樟葉越桔熱激蛋白基因?qū)囟让{迫的響應(yīng)表達(dá)

李 雪，邵亞林，陳海濤，趙 平，丁 勇

（西南林業(yè)大學(xué) a.云南省高校林木生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；b.西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)與草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

當(dāng)生物在自然生長過程中遭受外界刺激如溫度脅迫后其機(jī)體會(huì)發(fā)生響應(yīng)、啟動(dòng)保護(hù)防御機(jī)制，而熱激蛋白（Heat shock protein,HSP）則在這一過程中扮演重要角色[1]。多年生木本植物樟葉越桔Vaccinium dunalianum隸屬于杜鵑花科Ericaceae 越桔屬Vaccinium，主要分布于我國西南地區(qū)，國外常見于東南亞等地區(qū)[2]，目前對(duì)該植物的利用僅見于我國云南地區(qū)，其鮮嫩葉芽在云南彝族民間可作為保健茶飲用，具祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)等功效[3]，同時(shí)植物體內(nèi)富含的熊果苷及其衍生物類活性物質(zhì)CA 具有生產(chǎn)天然美白活性劑的潛在價(jià)值[4]。樟葉越桔生長適宜溫度為（23±2）℃，受全球氣候變化影響而產(chǎn)生的局部極端高溫（35～40℃）或低溫（-10～4℃）等惡劣環(huán)境[5]對(duì)當(dāng)?shù)卣寥~越桔植物造成了逆境脅迫，這在一定程度上也影響了樟葉越桔野生資源的存量。目前，關(guān)于樟葉越桔HSP 及其基因的研究仍處于空白，因此開展樟葉越桔HSP基因在溫度脅迫下的表達(dá)模式研究，闡明HSP 在樟葉越桔響應(yīng)溫度脅迫過程中的生物學(xué)功能和抵抗逆境的分子機(jī)制具有重要意義。

HSP 在生物體內(nèi)廣泛存在，主要參與生物體相關(guān)蛋白質(zhì)的折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，用于維持蛋白質(zhì)構(gòu)象和功能的穩(wěn)定[6]。通常將其分為5 個(gè)家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60 和sHSP，在細(xì)胞質(zhì)、線粒體和葉綠體中均發(fā)現(xiàn)有定位，而HSP90、HSP70 和sHSP 還發(fā)現(xiàn)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[7]。近年來關(guān)于熱激蛋白及其相關(guān)基因參與逆境調(diào)控的研究已是熱點(diǎn)話題，且主要集中在HSP90、HSP70 和sHSP 方面。研究表明植物中HSP90 主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期控制、蛋白質(zhì)的降解和運(yùn)輸[8]，在植物生長發(fā)育和抗逆境的調(diào)節(jié)和應(yīng)答等過程中也發(fā)揮著重要作用[9]。HSP70 作為分布較廣泛、系統(tǒng)進(jìn)化較保守的一類熱激蛋白，發(fā)揮多項(xiàng)生理功能，如協(xié)助胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)[10]、參與免疫物質(zhì)的形成和分解[11]等。sHSP 是一類普遍存在于植物中的小分子熱激蛋白，其主要功能是與HSP70 或HSP100 等熱激蛋白一起作為分子伴侶，從而使細(xì)胞行使正常的功能，sHSP 不僅存在于植物不同生長時(shí)期，而且在溫度、干旱和鹽脅迫等逆境中高度表達(dá)[12]。

本試驗(yàn)根據(jù)課題組前期研究成果[13-14]，從樟葉越桔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中（NCBI 登錄號(hào)：PRJNA285946）篩選獲得VdHSP90、VdHSP70、VdsHSP熱激蛋白基因和VdARP、VdGAPDH、VdEF-1α候選內(nèi)參基因cDNA 序列，以樟葉越桔成熟葉片為試驗(yàn)材料，利用RT-qPCR 技術(shù)并結(jié)合軟件BestKeeper、GeNorm、Normfinder 和RefFinder 綜合分析3 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，應(yīng)用穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因?yàn)閷?duì)照計(jì)算3 個(gè)熱激蛋白基因在不同溫度（4、25 和35℃）和不同處理時(shí)間（1、5、10 和15 d）下的相對(duì)表達(dá)量，分析樟葉越桔中HSP基因響應(yīng)不同溫度的表達(dá)模式，為后續(xù)揭示樟葉越桔HSP相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物在樟葉越桔響應(yīng)溫度脅迫過程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及試驗(yàn)處理

植物材料樟葉越桔Vaccinium dunalianumWight 為繁育于大棚內(nèi)的2年生扦插苗，選取長勢(shì)一致生長良好的苗木104 株于人工氣候室中培養(yǎng)2 周，培養(yǎng)條件為：溫度25℃，相對(duì)濕度60.0%，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1，期間適時(shí)澆水。隨機(jī)取以上預(yù)處理后的8 株苗木為試驗(yàn)對(duì)照組CK，將剩余苗木分別進(jìn)行4、25 和35℃試驗(yàn)處理1、5、10 和15 d，各組8 株，人工氣候室其他環(huán)境條件同上。取樣時(shí)（8:00—9:00）選取8 株苗木相同部位（形態(tài)學(xué)上端至形態(tài)學(xué)下端第4～5 片葉）并做混合處理，13 個(gè)葉片組織樣本在液氮中速凍后保存于-80℃冰箱，用于總RNA 提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA 提取及cDNA 第一鏈合成

試驗(yàn)樣本總RNA 采用康為世紀(jì)生物科技有限公司的OminiPlant RNA Kit(DNase I)試劑盒提取，1%瓊脂糖凝膠電泳后成像儀（Bio-rad Universal Hood Ⅱ）觀察完整性，微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀NanoDrop 2000(Thermo Scientific ? NanoDrop ?)檢測(cè)純度。cDNA 第一鏈的合成采用寶生物工程（大連）有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript ?RT reagent Kit with gDNA Eraser）完成。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

從樟葉越桔轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（NCBI 登錄號(hào)：PRJNA285946）中分析篩選獲得3 個(gè)候選內(nèi)參基因（VdARP、VdGAPDH、VdEF-1α）和3 個(gè)熱激蛋白基因（VdHSP90、VdHSP70、VdsHSP） cDNA 序列，利用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物（表1），并送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 相關(guān)基因序列和引物信息Table 1 Primer sequences information of candidate reference genes and target genes

1.2.3 RT-qPCR 擴(kuò)增

取TB Green Premix Ex Taq II 12.5 μL、cDNA模板2.0 μL、正反引物各1.0 μL、ddH2O 8.5 μL，建立25 μL 的RT-qPCR 反應(yīng)體系；RT-qPCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s、56℃退火30 s、72℃延伸30 s（共40 個(gè)循環(huán)），之后溶解階段反應(yīng)溫度由65℃緩慢升至95℃，升溫速度為0.5℃/5 s。每個(gè)樣本每個(gè)基因3 次重復(fù)，同時(shí)以滅菌超純水代替cDNA 模板作為陰性對(duì)照。以CK樣品組的RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果分析內(nèi)參基因和目的基因引物的特異性。

1.2.4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性篩選分析

分別利用BestKeeper、GeNorm和Normfinder[15]軟件對(duì)所選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析，最后使用RefFinder[16]軟件對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。其中，BestKeeper 分析時(shí)利用Ct 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），當(dāng)SD值越小，表明該基因穩(wěn)定性越好，當(dāng)SD值大于1 時(shí)，說明該基因穩(wěn)定性較差[17]。GeNorm 和Normfinder 分析時(shí)需要將對(duì)應(yīng)的Ct 值轉(zhuǎn)換為相對(duì)表達(dá)量Q 值[18]；GeNorm分析是根據(jù)穩(wěn)定性指數(shù)（M），M值越小越穩(wěn)定，且M值不大于1.5[19]；而NormFinder 分析是通過穩(wěn)定值（S）進(jìn)行評(píng)價(jià)，S值越小，說明該內(nèi)參基因穩(wěn)定性越高[20]。RefFinder 分析則是整合上述3種分析方法得出綜合值，綜合值越小，表明內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好。

1.2.5 目的基因表達(dá)分析

RT-qPCR 試驗(yàn)數(shù)據(jù)中，以VdARP基因?yàn)閮?nèi)參，以CK 處理組為對(duì)照，采用2-△△Ct方法[21]分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量，后續(xù)數(shù)據(jù)通過SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用鄧肯氏極差法進(jìn)行差異顯著性檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 提取

本試驗(yàn)中13個(gè)樟葉越桔樣本總RNA電泳結(jié)果如圖1所示，顯示清晰且較為完整的28 S 和18 S rRNA兩條帶，濃度范圍處于178.5～682.5 ng/μL 之間，A260/A280比值介于1.8～2.2（表2），表明提取的總RNA 質(zhì)量較高，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)。

表2 樟葉越桔葉片總 RNA 的純度和濃度測(cè)定結(jié)果Table 2 Purity and concentration of total RNA in leaves of Vaccinium dunalianum

圖1 不同溫度處理下樟葉越桔葉片總RNAFig.1 The electrophoretogram of total RNA from V.dunalianum leaves under different temperature treatments

M：DL 2000 Marker；1：35℃ 1 d 處理；2：35℃ 5 d 處理；3：35℃ 10 d 處理；4：35℃ 15 d 處理；5：4℃ 1 d 處理；6：4℃ 5 d 處理；7：4℃ 10 d處理；8；4℃ 15 d 處理；9：25℃ 0 d 處理；10：25℃ 1 d 處理；11：25℃ 5 d 處理；12：25℃ 10 d處理；13：25℃ 15 d 處理。

2.2 內(nèi)參基因和目的基因引物特異性檢測(cè)

通過將提取的總RNA（標(biāo)準(zhǔn)濃度100 ng/μL）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用表1 引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增檢測(cè)內(nèi)參基因和目的基因產(chǎn)物特異性，同時(shí)以cDNA 為模板進(jìn)行RT-qPCR 試驗(yàn)，如圖2 結(jié)果所示，內(nèi)參基因和目的基因?qū)?yīng)的溶解曲線平穩(wěn)，均呈現(xiàn)單一峰型，且每個(gè)基因復(fù)孔之間重復(fù)性好，表明所設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)高，試驗(yàn)結(jié)果可靠性高。

圖2 樟葉越桔內(nèi)參基因和目的基因溶解曲線Fig.2 Melting curves of candidate reference genes and target HSP genes of V.dunalianum

2.3 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

根據(jù)內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件BestKeeper、GeNorm、Normfinder 和RefFinder 對(duì)所選內(nèi)參基因篩選的結(jié)果如表3所示，候選的3 個(gè)樟葉越桔內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性高低順序用BestKeeper 軟件分析顯示VdEF-1α＞VdGAPDH＞VdARP，用GeNorm 軟件分析顯示VdARP=VdGAPDH＞VdEF-1α，用NormFinder 軟件分析顯示VdARP＞VdGAPDH＞VdEF-1α， 通過RefFinder 綜合分析可得，3 個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)椋篤dARP＞VdGAPDH＞VdEF-1α。因此本試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)將VdARP作為首選內(nèi)參基因，用于標(biāo)定后續(xù)熱激蛋白目的基因的表達(dá)。

表3 不同軟件分析3 個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 3 Expression stability analysis of three candidate reference genes by different softwares

2.4 目的基因的表達(dá)分析

2.4.1 VdHSP90基因的表達(dá)分析

選擇上述VdARP作為內(nèi)參基因反映VdHSP90基因的表達(dá)情況，由圖3 可以看出，每個(gè)樣本中VdHSP90基因均有表達(dá)。25 ℃各處理組中VdHSP90基因表達(dá)量相比CK 組均顯著上調(diào)（P＜0.05），但除1 d 外，其他（5、10 和15 d）處理組的基因表達(dá)量無顯著差異，這表明在正常適溫生長環(huán)境下VdHSP90基因表達(dá)表現(xiàn)出整體趨于穩(wěn)定的變化幅度。VdHSP90基因在4℃各處理組的表達(dá)量相比CK 均顯著增加（P＜0.05），10 d 時(shí)表達(dá)量為最高值，是CK 組的9.0 倍。35℃處理下VdHSP90基因表達(dá)量隨時(shí)間延長先逐漸上升后逐漸下降，除15 d 處理組與CK 無顯著差異外，其他各處理組均顯著高于CK（P＜0.05），5 d 處理組為最高表達(dá)量，為CK 的3.3 倍。在1、5 和10 d 時(shí)，4℃處理VdHSP90基因表達(dá)量均顯著高于25℃和35℃處理組（P＜0.05），15 d 時(shí)4℃處理VdHSP90基因表達(dá)量與25℃處理組無顯著差異、但仍顯著高于35℃處理組（P＜0.05）；35℃處理VdHSP90基因表達(dá)量在5 和10 d 時(shí)分別顯著高于25℃處理（P＜0.05），但在1 和15 d時(shí)卻分別顯著低于25℃處理（P＜0.05）。表明VdHSP90基因?qū)?℃零上低溫的響應(yīng)表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)35℃高溫和25℃適溫。

圖3 不同溫度處理下VdHSP90基因的表達(dá)分析Fig.3 The expression analysis of VdHSP90 gene under different temperature treatments

2.4.2 VdHSP70基因的表達(dá)分析

VdHSP70基因表達(dá)在試驗(yàn)各樣本中均能檢測(cè)到，在25℃處理下，除1 d 處理組表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)外，其他時(shí)間處理組無顯著差異，表現(xiàn)出基因表達(dá)調(diào)控的動(dòng)態(tài)平衡（圖4）。4℃處理不同時(shí)間的VdHSP70基因表達(dá)量先持續(xù)顯著上升，10 d時(shí)達(dá)到最大值、為CK 的13.2 倍，15 d 時(shí)又急劇下降，但仍顯著高于CK（P＜0.05）；且4℃處理VdHSP70基因表達(dá)量顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的25℃和35℃處理組（P＜0.05），表明VdHSP70基因響應(yīng)4℃零上低溫的上調(diào)表達(dá)劇烈，其表達(dá)特征類似于VdHSP90基因。35℃處理下VdHSP70基因表達(dá)量表現(xiàn)出類似于4℃處理組的先持續(xù)顯著上升后急劇下降的變化規(guī)律，10 d 時(shí)達(dá)到最大值、為CK的2.8倍，15 d時(shí)急劇下降至CK組表達(dá)水平，表明VdHSP70基因?qū)?5℃高溫脅迫也表現(xiàn)出積極的上調(diào)響應(yīng)表達(dá)，但上調(diào)表達(dá)幅度要低于其對(duì)4℃低溫脅迫處理的響應(yīng)。

圖4 不同溫度處理下VdHSP70基因的表達(dá)分析Fig.4 The expression analysis of VdHSP70 gene under different temperature treatments

2.4.3 VdsHSP基因的表達(dá)分析

由圖5 可以看出，25℃各處理組的VdsHSP基因表達(dá)量與CK 的無顯著差異，均處于同一表達(dá)水平。4℃各處理組的VdsHSP基因表達(dá)量雖在P＜0.05 水平與CK 的差異性不顯著，但均低于CK，處于較低的表達(dá)水平。35℃各處理組VdsHSP基因表達(dá)量均顯著高于CK（P＜0.05），隨時(shí)間延長，VdsHSP基因表達(dá)量先逐漸上升后下降，10 d時(shí)基因表達(dá)量最高，為CK 的19 倍。VdsHSP基因表達(dá)量在各時(shí)間處理組中均呈現(xiàn)35℃＞25℃＞4℃，且35℃處理組顯著高于其他2 個(gè)處理組（P＜0.05）。表明4℃低溫能抑制VdsHSP基因表達(dá)，35℃高溫誘導(dǎo)VdsHSP基因顯著上調(diào)表達(dá)。

圖5 不同溫度處理下樟葉越桔VdsHSP基因的表達(dá)情況Fig.5 The expression analysis of VdsHSP gene under different temperature treatments

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

通過比較3 個(gè)內(nèi)參基因VdARP、VdGAPDH和VdEF-1α的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選獲得VdARP為不同溫度處理下樟葉越桔葉片組織中其他功能基因表達(dá)研究首選的內(nèi)參基因。VdHSP90和VdHSP70基因表達(dá)量在4℃低溫脅迫處理一定時(shí)間內(nèi)顯著上調(diào)，VdsHSP基因表達(dá)量在35℃高溫處理下顯著上調(diào)，表明VdHSP90和VdHSP70基因?qū)α闵系蜏孛{迫的響應(yīng)表達(dá)劇烈，VdsHSP基因?qū)Ω邷孛{迫的響應(yīng)表達(dá)劇烈。推測(cè)HSP90 和HSP70 蛋白在樟葉越桔植物抵御零上低溫脅迫過程中發(fā)揮重要功能，而sHSP 蛋白則主要參與了樟葉越桔對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)過程。

3.2 討論

RT-qPCR 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于功能基因的表達(dá)分析，試驗(yàn)材料、試驗(yàn)條件、選用相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因等對(duì)于目的基因的表達(dá)顯得尤為重要[22]。ACT、GAPDH和EF-1α等看家基因是較為常見、研究較多的內(nèi)參基因[23]，而肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白（Actin-related protein，ARP）作為內(nèi)參基因的研究鮮有報(bào)道。ARP 和Actin 一樣均屬于生物細(xì)胞的actin 超家族成員，發(fā)揮著重要的細(xì)胞生物學(xué)功能[24]，在一些植物中已被證明是組成型表達(dá)[25]，在樟葉越桔不同組織中的表達(dá)也較穩(wěn)定[13]。本研究應(yīng)用RT-qPCR 技術(shù)比較ARP、GAPDH和EF-1α候選內(nèi)參基因在不同溫度處理下樟葉越桔葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)VdARP基因的表達(dá)穩(wěn)定性均優(yōu)于VdGAPDH和VdEF-1α基因。因此，推測(cè)ARP 有望成為一個(gè)新型內(nèi)參基因在更多生物中得以應(yīng)用。

多數(shù)情況下，熱激蛋白HSPs 是生物體在受到外界非生物脅迫因子的刺激下產(chǎn)生的高度保守的蛋白家族，一方面能降低不良環(huán)境所造成的傷害，另一方面又能提高生物體的耐受能力[26]。研究表明，HSP90、HSP70 和sHSP 家族相關(guān)基因在生物抗逆境過程發(fā)揮積極作用。Liu 等[27]發(fā)現(xiàn)小球藻CvHSP90基因在零上低溫脅迫后表達(dá)水平顯著增加；李慧聰?shù)萚28]研究發(fā)現(xiàn)，玉米熱激蛋白ZmHSP70基因在響應(yīng)溫度脅迫的過程中，4℃冷脅迫能夠誘導(dǎo)ZmHSP70基因表達(dá)量顯著上調(diào)，表明ZmHSP70基因可能在參與抵御環(huán)境脅迫過程中發(fā)揮重要作用；李東賓等[29]運(yùn)用RT-qPCR 技術(shù)分析了鐵皮石斛DoHSP70基因在冷脅迫下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛DoHSP70基因在4℃冷脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)，并且在一定時(shí)間內(nèi)表達(dá)量維持在較高水平。本研究發(fā)現(xiàn)樟葉越桔VdHSP90和VdHSP70基因的表達(dá)量在4℃處理下均顯著上調(diào)，表明VdHSP90和VdHSP70基因?qū)α闵系蜏乩涿{迫響應(yīng)劇烈，再次表明HSP90 和HSP70 蛋白在低溫冷脅迫中發(fā)揮更重要的調(diào)控作用。

sHSP基因則積極參與植物高溫?zé)崦{迫響應(yīng)過程。Jung 等[30]通過RT-qPCR 試驗(yàn)表明水稻OsHSP16.9基因在受到熱刺激后也能夠迅速表達(dá)，此外，在水稻中過表達(dá)OsHSP16.9轉(zhuǎn)基因植物對(duì)逆境脅迫更具有耐受性；陳江飛等[31]研究了茶樹多個(gè)小分子熱激蛋白基因（CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2）在高溫脅迫下的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)小分子熱激蛋白基因在高溫脅迫下表達(dá)量呈爆發(fā)式增加，表明其均參與了茶樹對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)過程。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)樟葉越桔VdsHSP基因在35℃高溫處理后的表達(dá)量顯著增加，且在不同處理時(shí)間內(nèi)均保持高表達(dá)水平，可見sHSP基因在不同植物高溫?zé)崦{迫響應(yīng)中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。而sHSP基因響應(yīng)低溫脅迫的表達(dá)研究卻較少，該研究中4℃處理的VdsHSP基因表達(dá)量低于25℃處理并處于較低水平，表明零上低溫能抑制樟葉越桔植物中sHSP基因表達(dá)，這與辣椒小分子熱激蛋白基因CaHSP24的表達(dá)受到4℃低溫抑制而微量表達(dá)[32]的現(xiàn)象相似，也符合sHSP基因表達(dá)一直以來被認(rèn)為與生物的高溫脅迫密切相關(guān)[33]的觀點(diǎn)。本研究對(duì)樟葉越桔進(jìn)行了不同時(shí)間階段下的不同溫度處理（4、25和35℃），但是溫度設(shè)置點(diǎn)較少，僅考慮了零上低溫、適溫和高溫3 個(gè)溫度點(diǎn)，后期可擴(kuò)大溫度設(shè)置點(diǎn)。其次，材料組織僅為葉片，范圍較窄，將在樟葉越桔其他組織中展開后續(xù)研究。