肉牛呼吸道皮特不動(dòng)桿菌的生物學(xué)特性分析

樊利虹，王之盛，左之才，*，才冬杰，易 軍，馬曉平，茍麗萍，王 巍

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，四川 成都 611130；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066)

皮特不動(dòng)桿菌()屬于莫拉菌科，不動(dòng)桿菌屬，不運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性球桿菌，其廣泛存在于自然界，可定植在土壤、污水、蔬菜、皮膚、醫(yī)療器械等環(huán)境中。該菌的營(yíng)養(yǎng)需求不高，能夠在以乙酸為唯一碳源，氨為唯一氮源的礦物介質(zhì)中生長(zhǎng)，并且在25～41℃之間都能生長(zhǎng)；其生化特性與大部分不動(dòng)桿菌相似，嚴(yán)格好氧，氧化酶陰性，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，葡萄糖非發(fā)酵型，吲哚陰性。近年來(lái)，皮特不動(dòng)桿菌的臨床分離率逐漸升高。在引起人類的感染中，皮特不動(dòng)桿菌被報(bào)道為院內(nèi)感染重要的條件致病菌，可導(dǎo)致院內(nèi)病人菌血癥、肺部和尿路感染等；還可引起水生動(dòng)物武昌魚(yú)、泥鰍和斑馬魚(yú)的菌血癥，也可能與犬貓呼吸道疾病(化膿性鼻炎和支氣管炎)有關(guān)。但目前關(guān)于肉牛源皮特不動(dòng)桿菌相關(guān)的報(bào)道極少。

隨著肉牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因長(zhǎng)途運(yùn)輸所致的肉牛呼吸道綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)時(shí)有發(fā)生，給肉牛養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因?qū)е略摬〉牟≡N類繁多，防控難度加大，深入研究其繼發(fā)或伴發(fā)感染細(xì)菌的生物特性利于提高對(duì)發(fā)生BRDC的新認(rèn)識(shí)。2018年來(lái)，我們多次從發(fā)生BRDC且病情反復(fù)的病牛鼻拭子中分離到不動(dòng)桿菌，包括有鮑曼不動(dòng)桿菌、皮特不動(dòng)桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌等，本文對(duì)5株皮特不動(dòng)桿菌的分離情況、生化特性、16S rDNA和基因序列同源性分析及多位點(diǎn)序列分型(MLST)進(jìn)行了研究，以期對(duì)該菌的生物特性有新的認(rèn)識(shí)，為臨床皮特不動(dòng)桿菌感染的重視和用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

皮特不動(dòng)桿菌分離自2018年7月四川南充(ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6和ZZCNC1807-7)、宜賓(ZZCJL1807-8)、什邡(ZZCSF1807-9)等地發(fā)生呼吸道疾病肉牛的鼻腔拭子。發(fā)病牛表現(xiàn)有體溫升高(達(dá)41℃)、流鼻液、呼吸困難、口有泡沫、部分牛有口腔潰瘍等癥狀，但蹄部、關(guān)節(jié)等無(wú)異常，有阿莫西林、青霉素、頭孢喹肟、氟苯尼考、替米考星、板藍(lán)根等用藥史，但病情總是反復(fù)。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)、革蘭氏染色液、血液瓊脂基礎(chǔ)(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；微量生化管(杭州微生物試劑有限公司)；瓊脂粉、GoldView Ⅰ核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)；細(xì)菌基因組提取試劑盒、DL 2000 DNA Marker(天根生化科技北京有限公司)；Premix Taq(寶生物工程大連有限公司)。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)[18]設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rDNA基因通用引物和引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，稀釋至10 μmol·L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)用引物序列

1.4 細(xì)菌的培養(yǎng)特性

將5株皮特不動(dòng)桿菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。再分別劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、兔血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況；并挑取單個(gè)菌落涂片、革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.5 生化特性

對(duì)菌株進(jìn)行氧化酶、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、側(cè)金盞花醇、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、硫化氫、吲哚、MR-VP和明膠等生化試驗(yàn)。依據(jù)細(xì)菌微量生化管說(shuō)明書判定生化試驗(yàn)結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行結(jié)果分析。

1.6 16S rDNA和gyrB序列擴(kuò)增及遺傳進(jìn)化分析

提取菌株的基因組DNA，進(jìn)行16S rDNA和基因序列擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和進(jìn)行同源性分析。

1.7 MLST分型

參照文獻(xiàn)[21-22]，根據(jù)MLST(Pasteur)數(shù)據(jù)庫(kù)公布的7個(gè)看家基因(60、、、、、、)的引物序列對(duì)分離細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將所得序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)行序列型(sequencetype，ST)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 革蘭氏染色形態(tài)

5株皮特不動(dòng)桿菌菌體形態(tài)相似，均為球桿狀的革蘭氏陰性菌(圖1)。

圖示A、B、C、D、E分別代表菌株ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8、ZZCSF1807-9。下同。

2.2 菌落形態(tài)觀察

37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，5株菌在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)大小均相似。在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上呈圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、微隆起、不透明的白色菌落(圖2 A1-E1)；在血平板上培養(yǎng)均無(wú)溶血現(xiàn)象，菌落呈白色圓形，邊緣半透明(圖2 A2-E2)；在麥康凱培養(yǎng)基上呈圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、微隆起、不透明的淡橘色菌落(圖2 A3-E3)；在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上呈圓形、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、微隆起、不透明的淡紫色菌落(圖2 A4-E4)。

圖示1、2、3、4分別代表各菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

2.3 生化試驗(yàn)結(jié)果

5株菌的氧化酶、覃糖、血清菊糖、側(cè)金盞花醇、水楊素、硝酸鹽還原、苯丙氨酸、七葉苷、吲哚、硫化氫、明膠和VP試驗(yàn)均為陰性；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、DNA酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧、動(dòng)力試驗(yàn)均為陽(yáng)性。各菌株間比較發(fā)現(xiàn)，部分菌株的部分生化特性與其他菌株完全不同，表現(xiàn)在ZZCNC1807-6蔗糖、甘露醇、丙二酸鹽、MR試驗(yàn)為陽(yáng)性；ZZCNC1807-7的乳糖、蔗糖、丙二酸鹽、甘露醇試驗(yàn)為陽(yáng)性；ZZCSF1807-9的枸櫞酸鹽、精氨酸雙水解試驗(yàn)為陽(yáng)性，丙二酸鹽試驗(yàn)為陰性；ZZCNC1807-4和ZZCJL1807-8的生化特性完全一致。綜上可見(jiàn)，來(lái)自于牛源的5株菌表現(xiàn)出4種不同的生化類型，其中ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCSF1807-9的部分生化特性如乳糖、MR試驗(yàn)、枸櫞酸鹽、精氨酸雙水解試驗(yàn)等發(fā)生了變化(表2)。

表2 部分生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 菌株16S rDNA序列分析

5株菌的16S rDNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為1 500 bp(圖3)，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，與皮特不動(dòng)桿菌的同源性為99%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖4)顯示：5株菌均與皮特不動(dòng)桿菌(NR117930和NR117621)同在一個(gè)分支，表明與皮特不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最近。16S rDNA序列同源性分析結(jié)果(圖5、表3)顯示：5株菌的同源性為100%，均與來(lái)源于血液(人)、太陽(yáng)鳥(niǎo)泄殖腔液皮特不動(dòng)桿菌的同源性為100%，與豇豆源皮特不動(dòng)桿菌的同源性為99.9%，與痰液、城市污水、泥鰍皮特不動(dòng)桿菌的同源性達(dá)99.5%，與麥田、根際土壤、武昌魚(yú)、鰱魚(yú)、白紋伊蚊幼蟲(chóng)源的同源性為90%以上，而與石油污染土壤中分離的皮特不動(dòng)桿菌同源性僅達(dá)81%。

M，DNA 分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，陰性對(duì)照；2～6，ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8、ZZCSF1807-9。下同。

圖4 16S rDNA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5 16S rDNA基因同源性分析

表3 皮特不動(dòng)桿菌的16S rDNA參考序列

2.5 菌株gyrB基因序列分析

5株菌的基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小約為700 bp(圖6)，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，結(jié)果顯示，與皮特不動(dòng)桿菌的同源性為99%。基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖7)顯示：5株菌均與皮特不動(dòng)桿菌(LC102633)聚類在一起，而ZZCSF1807-9與另4株菌并未完全聚集在同一分支。基因序列同源性分析結(jié)果(圖8、表4)顯示：ZZCSF1807-9與另4株菌的同源性僅為97.1%，而其余4株菌之間的同源性為100%；ZZCSF1807-9與澳大利亞(CP042364)、韓國(guó)(CP017938)、馬來(lái)西亞(CP014477)人源皮特不動(dòng)桿菌的同源性分別為99.7%、98.5%、97.4%，另4株菌與其同源性分別為97.4%、97.1%、99.7%；ZZCSF1807-9與河南魚(yú)源(CP035109)皮特不動(dòng)桿菌的同源性為97.9%，另4株菌與其同源性為99.1%；而5株菌與表中其他來(lái)源的皮特不動(dòng)桿菌的同源性均低于50%。根據(jù)上述結(jié)果，可初步將5株菌分為兩類：ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8為一類，ZZCSF1807-9為另一類。

圖6 分離菌株gyrB序列PCR擴(kuò)增

圖7 gyrB基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖8 gyrB基因同源性分析

表4 皮特不動(dòng)桿菌的gyrB參考序列

2.6 MLST分型

將上述7個(gè)管家基因PCR產(chǎn)物交由上海生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)整理后上傳MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，再將5株菌與其他ST型菌株進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示(圖9)，菌株ZZCSF1807-9為ST214型，其余4株菌分型結(jié)果一致，與ST321型最為接近。

圖9 MLST聚類分析結(jié)果

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，不動(dòng)桿菌感染發(fā)病率呈一個(gè)全球季節(jié)性模式，發(fā)病率峰值出現(xiàn)在夏季/溫暖月份，而低谷出現(xiàn)在冬季/寒冷月份。本實(shí)驗(yàn)中的皮特不動(dòng)桿菌來(lái)源于高溫多雨的夏季從患有呼吸道疾病的肉牛鼻拭子中分離得到。通過(guò)對(duì)5株菌進(jìn)行菌體形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化特性研究，以及16S rDNA和基因序列聚類等研究發(fā)現(xiàn)，該5株菌的菌體形態(tài)和培養(yǎng)特性與大部分不動(dòng)桿菌一致。將生化結(jié)果與不同來(lái)源菌株之間比較顯示，來(lái)自患呼吸道疾病肉牛的5株皮特不動(dòng)桿菌和印度淡水魚(yú)源皮特不動(dòng)桿菌均可以利用葡萄糖和阿拉伯糖，而Li等報(bào)道的3株武昌魚(yú)源皮特不動(dòng)桿菌的葡萄糖和阿拉伯糖試驗(yàn)均為陰性；5株來(lái)自肉牛呼吸道的皮特不動(dòng)桿菌與武昌魚(yú)源菌株的賴氨酸脫羧酶均為陽(yáng)性，而印度淡水魚(yú)源皮特不動(dòng)桿菌為陰性。同時(shí)，5株分離菌之間比較發(fā)現(xiàn)，ZZCSF1807-9與其余4株菌的部分生化特性存在不同。其中，ZZCSF1807-9的枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性、丙二酸鹽為陰性，而另4株菌枸櫞酸鹽為陰性、丙二酸鹽為陽(yáng)性；且菌株ZZCSF1807-9的精氨酸雙水解試驗(yàn)結(jié)果與引起武昌魚(yú)發(fā)生敗血癥死亡的皮特不動(dòng)桿菌一致，為陰性，而另4株菌為陽(yáng)性。這可能因生活環(huán)境的不同，部分菌株為增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)力而導(dǎo)致細(xì)胞壁增厚，阻礙了某些酶的分泌，使其生化反應(yīng)發(fā)生改變。

因皮特不動(dòng)桿菌與醋酸鈣-鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合體中的其他成員的基因組和表型特征非常接近，16S rDNA基因序列的多態(tài)性不足以將其完全區(qū)分開(kāi)，因此進(jìn)一步對(duì)5株菌進(jìn)行了基因序列分析和MLST分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZZCSF1807-9與其余4株菌存在進(jìn)化距離，同源性僅為97.1%。同時(shí)，將5株菌與其它來(lái)源的皮特不動(dòng)桿菌進(jìn)行同源性分析顯示，ZZCSF1807-9與人源皮特不動(dòng)桿菌之間的同源性較高，為99.7%；而其余4株菌與分離自患病魚(yú)類皮特不動(dòng)桿菌的同源性較高，為99.1%。MLST分型結(jié)果顯示，ZZCSF1807-9為ST214型，與2012年和2017年院內(nèi)病人痰液、尿液分離株為同一型；其余4株與ST321型最為接近，而目前報(bào)道的ST321型分離株主要來(lái)自院內(nèi)病人的血液和下呼吸道。但該5株菌的MLST型均與被報(bào)道可能為引起魚(yú)類感染的優(yōu)勢(shì)菌株ST839型皮特不動(dòng)桿菌不同。上述情況發(fā)生可能因宿主不同或地域環(huán)境差異，以及抗菌藥物的大量使用，而導(dǎo)致不同來(lái)源菌株的基因發(fā)生改變。

綜上可見(jiàn)，牛源皮特不動(dòng)桿菌在部分生化特性表型(如葡萄糖、阿拉伯糖、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽和精氨酸雙水解等)和基因以及MLST分型出現(xiàn)了變化；揭示了在不同地域或養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境的影響下，皮特不動(dòng)桿菌的生化特性以及毒力強(qiáng)弱會(huì)發(fā)生一些適應(yīng)性的變化。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為探究該養(yǎng)殖場(chǎng)皮特不動(dòng)桿菌的感染來(lái)源及其傳播途徑提供一定的參考，然而關(guān)于該菌是否與肉牛呼吸道疾病的發(fā)生有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。