì)胞表面的LDL受體（LDL receptor，LDLR）結(jié)合，內(nèi)吞入細(xì)胞中，與溶酶體融合后LDL被降解。而LDLR則再循環(huán)返回肝臟細(xì)胞表面繼續(xù)實(shí)施結(jié)合LDL功能，即血清LDL的生理性代謝過(guò)程。生理情況下，PCSK9在肝臟、小腸和腎臟細(xì)胞中合成后分泌入細(xì)胞間質(zhì)和循環(huán)中，其功能在于與肝臟細(xì)胞表面LDLR結(jié)合后，一起內(nèi)吞，在溶酶體中降解LDLR，調(diào)節(jié)LDLR水平，從而維系血脂穩(wěn)態(tài)。

轉(zhuǎn)化研究在家族性高膽固醇血癥研究中發(fā)現(xiàn)，PCSK9功能獲得性突變患者存在高脂血癥，而功能缺失性突變則終身低膽固醇血癥，動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管病的風(fēng)險(xiǎn)低。動(dòng)脈粥樣硬化研究認(rèn)為，循環(huán)血PCSK9是反映動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病和冠狀動(dòng)脈病變危重度的生物學(xué)標(biāo)志物。在一項(xiàng)161例遺傳性家族性高脂血癥研究中，發(fā)現(xiàn)血清PCSK9水平與冠狀動(dòng)脈鈣化積分顯著相關(guān)[7]。在另一項(xiàng)經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診冠心病的研究中發(fā)現(xiàn)，循環(huán)血中PCSK9水平與冠狀動(dòng)脈內(nèi)超聲檢測(cè)脂質(zhì)斑塊核心容量組分呈正相關(guān)。在挪威開(kāi)展的一項(xiàng)隨訪11年的人群研究中發(fā)現(xiàn)，1 488例心?；颊吆?1 819例非冠心病對(duì)照中PCSK9最高四分位水平組較最低四分位水平組的心梗危險(xiǎn)高47%[8]。另外，在2 030例造影證實(shí)的急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者中，血漿PCSK9水平與炎癥水平、調(diào)脂療效和臨床ACS表現(xiàn)相關(guān)[9]。

正因?yàn)镻CSK9與高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，臨床轉(zhuǎn)化中運(yùn)用PCSK9單抗[如依洛尤單抗（evolocumab）、阿利西尤單抗（alirocumab）]、siRNA（如inclisiran）、反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO）、PCSK9疫苗（AT04A）等策略來(lái)下調(diào)或抑制PCSK9。PCSK9單抗臨床使用起步最早，在已服用他汀類(lèi)藥物的純合子和雜合子家族性高脂血癥患者中約降低50% LDL水平[10]。PCSK9 siRNA通過(guò)抑制PCSK9的mRNA翻譯來(lái)降低蛋白水平，其作用時(shí)間明顯長(zhǎng)于PCSK9單抗，一次用藥180 d后LDL水平平均降低53%[11]。此外，相對(duì)于單抗僅結(jié)合并干預(yù)循環(huán)中PCSK9的作用機(jī)制，PCSK9 siRNA能降低肝臟組織和循環(huán)中PCSK9水平。PCSK9疫苗AT04A已研制成功。小鼠實(shí)驗(yàn)中，AT04A能降低53% LDL水平，抑制炎癥，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積下降64%[12]。以上措施在抑制PCSK9同時(shí)還能下調(diào)25%～30%脂蛋白（a）水平達(dá)，并升高HDL水平[7]。

PCSK9抑制劑的效應(yīng)得到臨床試驗(yàn)的有力支持。在入選27 564例動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)FOURIER中，依洛尤單抗使用后48周時(shí)LDL水平降低59%，由2.39 mmol/L（92 mg/dL）降至0.78 mmol/L（30 mg/dL）。隨訪26個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，非致死性心梗、腦卒中和再血管化手術(shù)等一級(jí)終點(diǎn)事件下降1.5%[13]。亞組分析顯示，以往心?；颊吆屯庵苎芗膊』颊呓?jīng)PCSK9抑制治療后終點(diǎn)事件的發(fā)生率均明顯降低。另外，OSLER1、OSLER2和ODYSSEY研究也證實(shí)PCSK9抑制劑對(duì)LDL水平的降低和心血管預(yù)后的改善[13]。

非編碼RNA與心血管疾病

人類(lèi)基因組中99%核苷酸序列都不編碼蛋白質(zhì)，其中相當(dāng)部分非編碼RNA的主要功能是調(diào)控蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。非編碼RNA包括miRNA、siRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LnRNA）。研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA與心血管系統(tǒng)的生理學(xué)調(diào)節(jié)及疾病發(fā)生有密切關(guān)系，其中一些可被轉(zhuǎn)化用于疾病診斷和干預(yù)手段[14]。

miRNA調(diào)控心梗后心肌損傷和重構(gòu)。心肌缺血后miR-15家族成員水平上調(diào)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而用抗miRNA來(lái)抑制miR-15成員可下調(diào)Bcl-2、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silence information regulator 1，SIRT1），從而降低小鼠心臟梗死面積。心梗后miR-34家族成員表達(dá)升高，抑制miR-34家族能增強(qiáng)心梗后心臟恢復(fù)。抑制miR-15和miR-92a能增加心梗后血管新生，改善心臟功能。另外，發(fā)現(xiàn)一些miRNA與小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生有關(guān)。miR-126能保護(hù)血管內(nèi)皮，剔除miR-126-5p削弱血管內(nèi)皮對(duì)高脂血癥的抵抗，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生中起重要作用，miR-155能促進(jìn)炎癥，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化，下調(diào)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[15]。血漿中高密度脂質(zhì)白（high density lipoprotein，HDL）通過(guò)ABCA1和ABCG1這2個(gè)原件實(shí)施脂質(zhì)逆轉(zhuǎn)運(yùn)，保護(hù)血管，抑制動(dòng)脈粥樣硬化。miR-33a/b、miR-19b、miR-144、miR-148a均能結(jié)合ABCA1的3’非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’UTR），干擾該脂質(zhì)逆轉(zhuǎn)運(yùn)原件[14]。

與miRNA相似，LnRNA失調(diào)與心功能不全有關(guān)，LnRNA中的心臟肥大相關(guān)因子（cardiac hypertrophy-associated transcript，CHAST）與小鼠和人心肌肥厚有關(guān)，抑制CHAST可減少心肌重構(gòu)和心衰。另外，INK4位點(diǎn)反義非編碼RNA（antisense noncoding RNA in the INK4 locus，ANRIL）調(diào)控與細(xì)胞增加黏附基因表達(dá)有關(guān)，也與動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重度相關(guān)[16]。

目前，已運(yùn)用于臨床或處于轉(zhuǎn)化前期試驗(yàn)中的非編碼RNA眾多。如納米攜帶siRNA抑制PCSK9下調(diào)LDL水平，從而干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化；miR-92a抑制心肌缺血后損傷及促進(jìn)血管內(nèi)膜損害后再內(nèi)皮化；siRNA抑制Ca2+調(diào)節(jié)因子受磷蛋白（phospholamban），干預(yù)心衰；siRNA抑制單核細(xì)胞趨化因子受體2（chemokine C-C motif receptor 2,CCR2），干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化等。

綜上，近數(shù)十年來(lái)，心血管疾病的轉(zhuǎn)化研究受到極大關(guān)注。本文所論述的這些熱點(diǎn)涉及蛋白質(zhì)組學(xué)在心血管疾病診斷和干預(yù)中的運(yùn)用，心肌纖維化的檢測(cè)和治療，房顫?rùn)C(jī)制的認(rèn)識(shí)和干預(yù)，高脂血癥的強(qiáng)效抑制劑，非編碼RNA與心血管疾病發(fā)生與干預(yù)等。相信隨著研究深入和轉(zhuǎn)化的不斷推進(jìn)，基礎(chǔ)研究成果將被更多地運(yùn)用于臨床實(shí)踐，造福患者。