蘆葦根際對有色溶解性有機質的脫色機理及環(huán)境行為

阿丹 潘袁 黃漢杰 陶雪琴 盧桂寧 杜建軍 鄒夢遙

摘 要：有色溶解性有機質（CDOM）是水體中天然有機質的重要組成成分，它的過量輸入會造成湖泊、水庫等水體的富營養(yǎng)化，甚至直接污染飲用水。植物修復技術具有經(jīng)濟有效、綠色環(huán)保等特點，適用于環(huán)境中CDOM面源污染的控制與治理以及污水處理廠尾水中CDOM的深度凈化。研究植物凈化過程中CDOM的脫色原理及環(huán)境行為，對水環(huán)境保護和飲用水安全具有十分重要的意義。通過CDOM在植物根際中的脫色、分布和組成分析，探究植物對CDOM的脫色性能以及CDOM在根際環(huán)境的分布特征和組成成分;結合植物根系分泌物和酶提取液的脫色實驗，考察根系分泌物和植物酶對CDOM脫色反應的影響機制。結果表明：CDOM難以自然水解，其有效脫色依賴于植物的存在;植物對CDOM的作用方式以根系吸收為主、根表吸附為輔，形成了大部分CDOM以低分子形態(tài)累積在植物體內（92.2%）、少部分CDOM以高分子形態(tài)附著在植物表面（7.7%）的分布特征;植物根系分泌物雖然不能直接影響CDOM的脫色過程，但可以通過改善根際微環(huán)境、促進微生物生長、富集相關降解菌種、改變CDOM生物可利用性等方式來強化根際微生物對根表附著的高分子CDOM的碳源利用能力;經(jīng)生物降解生成的低分子CDOM通過根系吸收進入植物體內，并在植物酶的作用下進一步代謝分解，從而達到植物凈化CDOM的目的。

關鍵詞：有色溶解性有機物;植物修復;根際效應;根系分泌物;酶提取液

中圖分類號：X524?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：2096-6717（2022）03-0119-07

收稿日期：2020-06-16

基金項目：國家自然科學基金（41907293）;廣東省自然科學基金（2019A1515012217）;廣州市科技計劃（201704020187）

作者簡介：阿丹（1985- ），女，博士，副教授，主要從事生物修復研究，E-mail：adan@zhku.edu.cn。

鄒夢遙（通信作者），女，副教授，E-mail：mengyaozou@zhku.edu.cn。

Received：2020-06-16

Foundation items：National Natural Science Foundation of China （No. 41907293）; Natural Science Foundation of Guangdong Province （No. 2019A1515012217）; Science and Technology Plan Project of Guangzhou City （No. 201704020187）

Author brief：A Dan （1985- ）， PhD， associate professor， main research interest： biological remediation， E-mail： adan@zhku.edu.cn.

ZOU Mengyao （corresponding author）， associate professor， E-mail： mengyaozou@zhku.edu.cn.

Decolorization mechanism and environmental behavior of colored dissolved organic matter in the rhizosphere of Phragmites australis

A Dan1， PAN Yuan1， HUANG Hanjie1， TAO Xueqin1， LU Guining2， DU Jianjun1， ZOU Mengyao1

（1. College of Resources and Environment; Engineering and Technology Research Center for Agricultural Land Pollution Integrated Prevention and Control of Guangdong Higher Education Institutes， Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225， P. R. China; 2. School of Environment and Energy; The Key Laboratory of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters， Ministry of Education， South China University of Technology， Guangzhou 510006， P. R. China）

Abstract： Colored dissolved organic matter （CDOM） is an important component of natural organic matter in water. CDOM with high concentrations may cause eutrophication of drinking water sources such as lakes and reservoirs， and even directly pollute municipal tap water. Phytoremediation is regarded as an effective， economical， and ecological technology for the treatment of CDOM non-point pollution， and the purification of CDOM polluted wastewater treatment plant discharge. For the sake of aquatic environmental protection and drinking water safety， it is very necessary to study the decolorization mechanism and environmental behavior of CDOM by plants. In the present study， the decolorization， distribution， and composition of CDOM in the rhizosphere of Phragmites australis were investigated， as well as the influence mechanism of plant root exudates and enzyme extracting solution on the CDOM removal. The results showed that CDOM was difficult to be hydrolyzed， and its effective decolorization depended on the effect of plants. In the rhizosphere， CDOM was mainly removed by plant uptake and supplemented by root adsorption， forming the distribution characteristics that most of the CDOM were accumulated by plants as low molecules （92.2%） and the rest were adhered to root surface as high molecules （7.7%）. Although root exudates cannot directly affect the decolorization process of CDOM， they can enhance the carbon source utilization ability of rhizosphere microbes to the high molecular CDOM， by improving the rhizosphere microenvironment， promoting the microbial growth， enriching the related-degrading bacteria， and changing the CDOM bioavailability. Low molecular CDOM generated by microbial degradation was transported into the plant through root uptake， and then were metabolized under the effect of plant enzymes， so as to achieve the purpose of CDOM purification by plants.

Keywords： chromophoric dissolved organic matter; phytoremediation; rhizosphere effect; root exudate; enzyme extracting solution

有色溶解性有機質（CDOM）是由腐殖酸、富里酸和芳香烴等組成的復雜有機質，也是水體中天然有機質的重要組成成分[1]。CDOM是水生態(tài)系統(tǒng)中重要的碳賦存形式之一，對生物地球化學循環(huán)、能量流動及水質安全有著重要的影響[2-3]。由于自身的吸附性和絡合性，CDOM還是水體中有機污染物和重金屬的重要載體[4-5]，對污染物的歸趨、毒性效應和生物有效性有著深遠影響[6]。CDOM常被用來表征湖泊、水庫等水體的富營養(yǎng)化程度[7]，過量的CDOM輸入會對水源水質造成威脅[8]。此外，高濃度的CDOM還可能與水處理中的氯發(fā)生反應，生成鹵乙酸和三鹵甲烷等致癌物質[9]，并為飲用水中細菌的生長提供碳源[10]，從而影響人類健康[11]?？梢?，控制水體中的CDOM含量對水環(huán)境保護和飲用水安全都具有十分重要的意義。

植物修復技術因其效果好、成本低、無二次污染等特點，有望應用于環(huán)境中CDOM面源污染的控制與治理以及污水處理廠尾水中CDOM的深度凈化。Cano等[12]研究表明，種有紅鳥蕉和紙莎草的濕地系統(tǒng)比無植物對照組的脫色效果高出20%～21%。Huang等[13]研究證實，使用海馬齒的植物浮床技術可以有效去除水體中CDOM，且根際效應起到主要作用。A等[14]發(fā)現(xiàn)蘆葦濕地系統(tǒng)對污水中腐殖酸的脫色效果（76%～90%）顯著高于無植物濕地系統(tǒng)（59%～86%）。因此，有必要進一步研究植物對CDOM的脫色原理以及CDOM在植物根際的環(huán)境行為。

筆者以常見濕地植物蘆葦（Phragmites australis）為受試植物，以腐殖酸為代表性CDOM，旨在通過CDOM在蘆葦根際的脫色、分布和組成分析，探究植物對CDOM的脫色性能，以及CDOM在根際環(huán)境的分布特征與組成成分;通過蘆葦根系分泌物的脫色實驗，考察植物根系分泌物對CDOM脫色的影響;通過蘆葦酶提取液的脫色實驗，了解植物酶對CDOM脫色的作用。研究結果有助于揭示CDOM在植物根際的脫色機理及其環(huán)境行為，為植物修復CDOM的研究和應用提供技術支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 CDOM在蘆葦根際的脫色、分布和組成分析

1.1.1 CDOM脫色效果分析

向每個玻璃瓶中添加500 mL濃度為50 mg/L的腐殖酸鈉（Sigma Aldrich，上海）溶液，然后移入3株長勢相同的蘆葦幼苗。所有玻璃瓶用錫紙包裹進行遮光處理，并置于溫室條件（24 ℃、1 950 lx、16 h light/8 h dark）下進行為期82 d的植物水培實驗。實驗共設置3個處理組：1）有植物且添加腐殖酸的植物有機質實驗組;2）有植物且不添加腐殖酸的植物對照組;3）無植物且添加腐殖酸的有機質對照組，每組設兩個平行。實驗期間在82 d里連續(xù)采樣13次，每次采樣10 mL測定色度，且采樣前補充蒸發(fā)掉的水量并攪拌均勻，以避免水分耗損對色度的影響。色度的定量以390 nm波長下的吸光度換算得到[14]。

1.1.2 CDOM分布特征分析

待CDOM脫色效果實驗結束，立即回收蘆葦?shù)母怠⒏蹈街锛叭萜鞯撞砍恋砦?。將上?種樣品放入烘箱干燥（65 ℃，48 h）后稱重。使用0.02 mol/L的NaOH作為CDOM洗脫液，根系樣品使用30 mL洗脫液洗脫至洗脫液沒有色度為止（n=7）（n為采樣次數(shù)），根系附著物和容器底部沉淀物樣品均使用10 mL洗脫液洗脫至洗脫液沒有色度為止（n=5），然后測定所有樣品洗脫液的色度。

1.1.3 CDOM組成成分分析

待CDOM脫色效果分析結束，立即回收植物有機質實驗組和有機質對照組的剩余溶液;待CDOM分布特征分析結束，立即回收植物有機質實驗組和植物對照組的根系洗脫液。將上述樣品調節(jié)到pH值為8.0、色度為20 CU的狀態(tài)后，用超濾離心管（Amicon Ultra-4、Milipore、美國）超濾，然后計算濾液中5種不同截留分子量（3 000、10 000、30 000、50 000、100 000 NMWL）的濃度來分析不同樣品中CDOM的組成成分，具體操作步驟參照超濾離心管的使用說明書。

1.2 蘆葦根系分泌物的脫色實驗

蘆葦根系分泌物的制備分為兩部分：1）水溶性分泌物樣品的制備：待CDOM脫色效果實驗結束，立即回收植物有機質實驗組的蘆葦根，并稱取一定濕重（11.7 g）的根系樣品;將根系樣品浸入200 mL超純水中，置于振蕩培養(yǎng)箱（（28±1） ℃、120 r/min、3 min）內振蕩以清洗根系附著物;將根系樣品取出，重新浸入200 mL超純水中，置于人工氣候培養(yǎng)箱（（28±1） ℃、8 000 lx、16 h light/8 h dark）內靜置培養(yǎng)1 d;將根系樣品取出，并將剩余溶液經(jīng)0.2 μm醋酸纖維膜針頭過濾器（DISMIC-25CS，ADVANTEC，日本）過濾，所得濾液作為水溶性分泌物樣品。2）根系附著分泌物樣品的制備：將上述根系樣品浸入100 mL超純水中，使用超聲粉碎機和旋轉震蕩儀交替進行超聲（20 kHz、130 W、1 min）和振蕩各6次;將根系樣品取出，并將剩余溶液經(jīng)0.2 μm醋酸纖維素膜針頭過濾器過濾，所得濾液作為根系附著分泌物樣品。

將上述水溶性分泌物樣品和根系附著分泌物樣品經(jīng)冷凍干燥機濃縮干燥后，分別復溶于乙腈中，制成5倍濃縮根系分泌液。取0.5 mL上述濃縮液和4.5 mL濃度為50 mg/L的腐殖酸鈉溶液（pH值8.0）混合，然后注入褐色試管中，并置于振蕩培養(yǎng)箱（25 ℃、100 r/min）內培養(yǎng)。同時設置不添加根系分泌液的空白對照一起培養(yǎng)。連續(xù)4 d定時采取0.1 mL水樣進行吸光度測定，以390 nm波長下的吸光度換算成色度（CU），以465、665 nm波長下吸光度的比值（E4/E6）來表征CDOM的腐殖化程度。E4/E6值越小，表明CDOM的芳香性越高、分子量越高[15]。

1.3 蘆葦酶提取液的脫色實驗

待CDOM脫色效果實驗結束，立即回收植物有機質實驗組的蘆葦根，并稱取濕重240 mg的根系樣品。使用P-PER植物總蛋白抽提試劑盒（P-PER Plant Protein Extraction Kit，Thermo Scientific，美國）抽提蘆葦根系的組織蛋白，所得溶液作為植物酶提取液。取酶提取液按照0%、1%、5%的體積比與50 mg/L腐殖酸鈉溶液（pH值8.0）混合，然后注入褐色試管中，并置于振蕩培養(yǎng)箱（20 ℃、100 r/min）內培養(yǎng)。連續(xù)2 d定時采取0.1 mL水樣，并在390、465、665 nm波長下測定吸光度并計算其色度與E4/E6值。

2 結果和分析

2.1 CDOM在蘆葦根際的脫色、分布和組成

2.1.1 CDOM脫色效果

不同處理組中蘆葦對CDOM的脫色效果見圖1。在整個實驗過程中，植物有機質實驗組表現(xiàn)出較好的脫色效果（84%），在前40 d，植物便將色度從244 CU降至50 CU，此后色度穩(wěn)定在37～44 CU之間。植物對照組因為沒有添加CDOM，其初始色度接近于零（2.6 CU），但隨著實驗的進行，其色度緩慢上升到17 CU，這可能是植物釋放的分泌物中含有CDOM所致，但整體色度變化不大，可以忽略不計。有機質對照組因為缺少植物的作用，色度在82 d里僅從251 CU下降到213 CU?？梢奀DOM的自然水解速度十分緩慢，其脫色效應主要依賴于植物的作用。一方面，植物可以通過直接吸收和吸附CDOM來減少其環(huán)境含量;另一方面，植物根系可以為微生物提供生長介質，從而間接促進CDOM的生物降解。

2.1.2 CDOM分布特征

植物根系、根系附著物及容器底部沉淀物中CDOM提取液的色度見圖2。根系吸收、根系附著、沉淀物中CDOM色度分別為4.6×106、3.8×105、4.0×103? CU，且色度在這3種組分中的占比依次為92.20%、7.71%、0.08%。由此可見，CDOM大部分被根系吸收到植物體內，少部分吸附在植物根表，只有極少量殘渣與根系分泌物共同絮凝沉降在容器底部。雖然濃度相差甚遠，植物有機質實驗組和植物對照組中CDOM的分布規(guī)律基本一致，說明植物本身也含有一定量的CDOM[16]，且植物對不同濃度CDOM的去除方式均為根系吸收為主、根表吸附為輔。

2.1.3 CDOM組成成分

脫色處理液中CDOM不同分子量占比如圖3（a）所示。有機質對照組中高分子CDOM（分子量>100 kDa）的占比（67%）高于植物有機質實驗組（33%），表明植物可以促進CDOM分解，從而達到低分子化的效果。然而，有機質對照組中低分子CDOM（分子量<10 kDa）的占比（21%）也高于植物有機質實驗組（11%），這可能是因為低分子有機質容易被植物吸收，從而轉移進入植物體內[17]。

根系洗脫液中CDOM不同分子量占比如圖3（b）所示。植物對照組中低分子CDOM（分子量<30 kDa）的占比（37%）低于植物有機質實驗組（43%），特別是植物有機質實驗組中發(fā)現(xiàn)了低分子CDOM（分子量<3 kDa）（8%），而植物對照組中沒有（0%），說明只有低分子有機質才能通過細胞膜進入植物體內，這進一步解釋了圖3（a）中植物有機質實驗組的脫色處理液中低分子CDOM含量少的原因。

2.2 蘆葦根系分泌物對CDOM的脫色效果

根系分泌液脫色實驗結果如圖4所示。隨著時間的推移，CDOM的色度和E4/E6值在不同根系分泌物中均十分穩(wěn)定，分別為249～290 CU和3.5～4.6（水溶性分泌物）、322～353 CU和3.2～4.0（根系附著分泌物）、245～280 CU和4.0～5.0（無添加對照樣）。其中，水溶性分泌物的色度范圍與無添加對照樣非常相近，但低于根系附著分泌物;而根系附著分泌物的E4/E6值則略低于另外兩種。由此可知，

不但蘆葦根系分泌物對CDOM的脫色及其腐殖化過程均無直接影響，而且植物分泌的CDOM分子量較大，附著在植物根表上不易隨水流動，這與前面發(fā)現(xiàn)的低分子CDOM易被吸收進入植物體內的結果相呼應。

2.3 蘆葦酶提取液對CDOM的脫色效果

酶提取液脫色實驗的結果如圖5所示。隨著酶提取液添加量的提高，CDOM的反應呈現(xiàn)如下規(guī)律：在無添加對照樣中，色度從217 CU上升到246 CU，且E4/E6值從5.9下降到5.5;在1%酶提取液添加樣中，色度和E4/E6值均十分穩(wěn)定，分別為250 CU和5.6;而在5%酶提取液添加樣中，色度從321 CU下降到288 CU，且E4/E6值從2.7上升到4.1。表明植物酶可以作用于CDOM的低分子化進程，從而起到脫色的效果，這就解釋了在CDOM組成成分分析中觀察到植物能夠使CDOM低分子化的原因。

3 討論

在自然水解條件下，CDOM難以發(fā)生脫色反應，其有效脫色依賴于植物作用。絕大部分CDOM累積在植物體內，少量吸附在根系表面，只有極少量與根系分泌物共同絮凝沉淀。因此，植物以根系吸收為主、根表吸附為輔的途徑對CDOM進行脫色，這就決定了CDOM在植物不同組分中的分布規(guī)律;高分子有機物（分子量>3.5 kDa）容易附著在植物細胞壁上，而低分子有機物（分子量<3.5 kDa）可以通過植物細胞膜進入植物體內[17]。這與本研究的結果相一致，可見植物的存在有助于CDOM的低分子化，而這些低分子CDOM易被根系吸收進入植物體內。

雖然研究發(fā)現(xiàn)根系分泌物對CDOM的脫色反應并無明顯影響，但這并不表示它毫無作用。一方面，根系分泌物可以作為碳源而被微生物直接利用[18];另一方面，植物釋放的有機酸不但能夠使細胞表面吸附的腐殖酸結構發(fā)生變化[15]，而且可以刺激植物根系生長與ATP合成酶生成[19-20]。由此認為，植物根系分泌物并不是直接作用于CDOM的脫色過程，而是通過改變CDOM的形態(tài)結構以增強其生物可利用性，以及刺激相關功能菌的富集，從而促進CDOM的生物降解[21-23]。此外，植物的存在不但可以通過提供生長介質、釋放營養(yǎng)物質和氧氣等根際效應來改善根際微生物的生長條件[24]，而且可以通過生成過氧化物酶等代謝酶來促進CDOM的低分子化過程[25]。

結合植物脫色實驗和已知的微生物相關特性，圖6匯總了CDOM在蘆葦根際的脫色機理：1）高分子CDOM吸附在根表的細胞壁上，低分子CDOM通過細胞膜進入植物體內;2）植物的存在為微生物的富集提供了適宜的界面和微環(huán)境;3）CDOM的存在為植物和根際微生物的生長提供了碳源;4）植物釋放的根系分泌物可以改變CDOM結構，增強微生物活性;5）步驟2）～4）均有利于附著在植物根表的CDOM發(fā)生生物降解，從高分子有機質分解成低分子有機質;6）經(jīng)低分子化過程的CDOM被根系吸收進入植物體內，從而被植物酶進一步代謝分解。

4 結論

1）CDOM難以發(fā)生自然水解，其有效脫色依賴于植物作用。以根系吸收為主、根表吸附為輔的植物作用途徑?jīng)Q定了CDOM大量累積于植物體內、少量附著在植物表面的分布特征。其中，高分子CDOM往往附著在植物細胞壁上，而低分子CDOM能夠通過細胞膜進入植物內。

2）植物根系分泌物不能直接作用于CDOM的脫色反應，但可以通過提供生長介質和碳源促進根際微生物生長、改變CDOM形態(tài)結構以改善其生物可利用性，以及富集相關降解菌群強化生物降解功能等方式來間接調控CDOM的脫色降解過程。

3）吸附在根系表面的高分子CDOM能作為碳源被根際微生物利用，經(jīng)降解變成低分子CDOM后可通過根系吸收進入植物體內，并受到植物酶的代謝作用被進一步分解礦化，從而完成植物對CDOM的凈化作用。參考文獻：

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（編輯 黃廷）