紫糯小麥籽粒石蠟切片制作技術(shù)優(yōu)化及淀粉粒累積分析

劉 娟，夏文榮，李 運(yùn)，李 妍，朱元?jiǎng)?，戴忠?/p>

(德州學(xué)院，山東德州 253023)

小麥(L．)是我國(guó)重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和品質(zhì)直接影響人類食物供應(yīng)程度和營(yíng)養(yǎng)水平。淀粉是小麥籽粒的主要組成成分，可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，一般胚乳淀粉中含有20%～30%直鏈淀粉和70%～80%支鏈淀粉。編碼淀粉合成酶(granule bound starch synthase，GBSS)的waxy基因缺失、突變或遺傳表達(dá)障礙會(huì)使胚乳中直鏈淀粉的含量減少，支鏈淀粉含量上升，小麥胚乳表現(xiàn)為糯性。小麥籽粒淀粉中直鏈淀粉含量 1%或不含直鏈淀粉的小麥稱為全糯質(zhì)小麥。小麥籽粒可分為果皮、珠被、珠心組織、胚乳和胚五部分，其中果皮和胚乳是儲(chǔ)存淀粉的主要部位。果皮可分為外果皮、中果皮和內(nèi)果皮三部分，其中，中果皮薄壁細(xì)胞的主要組成成分為淀粉，胚乳細(xì)胞可分為糊粉層細(xì)胞、胚乳轉(zhuǎn)移細(xì)胞和淀粉胚乳細(xì)胞三種類型，淀粉胚乳細(xì)胞主要含有淀粉和蛋白質(zhì)。目前，在糯性小麥淀粉粒形態(tài)方面，熊 飛等和劉 智等發(fā)現(xiàn)，不同小麥品種成熟籽粒胚乳細(xì)胞淀粉體均可分為餅形大淀粉體、橢圓形中型淀粉體、圓球形小淀粉體3種類型，且分布存在差異。蔡瑞國(guó)等認(rèn)為，糯性小麥成熟籽粒中存在A型大淀粉粒和B型小淀粉粒；魯 平等也發(fā)現(xiàn)糯性小麥胚乳存在兩種淀粉粒形態(tài)。但是從整體結(jié)構(gòu)上研究糯性小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中果皮和胚乳淀粉粒積累的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

石蠟組織切片在植物組織和結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)等研究中廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的石蠟切片制作方法需經(jīng)過(guò)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色及封固等多個(gè)環(huán)節(jié)，要制出高質(zhì)量的切片，每一個(gè)步驟的操作都很重要，且對(duì)特殊組織材料不能適用，因此需要改進(jìn)?？岛ａ壤肞AS(periodie acid-schiff reaction)反應(yīng)原理，改進(jìn)了第0～10天的水稻籽粒石蠟切片制作方法。于曉剛等對(duì)傳統(tǒng)石蠟切片技術(shù)中固綠步驟的染色時(shí)間進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)花后不同天數(shù)的粳稻穎果染色最佳時(shí)間差異很大。張潤(rùn)琪等主要從酒精氯仿混合透明逐級(jí)浸蠟等方面改良了石蠟切片技術(shù)；Zhang等開(kāi)發(fā)了一種在小麥籽粒灌漿的中后期(開(kāi)花后28 d和35 d)獲得高質(zhì)量全組織切片的簡(jiǎn)單方法；Yu等利用此法比較研究了糯性和非糯性小麥?zhǔn)诜酆蟮?天、第15天、第27天胚乳淀粉的發(fā)育情況。盡管前人對(duì)小麥籽粒發(fā)育的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了許多研究，但關(guān)于糯性小麥發(fā)育前期籽粒的特點(diǎn)尚缺少更加細(xì)致地報(bào)道。本研究以糯性小麥品種山農(nóng)紫糯2號(hào)為試驗(yàn)材料，對(duì)常規(guī)石蠟切片制作技術(shù)進(jìn)行改良，并結(jié)合光學(xué)顯微鏡對(duì)授粉后0～14 d的發(fā)育期籽粒淀粉粒的積累進(jìn)行觀察研究，以進(jìn)一步闡明小麥果皮和胚乳中淀粉粒的發(fā)育特征及小麥果皮和胚乳發(fā)育的關(guān)系，旨在為石蠟切片技術(shù)的應(yīng)用和糯性小麥品質(zhì)改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為山農(nóng)紫糯2號(hào)，于2019年-2020年度種植于山東省德州市農(nóng)科院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)，大田常規(guī)水肥管理。開(kāi)花時(shí)，選擇開(kāi)花和生長(zhǎng)一致的穗中部1、2位籽粒，采用單株掛牌和記號(hào)筆點(diǎn)穎相結(jié)合的方式進(jìn)行標(biāo)記，分別于開(kāi)花當(dāng)天(0 d)和花后2、4、6、8、10、12和14 d采集小麥籽粒，每次至少取10粒。

1.2 材料固定

對(duì)發(fā)育早期(花后0～6 d)籽粒，直接用2.5%戊二醛固定液固定；對(duì)于發(fā)育8 d及以后的籽粒，先橫切成3段，然后用2.5%戊二醛固定液固定，時(shí)間均為24 h以上。

1.3 籽粒形態(tài)觀察

取花后不同發(fā)育天數(shù)的小麥籽粒，于體視顯微鏡(Olympus，SZX10型)下觀察并采集照片。

1.4 石蠟切片的制作

試驗(yàn)初期根據(jù)傳統(tǒng)方法制作石蠟切片，針對(duì)出現(xiàn)的問(wèn)題對(duì)小麥籽粒石蠟切片制作過(guò)程中的洗脫、透明和浸蠟等環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化。

(1)傳統(tǒng)石蠟切片制作方法 脫水程序?yàn)椋?0%乙醇，1 h→50%乙醇，1 h→70%乙醇，1 h→85%乙醇，1 h→90%乙醇，1 h→95%乙醇，1 h→無(wú)水乙醇， 3次，每次1 h。透明程序?yàn)椋簾o(wú)水乙醇∶二甲苯=1∶1→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ→二甲苯Ⅲ，各1 h。浸蠟程序?yàn)椋憾妆健檬? 1∶1，60 ℃保溫12 h；石蠟Ⅰ，60 ℃保溫12 h；石蠟Ⅱ，60 ℃保溫24 h。

(2)優(yōu)化方法 脫水程序?qū)?0%乙醇和無(wú)水乙醇處理進(jìn)行優(yōu)化，具體見(jiàn)表1。透明程序借鑒張潤(rùn)琪等的方法。浸蠟方案參考康海岐等的方法設(shè)計(jì)3種程序，具體見(jiàn)表2。

表1 小麥籽粒不同脫水時(shí)間處理Table 1 Treatment of wheat grain with different dehydration time

表2 小麥籽粒不同浸蠟程序Table 2 Different wax soaking procedures of wheat grain

浸蠟后的樣品按常規(guī)方法包埋成蠟塊，然后在石蠟切片機(jī)(KD-2508，China)上切成10 μm厚的切片，并轉(zhuǎn)移到粘附載玻片(Citoglas，REF188105W，China)上。常規(guī)脫蠟后用0.5%甲苯胺藍(lán)染色10 min和0.5%冰醋酸分色40 s，中性樹(shù)膠封固后使用光學(xué)顯微鏡(徠卡DMI3000B)觀察并采集照片。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)變化

小麥籽粒發(fā)育初期表面呈乳白色，腹部中央臍部呈現(xiàn)淺綠色，內(nèi)部含有乳白色漿狀物質(zhì)。發(fā)育中期小麥籽粒因果皮中含有葉綠體而呈現(xiàn)綠色。隨著發(fā)育天數(shù)的增加，小麥籽粒體積由小變大，0～6 d體積變化明顯，其后逐漸變緩(圖1)。

A：背面；B：腹面。圖下方數(shù)字為小麥籽粒發(fā)育天數(shù)，標(biāo)尺=1 mm。

2.2 蠟切片技術(shù)優(yōu)化

根據(jù)傳統(tǒng)石蠟切片方法制作的小麥籽粒石蠟切片，浸蠟后籽粒變硬且呈現(xiàn)棕黃色，切片時(shí)出現(xiàn)粉末且蠟帶中間有孔洞，或者可切片但厚度在15 μm以上，切片效果不理想。試驗(yàn)方法改進(jìn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)脫水、透明和浸蠟環(huán)節(jié)對(duì)切片質(zhì)量影響較大，經(jīng)過(guò)不斷摸索對(duì)梯度脫水時(shí)間、透明和浸蠟程序進(jìn)行了優(yōu)化。

2.2.1 脫水和透明程序的優(yōu)化

制片過(guò)程中若組織內(nèi)的水分不能除盡，就會(huì)影響后續(xù)的透明和浸蠟。發(fā)育早期小麥籽粒在固定后，腹側(cè)仍呈現(xiàn)較淺的綠色，與其他組織相比，較易判斷脫水的效果。根據(jù)設(shè)計(jì)對(duì)70%乙醇和100%乙醇時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)僅增加70%乙醇處理時(shí)間，籽粒綠色不能完全褪去，增加無(wú)水乙醇處理時(shí)間后，脫水效果較好，綠色褪去，呈現(xiàn)淡黃色。

使用傳統(tǒng)方法透明時(shí)有的籽粒沒(méi)有明顯變化(圖2A)，有的籽粒明顯皺縮(圖2C)，透明程序結(jié)束后籽粒顏色均加深，多呈深黃色(圖2B、D)。使用改良的乙醇二甲苯逐級(jí)透明方案時(shí)，籽粒在透明過(guò)程中沒(méi)有明顯變化(圖2E)，直至透明結(jié)束籽粒仍飽滿，呈現(xiàn)更加明顯的乳白色或者淡黃色(圖2F)。故較優(yōu)透明程序?yàn)橐掖级妆街鸺?jí)透明法，即無(wú)水乙醇∶二甲苯=3∶1→無(wú)水乙醇∶二甲苯=2∶1→無(wú)水乙醇∶二甲苯=1∶1→純二甲苯，各1 h。

A、C：傳統(tǒng)方法透明中籽粒形態(tài)；B、D：傳統(tǒng)方法透明后籽粒形態(tài)；E：改進(jìn)方法透明中籽粒形態(tài)；F：改進(jìn)方法透明后籽粒形態(tài)。

對(duì)經(jīng)過(guò)不同脫水時(shí)間處理的小麥籽粒均進(jìn)行乙醇二甲苯逐級(jí)透明，當(dāng)前期脫水不充分，在透明過(guò)程中籽粒多出現(xiàn)局部皺縮(圖3A、C、E)，有些籽粒雖仍然飽滿但顏色加深(圖3 B、G、I)。當(dāng)前期小麥籽粒脫水充分后，透明后籽粒均飽滿且呈現(xiàn)淡黃色(圖3D、F、H、J)，且70%乙醇脫水2 h以上結(jié)果差異不明顯，故確定最佳70%脫水時(shí)間為2 h，最佳無(wú)水乙醇脫水時(shí)間為4 ℃10 h。確定最佳脫水方案為：30%乙醇、1 h→50%乙醇、1 h→70%乙醇、2 h→85%乙醇、1 h→90%乙醇、1 h→95%乙醇、1 h→無(wú)水乙醇、4 ℃10 h。

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J：不同脫水處理后使用改進(jìn)方法透明的籽粒形態(tài)。

2.2.2 充分浸蠟可以保證切片時(shí)組織的完整性

小麥籽粒浸蠟是否充分與處理時(shí)間和溫度都有關(guān)。結(jié)果(表2)顯示，直接使用高溫浸蠟(程序1)，籽粒明顯皺縮，顏色加深呈深黃色或黃褐色(圖4A、B)，切片時(shí)蠟帶中間有明顯孔洞，且有粉末掉落，不能夠完整切片(圖5A、C)。當(dāng)使用逐級(jí)浸蠟程序2時(shí)，籽粒在浸蠟過(guò)程中仍然飽滿，顏色呈淡黃色(圖4C、D)，直至包埋后仍無(wú)明顯改變，可以完整切片(圖5B、D)。當(dāng)縮短處理時(shí)間，使用程序3時(shí)，切片效果與程序2無(wú)差異，且節(jié)約了時(shí)間。故最佳浸蠟程序?yàn)橹鸺?jí)浸蠟，即二甲 苯∶石蠟=3∶1、37 ℃，直至溶解；二甲苯∶石 蠟=2∶1，42 ℃，直至溶解；二甲苯∶石蠟= 1∶1， 47 ℃，直至溶解；純石蠟，60 ℃，18 h。

A、B：傳統(tǒng)方法浸蠟后籽粒形態(tài)；C、D：改進(jìn)方法浸蠟后籽粒形態(tài)。

A：傳統(tǒng)浸蠟方法處理后包埋籽粒(橫切面)；B：改進(jìn)浸蠟方法處理后包埋籽粒(橫切面)；C：傳統(tǒng)浸蠟方法處理后切片蠟帶(孔洞， 粉末)；D：改進(jìn)浸蠟方法處理后切片蠟帶(籽粒橫切面)。

2.3 小麥籽粒顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.3.1 小麥籽粒橫切面觀察

應(yīng)用改進(jìn)的方法可以切出連續(xù)的蠟帶，制作完整的籽粒橫切片。由小麥籽粒橫切面顯微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，授粉后第0～6天的籽粒，外圍是厚厚的果皮，果皮厚度約占籽粒橫徑的一半，在籽粒腹部果皮的正中央有明顯的凹陷(圖6A、圖7A、圖8A、圖9A)。隨著灌漿物質(zhì)的積累，小麥籽粒逐漸發(fā)育成熟，授粉后第8天的籽粒橫切面顯示，籽粒腹部的凹陷充實(shí)膨脹，胚乳細(xì)胞也明顯充實(shí)，籽粒橫切面由倒心形充實(shí)為接近圓形(圖10A)。隨著灌漿物質(zhì)的繼續(xù)積累，小麥籽粒逐漸發(fā)育成熟，授粉后第10～14天的籽粒橫切面顯示，籽粒果皮進(jìn)一步退化，中央胚乳部分繼續(xù)充實(shí)膨脹，與授粉后前6 d的籽粒相比，胚乳所占比例大大增加，外面僅有很薄的果皮包被，果皮厚度和細(xì)胞層數(shù)明顯減小(圖11A、圖12A、圖13A)。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內(nèi)果皮(A中黑框D高倍觀)；Pe：果皮；CV：中央液泡；SG：淀粉粒；Nu：細(xì)胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內(nèi)果皮(A中黑框D高倍觀)；Pe：果皮；CV：中央液泡；SG：淀粉粒；Nu：細(xì)胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內(nèi)果皮(A中黑框D高倍觀)；E：外周胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：中央胚乳(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細(xì)胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內(nèi)果皮(A中黑框D高倍觀)；E：外周胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：中央胚乳(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細(xì)胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：外果皮(A中黑框B高倍觀)；C：中果皮(A中黑框C高倍觀)；D：內(nèi)果皮(A中黑框D高倍觀)；E：外周近糊粉層胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：外周近中心胚乳(A中黑框F高倍觀)；G：中央近腹部胚乳(A中黑框G高倍觀)；H：中央近中心胚乳(A中黑框H高倍觀)；I：中央近背部胚乳(A中黑框I高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細(xì)胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：果皮(A中黑框B高倍觀)；C：外周近糊粉層胚乳(A中黑框C高倍觀)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍觀)；E：中央胚乳腹部(A中黑框E高倍觀)；F：中央胚乳背部(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細(xì)胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：果皮(A中黑框B高倍觀)；C：外周近糊粉層胚乳(A中黑框C高倍觀)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍觀)；E：中央近腹部胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：中央近背部胚乳(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒；Nu：細(xì)胞核。

A：籽粒(橫切面)；B：果皮(A中黑框B高倍觀)；C：外周近糊粉層胚乳(A中黑框C高倍觀)；D：外周近中心胚乳(A中黑框D高倍觀)；E：中央近腹部胚乳(A中黑框E高倍觀)；F：中央近背部胚乳(A中黑框F高倍觀)；Pe：果皮；En：胚乳；SG：淀粉粒。

2.3.2 果皮顯微結(jié)構(gòu)觀察

小麥果皮由子房壁發(fā)育而來(lái)，外果皮細(xì)胞1～2層，呈方形或長(zhǎng)方形；中果皮細(xì)胞數(shù)量較多，呈多邊形；內(nèi)果皮靠近胚乳，由靠外側(cè)體積較大的橫細(xì)胞和1層排列規(guī)則的管細(xì)胞組成。授粉當(dāng)天，果皮三層結(jié)構(gòu)完整，開(kāi)始出現(xiàn)較少量淀粉粒，中果皮中淀粉粒積累相對(duì)較多較少(圖6B～D)。授粉后第2天，果皮中淀粉粒呈圓形，體積較小，在果皮三層結(jié)構(gòu)中沒(méi)有明顯差異(圖7B～D)。授粉后第4 8天，可以清楚看到中果皮薄壁細(xì)胞內(nèi)積蓄的淀粉粒數(shù)量明顯增多，體積明顯變大，內(nèi)果皮中次之，外果皮中淀粉粒最少(圖8B D、圖9B D、圖10B D)。授粉后第10～14天，小麥籽粒橫切面果皮顯著變薄，最薄處僅由4～5層細(xì)胞構(gòu)成，而且果皮中積蓄的淀粉粒數(shù)量逐漸減少，體積也變小(圖11B、圖12B、圖13B)。

2.3.3 胚乳顯微結(jié)構(gòu)觀察

小麥?zhǔn)诜酆蟮?～2天的籽粒中央為一個(gè)大液泡，胚乳處于游離核階段，無(wú)淀粉粒積蓄。授粉后第4天，胚乳細(xì)胞開(kāi)始形成細(xì)胞壁，細(xì)胞網(wǎng)狀輪廓清晰可見(jiàn)，尚未積蓄淀粉粒(圖8E、F)。授粉后第6天，胚乳繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞分化，開(kāi)始積蓄少量淀粉粒(圖9E、F)。隨著時(shí)間的推移，授粉后第8天，胚乳細(xì)胞層數(shù)增加并趨向充滿胚囊，腹部胚乳細(xì)胞、背部中心和糊粉傳遞細(xì)胞中已有淀粉粒累積，此時(shí)淀粉粒呈圓球形，體積仍較小，而背部近糊粉層胚乳細(xì)胞仍具有較多胚乳核，未出現(xiàn)淀粉粒(圖10E～I(xiàn))。授粉后第10～12天，小麥籽粒腹部胚乳細(xì)胞逐漸被淀粉粒充滿，淀粉粒體積逐漸增大，數(shù)量逐漸增多，背部胚乳繼續(xù)向無(wú)核化發(fā)展(圖11C～F、圖12C～F)。授粉后第14天，胚乳細(xì)胞中幾乎完全充滿淀粉粒，淀粉粒體積明顯增大，多為橢圓形和球形(圖13C～F)。

3 討 論

3.1 糯小麥果皮和胚乳淀粉積累特征

隨著小麥籽粒發(fā)育成熟，果皮發(fā)育與胚乳發(fā)育相協(xié)調(diào)。Xiong等研究認(rèn)為，授粉后第3天果皮中開(kāi)始積累淀粉體，授粉后第7～9天果皮內(nèi)淀粉體增至最多，隨后開(kāi)始消失。Zheng等發(fā)現(xiàn)，小麥穎果授粉后第3天果皮厚，授粉后第6天果皮薄壁細(xì)胞明顯退化。劉大同等觀察發(fā)現(xiàn)，授粉后第5天果皮中淀粉粒較豐富，授粉后第10天果皮中淀粉粒數(shù)量增多、體積增大，隨后逐漸解體。本試驗(yàn)也有類似結(jié)果，紫糯小麥?zhǔn)诜郛?dāng)天到第14天，果皮具有明顯的生長(zhǎng)和消亡過(guò)程，果皮內(nèi)淀粉粒也隨之累積和降解。授粉當(dāng)天到第4天的小麥籽粒，主要是果皮中逐漸積蓄淀粉粒，這可能與籽粒發(fā)育初期營(yíng)養(yǎng)供給有關(guān)。授粉后第6～8天，小麥籽粒果皮中淀粉粒蓄積最多，且淀粉粒在內(nèi)、中、外三層果皮中體積和數(shù)量分布呈現(xiàn)明顯差異，該階段果皮中淀粉粒增至最多，與胚乳細(xì)胞開(kāi)始發(fā)生增殖和分化的時(shí)期基本一致，這可能與胚乳發(fā)育初期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供相關(guān)。授粉后第10天開(kāi)始淀粉粒逐漸降解，被分解為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以供胚乳細(xì)胞充分吸收和利用。

小麥籽粒的生長(zhǎng)發(fā)育伴隨著胚乳發(fā)育和淀粉積累。研究表明，在授粉后第5～6天時(shí)，小麥籽粒胚乳淀粉體首先在靠近細(xì)胞核的區(qū)域出現(xiàn)，授粉后第8～24天逐漸發(fā)育和富集。Jing等發(fā)現(xiàn)，普通小麥?zhǔn)诜酆蟮?天開(kāi)始出現(xiàn)少量淀粉粒，胚乳細(xì)胞化過(guò)程在授粉后第3天、4天開(kāi)始，且由外向內(nèi)進(jìn)行，直至完全充滿。余徐潤(rùn)等研究發(fā)現(xiàn)，小麥近糊粉層胚乳細(xì)胞比中央胚乳細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒體積小且數(shù)量少。本試驗(yàn)中，小麥籽粒發(fā)育早期胚乳細(xì)胞的分化與淀粉粒的積蓄也遵循同樣的規(guī)律，授粉后第6天，胚乳細(xì)胞開(kāi)始分化，出現(xiàn)極少量淀粉粒。授粉后第8～12天，胚乳繼續(xù)向無(wú)核化發(fā)展，淀粉粒積累在胚乳橫切面上呈現(xiàn)明顯差異，相對(duì)于近糊粉層細(xì)胞，中心細(xì)胞積累較快，淀粉粒充實(shí)度更好；腹部胚乳細(xì)胞較背部細(xì)胞積累多，背部糊粉傳遞細(xì)胞比近糊粉層細(xì)胞積蓄更快。授粉后第14天，淀粉粒積蓄已接近飽和，說(shuō)明授粉后第8～14天淀粉粒積累迅速，是胚乳發(fā)育和淀粉粒形成的重要時(shí)期。Xiong等觀察發(fā)現(xiàn)，授粉后第15天小麥胚乳淀粉體數(shù)量分布呈顯著差異，腹部近糊粉層胚乳細(xì)胞比中心細(xì)胞內(nèi)淀粉體數(shù)量多，背部中心胚乳細(xì)胞中淀粉體數(shù)量多于糊粉傳遞細(xì)胞。與之不同，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，授粉后第8～14天小麥背部糊粉傳遞細(xì)胞內(nèi)淀粉粒積累比近糊粉層胚乳細(xì)胞更多、更快，這可能與小麥胚乳淀粉積累時(shí)序存在品種差異 有關(guān)。

3.2 石蠟切片技術(shù)的優(yōu)化

材料脫水、透明和浸蠟環(huán)節(jié)是影響切片質(zhì)量的重要因素?？岛ａ妊芯堪l(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%、83%、95%濃度梯度材料容易脫水且不易收縮。于曉剛等發(fā)現(xiàn)，將脫水步驟改為70%過(guò)夜、85%、95%、100%(每次2 h)及100%(1.5 h)乙醇溶液，組織材料不易變形且有利于脫水。張潤(rùn)琪等采用酒精氯仿逐級(jí)混合透明，透明總用時(shí)達(dá)81 h；逐漸升溫浸蠟，但是前21 d的小麥籽粒浸蠟總時(shí)間長(zhǎng)達(dá)84 h，切片厚度為10～25 μm。本試驗(yàn)初期在常規(guī)石蠟切片技術(shù)基礎(chǔ)上，借鑒前述方法，制作了小麥籽粒石蠟切片，發(fā)現(xiàn)制作的授粉后第4天、第6天、第8天小麥籽粒的切片效果相對(duì)較好，但是授粉當(dāng)天和授粉后第2天的小麥籽粒有皺縮現(xiàn)象，授粉后第10天后的小麥籽粒后續(xù)環(huán)節(jié)中顏色加深，無(wú)法制出10 μm的切片。后期試驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)，乙醇梯度脫水從30%濃度開(kāi)始，70%乙醇脫水時(shí)間為2 h，100%乙醇步驟為 4 ℃脫水10 h，這樣降低了高濃度脫水對(duì)材料的影響，也增強(qiáng)了脫水效果。結(jié)果表明，授粉后第14天之前的小麥籽粒均可充分脫水，且不變形。透明環(huán)節(jié)改為乙醇和二甲苯逐級(jí)透明(無(wú)水乙醇 二甲苯=3∶1→無(wú)水乙醇∶二甲苯=2∶1→無(wú)水乙醇∶二甲苯=1∶1→純二甲苯，各1 h)，籽粒明顯不皺縮不變顏色。浸蠟方法改為從37 ℃開(kāi)始逐級(jí)浸蠟，先是在純二甲苯中加入少量碎蠟粒，然后逐漸增加石蠟，同時(shí)逐漸升高溫度，效果改善明顯。該優(yōu)化技術(shù)在其它小麥品種石蠟切片中也進(jìn)行了應(yīng)用，表現(xiàn)出明顯的改良效果(數(shù)據(jù)未顯示)，表明改進(jìn)的石蠟切片制作方法適合于早期小麥籽粒的結(jié)構(gòu)研究。