化膿隱秘桿菌耐藥機制研究進(jìn)展

徐菁岐，莊科勤，張 涵，盧殿杰，孟雨晴，付連軍，沙萬里，董文龍

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林吉林 132109)

化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogen)是一種重要的條件致病菌，又名化膿放線桿菌、化膿棒狀菌，屬于隱秘桿菌屬[1]。該菌常分布于牛、羊、豬等動物的黏膜上，可引起乳房炎、肝周炎、子宮炎等，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，且對人也有一定的致病性[2-4]。有關(guān)研究表明，其主要毒力基因有溶血素基因(plo)、神經(jīng)氨酸酶基因(nanH與nanP)以及膠原結(jié)合蛋白基因(cpbA)[5]。近年來，化膿隱秘桿菌在我國上海、廣東、四川、天津等地均有報道，該細(xì)菌病范圍不斷擴大，并且在日本、約旦等國家均有致病性方面的研究[6-7]。當(dāng)前，青霉素、氨基糖苷類藥物、桿菌肽等抗生素是臨床治療的首選藥物，均能夠?qū)撾[秘桿菌有殺滅作用[8]。但是由于抗菌藥物的長期使用，容易導(dǎo)致化膿隱秘桿菌耐藥性及多重耐藥性的發(fā)生而影響治療效果。本文綜述了近年來國內(nèi)外化膿隱秘桿菌的耐藥情況，并對化膿隱秘桿菌的耐藥機制進(jìn)行了總結(jié)，以期為臨床用藥提供科學(xué)參考。

1 化膿隱秘桿菌對6類常用抗生素以及抗菌藥物的耐藥性及耐藥機制

目前，研究人員對化膿隱秘桿菌進(jìn)行耐藥試驗，發(fā)現(xiàn)其對氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素類抗生素、磺胺類藥物、β-內(nèi)酰胺類抗生素以及酰氨醇類抗生素有耐藥性。化膿隱秘桿菌的耐藥性與染色體基因有關(guān)，同時也可通過質(zhì)粒、整合子-基因盒系統(tǒng)等可移動元件從外界得到耐藥基因，從而使化膿隱秘桿菌產(chǎn)生耐藥性。

1.1 對氨基糖苷類抗生素的耐藥性及耐藥機制

氨基糖苷類抗生素是臨床上常用的抗生素之一，對化膿隱秘桿菌有抑菌效果。但隨著氨基糖苷類抗生素的不合理使用，細(xì)菌的耐藥問題也隨之出現(xiàn)[9]。2017年，Rezanejad M等[10]在患有乳腺炎和子宮炎的產(chǎn)后奶牛中共分離得到73株化膿隱秘桿菌并進(jìn)行了藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)分離菌株對慶大霉素產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象，且分離于奶牛乳腺炎的菌株對鏈霉素具有較高耐藥率，對不同臨床表現(xiàn)的化膿隱秘桿菌病的防治提供了數(shù)據(jù)支持。研究證明，在該菌中檢出率較高的Ⅰ類整合子中的基因盒存在5種可以誘導(dǎo)化膿隱秘桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥的基因aadA1、aadA2、aadA5、aacA4與aad(6 ')-Ib，并且發(fā)現(xiàn)rbsB表達(dá)形成的核糖體結(jié)合蛋白(ribosomal protein，RbsB)可以通過影響生物膜形成等生理過程導(dǎo)致化膿隱秘桿菌對氨基糖苷類抗生素耐藥[5]。另有研究表明，Kwiecien E等[11]對在分離株中發(fā)現(xiàn)的Ⅰ類整合子基因盒進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)aadA9、aadA11兩種基因，分別編碼了AadA9和AadA11，這兩種蛋白介導(dǎo)化膿隱秘桿菌對鏈霉素和新霉素的耐藥性，同時檢測到其他未由基因盒攜帶的氨基糖苷類抗性基因，如strA-strB和aph(3')-Ⅲa。

1.2 對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性及耐藥機制

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通過降低病原50S核糖體中肽酰轉(zhuǎn)移酶的活性來抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成，從而阻止其分裂，并影響胞內(nèi)代謝反應(yīng)的進(jìn)行，達(dá)到抑菌作用。Zastempowska E等[12]對從患有乳腺炎的奶牛分離得到的89株化膿隱秘桿菌進(jìn)行體外藥敏試驗，結(jié)果顯示其中1株菌株對紅霉素有耐藥性，其MIC值≥256 mg/mL，具有高耐藥性，同時在五個分離株都檢測到了耐藥基因ermB。2019年，Galan-Relano N等[13]對從西班牙采集到的96株化膿隱秘桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明有22%的分離株對紅霉素表現(xiàn)為不同程度的耐藥。另外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有化膿隱秘桿菌對紅霉素類衍生物及乙酰螺旋霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有多重耐藥性。例如，劉耀川等[14]對化膿隱秘桿菌分離株的相關(guān)耐藥基因msrA、mefA、ermX和ermB進(jìn)行了PCR擴增，并分析其核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的化膿隱秘桿菌中攜帶msrA(72.7%)及mefA(18.2%)。Tamai A T等[15]在從產(chǎn)后母牛分離到的65株化膿隱秘桿菌中,大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB和ermX的檢出率分別為27.7%和38.5 %。

1.3 對四環(huán)素類抗生素的耐藥性及耐藥機制

Zhang D X等[16]對可能存在于化膿隱秘桿菌中的耐藥基因tetK、tetO、tetL以及tetM進(jìn)行PCR擴增，并研究其在32株化膿隱秘桿菌分離株中的分布狀況，發(fā)現(xiàn)在所有分離株中都攜帶tetK，其在染色體和質(zhì)粒中存在率頗高，分別為53.1%和46.9%；在分離株中僅發(fā)現(xiàn)低量tetT(在染色體和質(zhì)粒的存在率分別為9.4%和12%)和tetM(在染色體和質(zhì)粒的存在率分別為12.5%和9.4%)；在所有分離株中未發(fā)現(xiàn)tetO以及otrA。2016年，Rzewuska M等[17]進(jìn)行相關(guān)研究表明化膿隱秘桿菌中的毒力因子與耐藥性存在一定的相關(guān)性，nanP可以使分離株對四環(huán)素的耐藥性降低3倍。Kwiecien E等[18]對用四環(huán)素耐藥基因rpp的通用引物擴增得到的15個基因片段進(jìn)行檢測，分析結(jié)果表明，所有擴增子都被識別為tet，該基因可能通過影響復(fù)制來介導(dǎo)耐藥。而在通過對所有分離株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)不同分離株攜帶不同的tetW基因，如從豬上分離得到的化膿隱秘桿菌攜帶4種不同的tetW變體(包括tetW-1、tetW-2、tetW-3和tetW-4)，而畜用牛和歐洲野牛的分離株中只攜帶tetW-3，對豬源以及牛源化膿隱秘桿菌的耐藥機制的區(qū)分提供了啟示。

1.4 對磺胺類抗菌藥物的耐藥性及耐藥機制

磺胺類藥物可與對氨基苯甲酸(PABA)競爭二氫葉酸合成酶，阻礙二氫葉酸的合成，從而影響核酸的生成，抑制化膿隱秘桿菌的生長繁殖。2018年，Iradi A T等[15]對從德黑蘭的產(chǎn)后奶牛分離得到的16株化膿隱秘桿菌進(jìn)行藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)其對甲氧芐啶-磺胺異惡唑(trimothoprim-surfacethoxazde，TMP-SMX)有高耐藥性(72.3%)。張素輝等[19]對在山羊分離得到的化膿隱秘桿菌進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明其對磺胺異惡唑表現(xiàn)出明顯的耐藥性。2019年，Galan-Relano N等[13]對從西班牙采集到的96株化膿隱秘桿菌分離株進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明有89%的分離株對甲氧芐啶-磺胺甲基異惡唑不敏感，耐藥現(xiàn)象較為普遍。Zhao K L等[20]在16株化膿隱秘桿菌檢測到有部分菌株攜帶磺胺類耐藥基因dfr2a。

1.5 對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性及耐藥機制

β-內(nèi)酰胺類抗生素可以抑制胞壁轉(zhuǎn)肽酶，使細(xì)胞壁合成障礙，也可以增加細(xì)胞壁自溶酶活性，產(chǎn)生自溶或胞壁質(zhì)水解，是用于治療化膿隱秘桿菌病最常見、最廣泛的抗生素之一。2013年，劉耀川等[21]對32株化膿隱秘桿菌進(jìn)行了β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性研究，所有分離株均表現(xiàn)出不同程度的耐藥，耐藥率從高到低依次為頭孢噻夫(75.0%)、氨芐西林(71.9%)、青霉素(68.7%)、苯唑西林(56.2%)以及阿莫西林(53.1%)。2017年，Rezanejad M等[10]研究表明，在取樣的患有子宮炎和乳腺炎的奶牛中分離得到的菌株對青霉素和阿莫西林都有嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象。Liu M C等[22]對奶牛子宮內(nèi)膜進(jìn)行取樣并進(jìn)行藥敏試驗，結(jié)果表明大約有37.5%至71.9%的化膿隱秘桿菌分離株對頭孢菌素類抗生素有耐藥性。Zhao K L等[20]在16株化膿隱秘桿菌檢測到β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaP1(28.6%)。Santos T M A等[23]對從子宮液分離得到的化膿隱秘桿菌進(jìn)行藥物敏感性分析，發(fā)現(xiàn)有至少50%的分離株表現(xiàn)出對阿莫西林的耐藥性。

1.6 對酰氨醇類抗生素的耐藥性及耐藥機制

氯霉素可作用于細(xì)菌核糖核蛋白體的50S亞基，阻撓蛋白質(zhì)的合成，屬抑菌性廣譜抗生素。董文龍等[24]對我國吉林省8株豬源化膿隱秘桿菌進(jìn)行MIC藥敏試驗，結(jié)果顯示有2株對氯霉素耐藥。Santos T M A等[23]對從子宮分離得到的化膿隱秘桿菌進(jìn)行MIC藥敏試驗，結(jié)果表明所有分離株表現(xiàn)出對氯霉素不同程度的耐藥。Liu M C等[22]對化膿隱秘桿菌中的Ⅰ類整合子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其中還有關(guān)于引起對氯霉素耐藥的基因cmlA6。

2 其他耐藥機制

在化膿隱秘桿菌抗生素耐藥性的傳播過程中，多種可移動元件發(fā)揮了重要作用。Dong W L等[25]發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)化膿隱秘桿菌耐藥的基因島TGI1，此基因島攜帶的1類整合子與化膿隱秘桿菌的多重耐藥有關(guān)。Zhao K L等[20]通過PCR擴增得到Ⅰ類整合子內(nèi)部攜帶的耐藥基因盒，其中包括編碼氨基糖苷類耐藥基因(aacC、aadA1、aadA2)、編碼β-內(nèi)酰胺類耐藥基因(blaP1)、編碼磺胺類耐藥基因(dfr2a)以及未知功能的基因(orfE)，表明Ⅰ類整合子的存在與化膿隱秘桿菌耐藥性普遍一致，且整合子在其耐藥性的傳播中發(fā)揮了重要作用。同時，插入序列(insetion sequence，IS)還可以獲取外源性耐藥基因，如四環(huán)素耐藥基因tet(33)可以通過IS6100水平轉(zhuǎn)移獲取[26]。韓雪在化膿隱秘桿菌分離株中檢測出tnpA(41.18%)、IS26(61.76%)和tnp513(17.65%)3種轉(zhuǎn)座子，且發(fā)現(xiàn)隨著化膿隱秘桿菌耐藥譜的擴大，轉(zhuǎn)座子tnpA的陽性率亦增加，說明化膿隱秘桿菌耐藥性產(chǎn)生或增加可能與轉(zhuǎn)座子tnpA存在密切關(guān)系[27]。Duse A等[28]對從瑞典乳腺炎奶牛分離得到的化膿隱秘桿菌進(jìn)行研究，其單峰MIC表明，該菌通常不會發(fā)生獲得性耐藥，說明化膿隱秘桿菌的耐藥機制存在地區(qū)性差異。

3 展望

化膿隱秘桿菌的耐藥性產(chǎn)生機制復(fù)雜多樣，其與染色體基因有關(guān)，同時也通過質(zhì)粒、整合子-基因盒系統(tǒng)等可移動元件從外界獲得耐藥基因，從而使化膿隱秘桿菌產(chǎn)生耐藥性。其中對氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素、四環(huán)素類抗生素、磺胺類抗生素、β-內(nèi)酰胺類抗生素以及酰氨醇類抗生素耐藥現(xiàn)象最為嚴(yán)重。

化膿隱秘桿菌是牛呼吸道綜合征和壁纖維蛋白性腹膜炎(Parietal fibrinous peritonitis，PFP)的主要致病菌之一，同時可以感染豬、羊、林麝等重要經(jīng)濟動物，并且能夠感染人與伴侶動物[29-31]?，F(xiàn)有抗生素品種有限，長期大量或不合理使用抗菌藥物是造成不同種類抗生素的耐藥性上升，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部出臺了各項政策，如何進(jìn)行重要病原菌的無抗替抗防治成為科研工作者的研究重點。有研究發(fā)現(xiàn)，能夠侵染化膿隱秘桿菌的噬菌體vB-ApyS-JF1，該噬菌體適用于化膿隱秘桿菌的防控[32]。高翔對木犀草素消減化膿隱秘桿菌對四環(huán)素類抗生素耐藥性的機制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)木犀草素對耐四環(huán)素類抗生素的化膿隱秘桿菌仍具有良好的體外抗菌活性，亞抑菌濃度(1/2 MIC)木犀草素能夠消減化膿隱秘桿菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥性，同時木犀草素還可以通過抑制MsrA外排泵增加對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的敏感性[33-34]。徐登峰等[35]進(jìn)行了化膿隱秘桿菌候選抗原的免疫保護(hù)效果研究，確定免疫鐵ABC轉(zhuǎn)運體重組SBP的小鼠能抵御致死劑量的化膿隱秘桿菌攻擊，表明該SBP是免疫原性良好的保護(hù)性抗原，可用于化膿隱秘桿菌亞單位疫苗的研發(fā)。Huang T等[36]研究出了以PLO聯(lián)合免疫白細(xì)胞介素(IL-1β)為基礎(chǔ)的DNA疫苗，用于增強易感動物對化膿隱秘桿菌的免疫力。抗菌肽具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點，希望可以更多的應(yīng)用到化膿隱秘桿菌病的防治[37]。

國內(nèi)對于化膿隱秘桿菌的各類耐藥性相關(guān)基因研究并不多，因此，更加系統(tǒng)、全面地開展化膿隱秘桿菌耐藥機制的研究，將對我國畜牧業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展具有重要的意義。