花生ＭＩＴＥ反應(yīng)體系優(yōu)化及其遺傳多樣性分析

徐彪 王佰眾 李玉發(fā) 楊翔宇 王偉 牛海龍 李偉堂 劉紅欣 吳松權(quán) 何中國

摘要：為了建立適宜不同來源花生種質(zhì)遺傳差異分析的MITE反應(yīng)體系，本研究從反應(yīng)體系總量、TaqPCRMix用量、引物濃度、模板DNA濃度及退火溫度、循環(huán)次數(shù)方面對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積10μL，模板DNA20ng，引物（15μmol/L）2μL，TaqPCRMix5μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸30s，循環(huán)32次;72℃延伸10min;4℃保存。利用優(yōu)化的反應(yīng)體系從50對AhMITE引物中篩選出11對多態(tài)性高的引物，并用于對22份不同來源的花生種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，共擴(kuò)增出23條帶，其中，多態(tài)性帶21條，多態(tài)性比例為91.3%，每個(gè)引物平均擴(kuò)增的多態(tài)性帶為1.91條。種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)在0.222～0.957之間，平均值為0.644;通過NTSYS-pcVersion2.1軟件基于UPGMA法進(jìn)行聚類圖繪制，在遺傳相似系數(shù)為0.62時(shí)可將22份花生種質(zhì)分為3大類。表明經(jīng)過優(yōu)化的AhMITE反應(yīng)體系可以有效地用于不同來源花生種質(zhì)的遺傳多樣性分析，表現(xiàn)出良好的多態(tài)性，可為進(jìn)一步使用AhMITE標(biāo)記對花生品種鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生;AhMITE標(biāo)記;反應(yīng)體系優(yōu)化;遺傳多樣性分析

中圖分類號：S565.203 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2022）01-0001-06

栽培花生（ArachishypogaeaLinn.，AABB，2n=4x=40）是一種重要的異源四倍體作物，原產(chǎn)于南美洲，富含油脂、蛋白質(zhì)、維生素和其他微量營養(yǎng)元素[1，2]。評估花生種質(zhì)資源的遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)，分析其遺傳多樣性，對于挖掘花生種質(zhì)的遺傳潛力、選育滿足不同需求的花生品種具有重要意義[3]。

分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛用于花生種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，如姜慧芳等[4]用簡單序列重復(fù)（SSR）標(biāo)記和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)分析了31份具有不同青枯病抗性的花生種質(zhì)的遺傳多樣性;楊海棠等[5]利用200對多態(tài)性較好的SSR分子標(biāo)記對河南省近年推廣及新選育的60個(gè)花生品種（系）進(jìn)行了遺傳多樣性分析;閆苗苗等[6]應(yīng)用RAPD和ISSR標(biāo)記對24份花生材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析;Zou等[7]使用具有單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記評估了384份花生種質(zhì)的遺傳多樣性。

MITEs即微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件（miniatureinverted-repeattransposableelements），最早是從玉米中發(fā)現(xiàn)的，后被證明廣泛存在于動植物基因組中，是一種活躍的、非自主的DNA轉(zhuǎn)座子，在調(diào)控基因表達(dá)、進(jìn)化及生物多樣性形成中起著重要作用[8，9]。研究表明，利用MITE標(biāo)記輔助花生種質(zhì)鑒定和多樣性分析簡單高效，且揭示的栽培花生DNA多態(tài)性明顯高于SSR和其他類型分子標(biāo)記[10-12]。建立適宜的MITE反應(yīng)體系是擴(kuò)增多態(tài)性條帶的關(guān)鍵，決定了后續(xù)多樣性分析結(jié)果的準(zhǔn)確性;但不同基因型、不同來源花生種群因受環(huán)境影響其最佳AhMITE 反應(yīng)體系會存在差異[13-15]。因此，本試驗(yàn)首先對AhMITEPCR反應(yīng)體系的總量、TaqPCRMix用量、引物濃度、模板DNA濃度及退火溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，然后用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對不同來源的22份花生種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，評估品種間的遺傳變異程度，以期為今后開發(fā)和利用AhMITE標(biāo)記分析花生種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)行種質(zhì)鑒定及構(gòu)建遺傳圖譜提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用22份花生種質(zhì)材料均來自于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花生育種研究團(tuán)隊(duì)，其中，珍珠豆型花生種質(zhì)19份，多粒型花生種質(zhì)3份。材料名稱和來源見表1。

1.2 DNA提取及PCR擴(kuò)增

采用CTAB法提取花生組DNA[13]，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測花生組DNA的片段和質(zhì)量，并用超微量分光光度計(jì)對DNA的濃度進(jìn)行測定，將DNA稀釋為20ng/μL，放于-20℃冷凍備用。

PCR預(yù)先設(shè)定的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，56～61℃退火40s，72℃延伸30s，循環(huán)28～33次;72℃延伸10min;4℃保存。

PCR產(chǎn)物使用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電極緩沖液采用0.5×TBE，核酸染料（goldview）染色后在凝膠分子成像系統(tǒng)（JY04S-3E型）中拍照保存。

1.3 AhMITE引物的篩選

將來源不同的東北王、花育20、商花5、宇花16、開農(nóng)310、冀花13號的花生組DNA以相同比例混合在一起作為DNA模板，對50對AhMITE引物進(jìn)行特異性篩選[14]，最后篩選出11對多態(tài)性AhMITE引物（表2），用于花生資源的遺傳多樣性分析，其中AhTE0577用于AhMITE反應(yīng)體系的優(yōu)化。

1.4 AhMITE-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序優(yōu)化

對影響PCR反應(yīng)的6個(gè)主要因素進(jìn)行優(yōu)化：①反應(yīng)體系總量設(shè)置5、10、15、20、25、30μL，6個(gè)梯度;②TaqPCRMix用量設(shè)置1、2、3、4、5、6μL，6個(gè)梯度;③ 退火溫度設(shè)置56、57、58、59、60、61℃，6個(gè)梯度;④循環(huán)次數(shù)設(shè)置28、29、30、31、32、33，6個(gè)梯度;⑤引物（15μmol/L）用量設(shè)置1、2、3、4、5、6μL，6個(gè)梯度;⑥模板DNA用量設(shè)置5、10、15、20、25、30ng，6個(gè)梯度。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)擴(kuò)增的電泳條帶，在NTSYS-pcVersion2.1軟件的ntedit中輸入“1”（有條帶）、“0”（無條帶）、“9”（條帶缺失），使用軟件中的Similarity程序計(jì)算花生種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，最后使用Clustering程序基于UPGMA的方法繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生基因組DNA濃度及質(zhì)量檢測

提取的花生組DNA經(jīng)超微量紫外分光光度計(jì)檢測，OD260/OD280值在2.0左右;瓊脂糖電泳檢測結(jié)果如圖1所示，條帶明亮、整齊、無污染，濃度較高，可以進(jìn)一步用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 AhMITE反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 反應(yīng)體系總量和TaqPCRMix用量對PCR擴(kuò)增的影響 反應(yīng)體系總量會影響擴(kuò)增效率，當(dāng)反應(yīng)體系總量為5μL時(shí)，部分條帶模糊、缺失，而在10～30μL時(shí)擴(kuò)增條帶基本一致（圖2）。當(dāng)TaqPCRMix用量為1～3μL時(shí)，條帶模糊不清，用量為5、6μL時(shí)，條帶清晰明亮（圖3）。綜合考慮，反應(yīng)體系總量選用10μL，TaqPCRMix用量選用5μL。

2.2.2 退火溫度和循環(huán)次數(shù)對PCR擴(kuò)增的影響

由圖4可見，當(dāng)退火溫度為56℃和57℃時(shí)條帶模糊不清晰，退火溫度為58℃時(shí)條帶清晰可見;退火溫度繼續(xù)升高，條帶又變得模糊且亮度減弱。因此，退火溫度選用58℃。由圖5可見，循環(huán)次數(shù)為28～30時(shí)，180～190bp的條帶模糊;循環(huán)次數(shù)為31時(shí)，180bp的條帶彌散不清楚;循環(huán)次數(shù)為33時(shí)，條帶也模糊不清;只有循環(huán)次數(shù)為32時(shí)，條帶清晰可見。因此，循環(huán)次數(shù)選用32。

2.2.3 引物和DNA用量對PCR擴(kuò)增的影響 引物濃度是影響AhMITEPCR擴(kuò)增效果的重要因素之一。結(jié)果（圖6）顯示，當(dāng)引物（15μmol/L）用量為1μL時(shí)條帶模糊，2μL時(shí)180、190bp的擴(kuò)增條帶清晰;超過2μL，隨著引物用量的增加，擴(kuò)增條帶逐漸模糊、變暗。因此，2μL是最佳引物用量。

結(jié)果（圖7）顯示，模板DNA用量為5～20ng時(shí)，條帶逐漸變得清晰明亮;DNA用量為25ng和30ng時(shí)，條帶明亮程度不變。綜合考慮，選用20ng作為最適模板DNA用量。

2.3 遺傳多樣性分析

從50對AhMITE引物中篩選出重復(fù)性好、多態(tài)性高的引物11對，用于對22份花生種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，獲得了較理想的擴(kuò)增結(jié)果（表2）。圖8為以多態(tài)性引物AhTE0254為例的擴(kuò)增結(jié)果。

11對AhMITE引物共擴(kuò)增出23條帶，多態(tài)性帶21條，多態(tài)性比率為91.3%;每個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為1～3，平均每個(gè)引物擴(kuò)增1.91條多態(tài)性帶;引物AhTE0622擴(kuò)增出的帶最多，為3條，其余引物均擴(kuò)增出2條帶。

2.4 聚類分析

22份花生種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.222～0.957，平均值為0.644。其中，商花511和宇花4的遺傳相似系數(shù)最小，為0.222，二者遺傳距離最遠(yuǎn);白院花9號和花育20的遺傳相似系數(shù)最大，為0.957，二者遺傳距離最近。

在遺傳相似系數(shù)為0.62時(shí)，可將22份花生種質(zhì)分為3大類（圖9）：第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類分別包括9、10、3份花生材料。在遺傳相似系數(shù)為0.754時(shí)，第Ⅰ大類又可分為兩個(gè)亞類，第1亞類包括東北王、白院花9號、吉花9號、I2S2、花育20，第2亞類包括白沙308、宇花16、宇花4、宇花9;第Ⅱ大類在遺傳相似系數(shù)為0.703時(shí)也可分為兩個(gè)亞類，第1亞類包括花育25、吉花50、阜花22、商花511、宇花5、花育961，第2亞類包括9102、商花5、冀花甜1號、開農(nóng)310。

3 討論與結(jié)論

3.1 AhMITE反應(yīng)體系優(yōu)化

AhMITEPCR反應(yīng)體系的模板DNA濃度、引物濃度、TaqPCRMix用量和退火溫度等因素都會對擴(kuò)增結(jié)果造成明顯影響，從而影響后續(xù)遺傳多樣性分析的結(jié)果;而且不同花生種質(zhì)因基因型差異和環(huán)境影響，其最佳AhMITEPCR反應(yīng)體系也會存在差異[15]。因此，優(yōu)化AhMITEPCR反應(yīng)體系對試驗(yàn)結(jié)果起著至關(guān)重要的作用。

PCR反應(yīng)體系總量會影響擴(kuò)增效率。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)體系總量過低會導(dǎo)致擴(kuò)增條帶模糊、缺失，總量在10～30μL時(shí)條帶比較清晰、一致。

TaqPCRMix用量過少會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物不足，用量過多則會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物增多且增加檢測成本[16]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，TaqPCRMix用量為1μL和2μL時(shí)，出現(xiàn)擴(kuò)增條帶缺失現(xiàn)象;隨用量增加，逐漸出現(xiàn)清晰條帶，當(dāng)用量為5μL和6μL時(shí)條帶清晰明亮，效果最佳。

引物濃度過高會導(dǎo)致不匹配和非特異性擴(kuò)增，而過低則導(dǎo)致無法進(jìn)行有效擴(kuò)增;模板DNA濃度過高會使引物或dNTP過早耗盡，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，而過低則會導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物減少、擴(kuò)增條帶變?nèi)鮗17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)15μmol/L引物用量低于或超過2μL時(shí)，擴(kuò)增條帶模糊、發(fā)暗，用量2μL時(shí)擴(kuò)增條帶最清晰;在5～20ng范圍內(nèi)，隨著模板DNA用量的增大，擴(kuò)增條帶清晰度增加，15～30ng時(shí)條帶清晰度無明顯差別，與前人研究結(jié)果[18，19]基本一致。

退火溫度對PCR擴(kuò)增結(jié)果也有較大影響。在一定范圍內(nèi)，退火溫度高時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性較好，退火溫度較低則會導(dǎo)致模板DNA與引物的非特異性結(jié)合[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，退火溫度為58℃時(shí)條帶清晰，低于或高于該溫度時(shí)擴(kuò)增條帶均模糊，呈現(xiàn)出低則結(jié)合率低、高則抑制的現(xiàn)象。循環(huán)次數(shù)亦如此，僅當(dāng)循環(huán)32次時(shí)可得到清晰條帶。這與徐雯等[21]的研究結(jié)果基本一致。

綜合考慮成本和時(shí)間等問題，最終確定AhMITEPCR的最佳反應(yīng)體系為：反應(yīng)總體積10μL，模板DNA20ng，15μmol/L引物2μL，TaqPCRMix5μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min;95℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸30s;共循環(huán)32次;4℃保存。

3.2 22份花生種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析

目前花生中應(yīng)用MITE標(biāo)記進(jìn)行的研究多是基于Shirasawa等[22]開發(fā)的AhMITE1標(biāo)記進(jìn)行的，根據(jù)標(biāo)記在特定位點(diǎn)的插入或缺失判斷PCR產(chǎn)物多態(tài)性[23，24]。本研究選用Shirasawa等[22]開發(fā)的50對引物，并從中篩選到11對多態(tài)性引物，對22份花生種質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果共擴(kuò)增出23條帶，多態(tài)性條帶21條，多態(tài)性比例為91.3%，每個(gè)引物平均擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為1.91條，多態(tài)性較高，表明這些引物可以用于對不同來源花生種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。本試驗(yàn)供試材料間的遺傳相似系數(shù)在0.222～0.957之間，平均值為0.644，具有比較豐富的遺傳多樣性，這與白冬梅[25]、侯睿[26]等的研究結(jié)果類似。聚類分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)0.62處可將22份花生種質(zhì)分為3大類，其中，商花511和宇花4的遺傳相似系數(shù)最?。?.222），親緣關(guān)系較遠(yuǎn);白院花9號和花育20的遺傳相似系數(shù)最大（0.957），說明兩者親緣關(guān)系較近，也可能是由于AhMITE引物對兩花生材料沒有特異性。

綜合上述分析，優(yōu)化后的AhMITE反應(yīng)體系能夠擴(kuò)增出清晰的多態(tài)性條帶，可用于不同來源花生種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。開發(fā)更多AhMITE標(biāo)記對于進(jìn)一步促進(jìn)花生分子輔助育種水平及加快新品種選育進(jìn)程具有重要意義。