HLA-DQB2基因多態(tài)性與中國西部人群抗結(jié)核藥物致肝損傷的關(guān)聯(lián)性研究

江 碩,趙珍珍,周 娟,應(yīng)斌武

四川大學(xué)華西醫(yī)院實驗醫(yī)學(xué)科,四川成都 610000

結(jié)核病是威脅人類健康的全球流行性疾病，中國作為高結(jié)核病負(fù)擔(dān)國，控制結(jié)核病發(fā)病率，降低致殘率及致死率尤為重要。抗結(jié)核藥物致肝損傷(ATDH)是抗結(jié)核藥物治療期間出現(xiàn)的嚴(yán)重不良反應(yīng)，將導(dǎo)致患者治療效果不佳、治療中斷，極大地增加患者的致殘率和病死率[1]。目前臨床治療結(jié)核病的一線藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇及鏈霉素，根據(jù)地域及納入排除標(biāo)準(zhǔn)不同，2%～28%的患者可出現(xiàn)ATDH[2]。目前關(guān)于ATDH遺傳危險因素的研究主要集中于藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運蛋白，包括細胞色素P450家族2E1(CYP2E1)、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶-2(NAT2)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶[谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶mu1(GSTM1)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶β1(GSTT1)]和SLCO1A2[3-4]。研究表明，先天性及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)參與是導(dǎo)致藥物致肝損傷后肝細胞死亡的原因之一，細胞凋亡過程中細胞因子及CD4+T細胞被免疫反應(yīng)激活，對肝細胞產(chǎn)生殺傷作用，參與反應(yīng)的活化T細胞主要受主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類及Ⅱ類分子調(diào)控[5-6]。人類白細胞抗原(HLA)是機體免疫反應(yīng)的重要組成部分，有研究報道HLA基因多態(tài)性與藥物致肝損傷的發(fā)生密切相關(guān)[7-8]。目前，較少有研究報道人類白細胞抗原DQB2(HLA-DQB2)與ATDH發(fā)生有關(guān)，本研究旨在探討中國西部漢族人群HLA-DQB2基因多態(tài)性與ATDH發(fā)生、發(fā)展之間可能存在的關(guān)聯(lián)，以期為臨床醫(yī)生監(jiān)測患者肝毒性并預(yù)測ATDH的發(fā)生提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究中使用的所有樣品均來自本院實驗醫(yī)學(xué)科“結(jié)核病研究”資源生物庫。共納入2016年12月至2018年4月本院1 060例高度懷疑為結(jié)核病的患者。試驗開始前，均獲得患者及家屬知情同意。所有受試者均接受6～8個月一線抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療。方案包含兩個連續(xù)階段：第1階段為開始治療的前2個月，使用異煙肼(300 mg/d)、利福平(600 mg/d，若體質(zhì)量<50 kg)、吡嗪酰胺(1 500 mg/d)和乙胺丁醇(750 mg/d)；第2階段(后4個月)使用相同劑量的異煙肼、利福平和乙胺丁醇進行繼續(xù)治療。剔除依從性差、失訪和轉(zhuǎn)用二線藥物的患者后，共納入746例結(jié)核病患者，其中包括118例ATDH患者(ATDH組)和628例非ATDH受試者(非ATDH組)。根據(jù)結(jié)核病指南[9]，所有患者均通過臨床癥狀、微生物和(或)影像學(xué)證據(jù)等進行結(jié)核病確認(rèn)。本研究得到了本院臨床試驗和生物醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2ATDH診斷標(biāo)準(zhǔn) 本研究納入的所有ATDH病例均符合《美國傳染病學(xué)會臨床實踐指南：藥物敏感結(jié)核病的治療》[10]推薦的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)使用抗結(jié)核藥物治療前患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)均正常；(2)在治療過程中，患者出現(xiàn)血清ALT或AST水平升高，為正常范圍上限(ULN)3倍(120 IU/L)及以上，并伴有肝炎癥狀及體征，如惡心、發(fā)熱、黃疸、嘔吐及腹痛，或血清AST或ALT水平為ULN 5倍(150 IU/L)及以上；(3)血清ALP水平為ULN 2倍(80 IU/L)及以上，且伴血清GGT水平升高；(4)血清ALT、AST或ALP水平升高為ULN 3倍(120 IU/L)及以上，同時伴有血清TBIL為ULN 2倍(56 μmol/L)及以上，但沒有肝炎癥狀或不符合吉爾伯特綜合征診斷。

1.3方法

1.3.1臨床資料收集 通過電子病歷系統(tǒng)收集患者所有數(shù)據(jù)，包括人口統(tǒng)計學(xué)資料、常見臨床癥狀(發(fā)熱、體質(zhì)量減輕、盜汗、食欲不振、乏力等)及實驗室指標(biāo)。實驗方案要求本研究的所有參與者在接受抗結(jié)核治療后的前2月每2周進行1次臨床實驗室血液檢測，后4個月每月檢測1次直到治療結(jié)束。此外，還叮囑患者注意肝毒性癥狀及體征，包括黃疸、惡心、嘔吐、腹脹、腹痛等，臨床醫(yī)生負(fù)責(zé)鑒別相關(guān)癥狀并進行實驗室血液檢查，記錄與肝損傷相關(guān)的實驗室指標(biāo)，以評估ATDH。

1.3.2候選基因多態(tài)性選擇及基因分型 HLA-DQB2基因變異數(shù)據(jù)來自dbSNP數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)，根據(jù)以下規(guī)則：(1)中國北京漢族人群的次要等位基因頻率(MAF)為0.05或以上；(2)排除連鎖不平衡≥97%的單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)。本研究最終選擇了6個SNPs(rs2395253、rs11759423、rs1573646、rs6902723、rs35439528、rs6925976)。

每例患者采集3 mL EDTA抗凝全血，采用德國Qiagen公司提供的QIAamp DNA Blood Mini Kit核酸提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒操作指南進行DNA提取。使用定制的48-Plex SNPscanTMKit(上海天昊生物科技公司)試劑盒進行SNPs基因分型。為保證基因分型質(zhì)量，隨機抽取所有標(biāo)本的10%進行重復(fù)基因分型。

2 結(jié) 果

2.1患者臨床特征與實驗室指標(biāo) 本研究共納入746例患者，均為漢族。本研究中ATDH的發(fā)生率為15.82%(118/746)。ATDH組和非ATDH組的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、乙型或丙型肝炎病毒感染情況、保肝藥物的使用率、吸煙情況等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ATDH組中104例患者為首次接受抗結(jié)核治療，均未使用過保肝藥物。受試者的全身癥狀中發(fā)熱和體質(zhì)量減輕患者所占比例在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ATDH組患者ALT、AST、ALP、GGT、TBIL水平明顯高于非ATDH組患者(P<0.05)。 見表1～2。

表1 研究對象的一般資料

表2 研究對象臨床特征及實驗室結(jié)果

2.2HLA-DQB2基因多態(tài)性與ATDH易感性分析

2.2.1基因分型結(jié)果 將SNPs位點分型不成功的部分研究對象剔除后，最終納入分析的rs1573646、rs2395253、rs6902723、rs11759423、rs35439528、rs6925976位點的ATDH組例數(shù)分別為115、117、118、116、116、117例，非ATDH組的最終分析例數(shù)為618、627、628、628、628、628例。表3中詳細列出各SNPs信息，HLA-DQB2基因型分布中非ATDH患者SNPs均未偏離HWE平衡(所有位點P>0.05)。

表3 HLA-DQB2基因的一般特征

2.2.2SNPs等位基因和基因型分析 在納入分析的6個SNPs位點中，rs1573646的等位基因頻率分布及基因型頻率分布在兩組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。rs1573646 A等位基因攜帶者相對于C等位基因攜帶者，可能潛在性地增加了ATDH發(fā)生風(fēng)險(OR=1.369，95%CI1.002～1.871，P<0.05)。兩組間HLA-DQB2基因6個SNPs的等位基因和基因型分布見表4。

表4 HLA-DQB2 等位基因、基因型在兩組間分布情況

為進一步探討兩組間HLA-DQB2基因多態(tài)性分布在遺傳水平上的差異，本研究構(gòu)建了加性、顯性和隱性遺傳模型進行分析，分析結(jié)果見表5。隱性模型顯示，rs1573646 AA基因型相較于AC/CC基因型具有較高的ATDH發(fā)生風(fēng)險(OR=2.227，95%CI1.183～4.190，P=0.013)；rs6902723 GG基因型相較于GA/AA基因型具有較高的ATDH發(fā)生風(fēng)險(OR=2.184，95%CI1.163～4.099，P=0.015)。經(jīng)Bonferroni校正后，發(fā)現(xiàn)攜帶rs1573646和rs6902723的患者在隱性模型中與ATDH發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)，剩余的HLA-DQB2基因的4個SNPs在加性、顯性、隱性遺傳模型，以及單倍體分析中均未發(fā)現(xiàn)ADTH發(fā)生風(fēng)險差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2.3單倍體構(gòu)建 本研究進行了連鎖不平衡分析和單倍體構(gòu)建。將成對R2≥0.80視為高度連鎖不平衡。6個SNPs中，除rs6925976外，其余SNPs間存在強連鎖不平衡。本研究在rs1573646和rs6902723中構(gòu)建了單倍型，并分析了兩個單倍型(CA和AG)。兩組中所有單倍體頻率見圖1，結(jié)果顯示rs2395253與rs6902723單倍型分布在ATDH組與非ATDH組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

注：Block代表在這兩個SNPs間構(gòu)建了單倍型；結(jié)果顯示它們是高度相關(guān)的。

3 討 論

ATDH是導(dǎo)致結(jié)核病患者不良預(yù)后的主要原因。長期以來，宿主的遺傳易感性一直被認(rèn)為是藥物不良反應(yīng)出現(xiàn)個體化差異的原因。對HLA-DQB2基因多態(tài)性與抗結(jié)核藥物引起肝損傷易感性的研究有助于ATDH易感基因的發(fā)現(xiàn)和驗證。筆者研究了HLA-DQB2的基因多態(tài)性，探索其是否與漢族人群獲得ATDH具有潛在關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQB2位點rs1573646與ATDH易感性有潛在關(guān)系，其他位點無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

HLA-DQB2屬于HLA Ⅱ類B鏈旁系同源物家族，位于人類6號染色體(6q21.32,32741391-32838770)，是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過呈遞源自細胞外蛋白的肽類在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮核心作用。結(jié)核病是一種與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的疾病，與其他藥物致肝損傷相比，免疫系統(tǒng)可能在ATDH中發(fā)揮獨特的作用。有研究表明，HLA-DR+CD4+T細胞可能通過拮抗輔助性T細胞介導(dǎo)的機體對結(jié)核分枝桿菌的特異性免疫而導(dǎo)致疾病相關(guān)炎癥[11]。HLA單倍型關(guān)聯(lián)表明，藥物導(dǎo)致的肝損傷與適應(yīng)性免疫反應(yīng)的遺傳易感性以及藥物及其代謝物相關(guān)的抗原呈遞和識別有關(guān)[12]。一項全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)，由HLA參與的適應(yīng)性免疫反應(yīng)被激活可能是藥物致肝損傷的發(fā)病原因，證明HLA多態(tài)性與藥物致肝損傷的發(fā)生有相關(guān)性[13]。阿莫西林-克拉維酸誘導(dǎo)的肝損傷與HLA-DQA1*01∶01、HLA-DQB1*05∶01和HLA-DRB1*15∶01的等位基因變異密切相關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)攜帶相關(guān)基因的患者與未攜帶者相比，服用阿莫西林-克拉維酸后發(fā)生肝毒性的風(fēng)險可增高 10～80倍。HLA-B57*01基因多態(tài)性被證明與氟氯西林引起的肝損傷有關(guān)[14]。還有研究報道，在東南亞人群中，卡馬西平引起的藥物性肝損傷與攜帶HLA-B*15∶02的患者密切相關(guān)[15]。HLA-DRB1*16∶01、HLA-DQB1*05∶02基因攜帶者使用氟西丁治療后發(fā)生藥物致肝損傷風(fēng)險增加[16]。

HLA-DQB2表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在HLAⅡ類抗原分子中出現(xiàn)[17]，HLAⅡ類分子可將抗原肽呈遞給CD4+T細胞。當(dāng)藥物本身或異常藥物代謝物進入肝臟、激活肝臟樹突狀細胞后，形成藥物修飾肽-HLA膜分子，引起損傷相關(guān)分子釋放，使樹突狀細胞表面膜表型改變，在B7分子及趨化因子受體CCR7等因子參與下，成為成熟的抗原呈遞分子，進入全身血液循環(huán)，激活更多CD4+T細胞進入肝臟[18]。最終進入肝臟中的具有活化效應(yīng)的T細胞通過氧化應(yīng)激、免疫反應(yīng)等不同機制導(dǎo)致肝損傷，包括產(chǎn)生多種類型的CD4+T細胞，例如：促炎細胞因子[干擾素(IFN)-γ、白細胞介素(IL)-17等]及促過敏的細胞因子(IL-4、IL-5、IL-13等)，同時激活CD8+T細胞對含有穿孔素和顆粒酶的顆粒進行胞吐作用或產(chǎn)生由FasL介導(dǎo)的CD4+和CD8+T細胞的殺傷作用，引起肝細胞損傷[19]。本研究中，HLA-DQB2基因SNPs位點rs1573646 A等位基因攜帶者在接受抗結(jié)核藥物治療后表現(xiàn)出ATDH發(fā)生風(fēng)險的增加，可能原因為抗結(jié)核藥物或其代謝產(chǎn)物在肝臟中與HLA-DQB2基因SNPs位點rs1573646 A等位基因的肽進行了優(yōu)先關(guān)聯(lián)，改變其抗原肽的HLA結(jié)合位點，導(dǎo)致呈遞的抗原肽的所有成分發(fā)生改變，最終引起肝臟損傷[20]。

在ATDH的研究中，多項研究發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1*02∶01、HLA-DQB1*05∶02、HLA-DQA1*01∶02、HLA-DRB1*03的基因多態(tài)性與發(fā)生ATDH的風(fēng)險密切相關(guān)[7-8]。KIM等[21]發(fā)現(xiàn)攜帶HLA-CW*0401基因人群與抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)綜合征(HSS)具有相關(guān)性。根據(jù)以上證據(jù)，推測HLA-DQB2基因多態(tài)性可能與ATDH的發(fā)生風(fēng)險有關(guān)。本研究顯示，SNPs rs1573646、rs6902723可能與ATDH發(fā)生風(fēng)險增加有潛在關(guān)聯(lián)。選定的余下4個HLA-DQB2基因SNPs位點(rs2395253、rs11759423、rs35439528、rs6925976)經(jīng)過等位基因頻率、基因型分布，以及3種遺傳模型分析，發(fā)現(xiàn)兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

本研究有以下不足：(1)納入的樣本量有限，本研究僅招募了118例患者，沒有進一步將ATDH患者細分為肝細胞亞組、膽汁淤積亞組和混合亞組。(2)單基因多態(tài)性對ATDH的發(fā)生、發(fā)展影響有限，仍需進一步探討更多HLA相關(guān)基因及環(huán)境等客觀因素與ATDH發(fā)生的關(guān)系。ATDH是一種嚴(yán)重且復(fù)雜的藥物不良反應(yīng)，涉及多個器官及不同機制。由感染、炎癥或其他氧化應(yīng)激引起的復(fù)雜應(yīng)激反應(yīng)可能共同刺激免疫反應(yīng)并引發(fā)由免疫介導(dǎo)的肝細胞死亡[5,22]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SNPs rs1573646、rs6902723可能與ATDH的發(fā)生風(fēng)險增加有潛在關(guān)系，余下4個HLA-DQB2基因SNPs位點(rs2395253、rs11759423、rs35439528、rs6925976)沒有發(fā)現(xiàn)與ATDH的發(fā)生、發(fā)展在統(tǒng)計學(xué)分析中具有的關(guān)聯(lián)。關(guān)于HLA-DQB2基因與ATDH的發(fā)生、發(fā)展研究仍需繼續(xù)探討。