circRNA作用于急性缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

鄭繼青，龍耀斌△，劉云

急性缺血性腦卒中（AIS）由顱內(nèi)動脈閉塞或顱外頸動脈閉塞引起，約占腦卒中的85%［1］，可導(dǎo)致腦組織死亡、局灶性神經(jīng)缺陷，給患者和社會帶來巨大負(fù)擔(dān)。目前，靜脈溶栓和血管內(nèi)治療是臨床上AIS常用的治療方法，但存在治療時(shí)間窗的限制以及神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注損傷問題［2］。AIS最常用的診斷工具是CT和MRI，但MRI檢查不適用于安裝金屬支架的患者，且價(jià)格昂貴［3］，CT對大腦早期缺血變化并不敏感［1］。因此需探索靈敏、可靠、實(shí)惠的早期篩查和診斷的生物標(biāo)志物及有效治療靶點(diǎn)。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA，以閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)命名，其環(huán)狀二級結(jié)構(gòu)由單鏈線性轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以反轉(zhuǎn)錄和共價(jià)鍵形成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA能夠作為微小RNA（miRNA）的內(nèi)源性競爭RNA（ceRNA），與mRNA競爭性地結(jié)合miRNA的位點(diǎn)，通過促進(jìn)或抑制mRNA的表達(dá)，調(diào)控AIS的生理功能［6］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高通量測序發(fā)現(xiàn)circRNA有作為AIS生物標(biāo)志物的潛力［7-8］。本文現(xiàn)圍繞上述內(nèi)容綜述如下。

1 circRNA作為ceRNA調(diào)控AIS的生理和病理過程

Salmena等［9］提出ceRNA調(diào)控基因表達(dá)的假說，認(rèn)為通過miRNA反應(yīng)元件，ceRNA能形成一種大規(guī)模轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。circRNA作為一種ceRNA，在調(diào)控AIS的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、血腦屏障及神經(jīng)保護(hù)等生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1.1 circRNA作用于AIS的神經(jīng)細(xì)胞凋亡AIS的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)細(xì)胞凋亡失調(diào)有關(guān)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要機(jī)制，在腦缺血早期，缺血中心區(qū)的細(xì)胞死亡以壞死為主，而缺血半暗帶細(xì)胞仍有代謝活力，可以持續(xù)數(shù)個(gè)小時(shí)，其后續(xù)死亡則以神經(jīng)細(xì)胞凋亡為主［10-11］。因此抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡對減少AIS的梗死面積和改善其預(yù)后十分重要。

Liu等［12］發(fā)現(xiàn)circ_0007865作為miR-214-3p的ceRNA可調(diào)控FK506結(jié)合蛋白5（FKBP5）的表達(dá)，沉默circ_0007865可以通過調(diào)控miR-214-3p/FKBP5軸，促進(jìn)氧糖剝奪（OGD）處理的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、血管生成和抑制細(xì)胞凋亡，可能為AIS的治療靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)敲低circ-Memo1可調(diào)控miR-17-5p/非七激酶子同源物1（SOS1）信號通路，降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減輕腦缺氧再復(fù)氧的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［13］。生長分化因子11（GDF11）是轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）超家族成員，通過結(jié)合TGF-β的Ⅰ和Ⅱ受體來激活重組人SMAD家族成員3（Smad3）信號通路，進(jìn)一步過表達(dá)Smad3蛋白來抑制腦缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，對神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用［14］。Chen等［15］發(fā) 現(xiàn)circUCK2作 為 內(nèi) 源 性miR-125b-5p的ceRNA，過表達(dá)circUCK2可調(diào)控miR-125b-5p/GDF11途徑，激活下游的TGF-β/Smad3信號通路，可提高小鼠海馬神經(jīng)元存活率，改善OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷。HECT結(jié)構(gòu)域E3泛素蛋白連接酶1（HECTD1）在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞［16］和小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞［17］的凋亡中發(fā)揮著重要作用。Chen等［18］發(fā)現(xiàn)circDLGAP4可通過充當(dāng)miR-143的ceRNA來激活HECTD1的表達(dá)，過表達(dá)circDLGAP4會提高HECTD1的活性，從而調(diào)節(jié)腦缺血后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞遷移，對腦缺血/再灌注損傷的修復(fù)起關(guān)鍵作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)外泌體circSHOC2作為miR-7670-3p的ceRNA，增強(qiáng)circSHOC2可提高去乙?；?（SIRT1）的表達(dá)來調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡，推測circSHOC2/miR-7670-3p/SIRT1軸可能是AIS潛在治療靶點(diǎn)［19］。

1.2 circRNA作用于AIS的血腦屏障（BBB）BBB是大腦和外周循環(huán)之間的重要屏障，能嚴(yán)格調(diào)節(jié)血液和大腦間的營養(yǎng)交換和信息轉(zhuǎn)導(dǎo)，以維持對神經(jīng)元回路、突觸傳遞和神經(jīng)發(fā)生精確控制的微環(huán)境［20］。AIS損傷后，BBB會被破壞，導(dǎo)致繼發(fā)性腦水腫、毛細(xì)血管收縮和血流阻塞［21］，更為嚴(yán)重的是限制組織型纖溶酶原激活劑溶栓治療［22］，造成AIS預(yù)后不良，因此保護(hù)BBB是治療AIS的重要策略。

有研究者通過對腦缺血小鼠circRNA的高通量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，血小板源性生長因子（PDGF）和趨化因子通路等對非破壞性腦缺血刺激有重要作用［23］。抑制PDGF通路的PDGF受體α和PDGF-CC的表達(dá)可降低腦血管通透性以及限制炎性細(xì)胞進(jìn)入大腦［24-25］，表明circRNA可能通過調(diào)控PDGF通路調(diào)節(jié)腦缺血的血管生成、免疫反應(yīng)和神經(jīng)血管保護(hù)來影響B(tài)BB的完整性。沉默miR-143可增強(qiáng)凋亡調(diào)節(jié)因子（PUMA）的活性來激活p53和核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路以保護(hù)BBB的完整性［26］。在短暫性大腦中動脈閉塞（tMCAO）的小鼠模型及AIS患者血漿中發(fā)現(xiàn)circDLGAP4的表達(dá)水平顯著下降，同時(shí)miR-143表達(dá)升高，circDLGAP4是miR-143的ceRNA，過表達(dá)circDLGAP4可通過調(diào)控miR-143顯著增加HECTD的表達(dá)，從而減少神經(jīng)元和BBB損傷，降低梗死面積［27］，表明circDLGAP4可以作為急性腦損傷新的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。

1.3 circRNA作用于AIS的自噬作用自噬是細(xì)胞中一種高度保守的分解代謝途徑，其可通過溶酶體消化來降解蛋白質(zhì)和恢復(fù)受損的細(xì)胞器［28］。自噬在腦缺血損傷后會被激活［29］，可保護(hù)神經(jīng)元免受炎癥侵襲［30］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)circRNA在調(diào)控腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞自噬中起關(guān)鍵作用［31］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的細(xì)胞類型，通過接觸、相互作用來影響神經(jīng)細(xì)胞功能，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用［32］。研究表明自噬可提高星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減輕腦梗死，改善神經(jīng)系統(tǒng)評分［33］。Han等［34］發(fā)現(xiàn)tMCAO小鼠模型的腦缺血組織和AIS患者的血漿中circHECTD1的表達(dá)均上調(diào)，circHECTD1作為miR-142的ceRNA，敲除circHECTD1可調(diào)控miR-142來抑制TCDD誘導(dǎo)多聚核糖聚合酶（TIPARP）的表達(dá)，從而激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和誘導(dǎo)自噬，表明circHECTD1可以作為腦缺血誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的新生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。哺乳動物體內(nèi)的SIRT1能夠調(diào)節(jié)多種與自噬和增殖有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及活性［35］。研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血期間，circSHOC2作 為miR-7670-3p的ceRNA，增 強(qiáng)circSHOC2的表達(dá)能夠調(diào)控miR-7670-3p/SIRT1軸誘導(dǎo)自噬，從而抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)元損傷，有助于AIS治療［19］。

1.4 circRNA作用于AIS的神經(jīng)保護(hù)缺血半暗帶、梗死周圍區(qū)域擴(kuò)大和腦缺血/再灌引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)可以延遲數(shù)小時(shí)至數(shù)天，由此在使用溶栓法的基礎(chǔ)上，盡早實(shí)施神經(jīng)保護(hù)可以降低腦損傷，使AIS患者獲得最大的治療效益［36］。

在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和小鼠多巴胺能神經(jīng)元中，過表達(dá)circDLGAP4能夠提高miR-134-5p/環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）通路中的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、B細(xì)胞淋巴瘤2和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α的表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［37］。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3（TRAF3）是腫瘤壞死因子受體家族成員之一，其在腦缺血再灌注損傷時(shí)表達(dá)水平顯著升高，可加重神經(jīng)元損傷，擴(kuò)大腦梗死面積，抑制TRAF3表達(dá)對MCAO小鼠的腦組織具有神經(jīng)保護(hù)作用［38］。miR-133b是多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的外泌體分泌的一種miRNA，過表達(dá)miR-133b可改善腦卒中后的神經(jīng)可塑性和促進(jìn)腦功能恢復(fù)［39］。在OGD誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元和鼠MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，circHECTD1和TRAF3表達(dá)顯著上調(diào)，miR-133b表達(dá)明顯下調(diào)，通過敲低circHECTD1靶向調(diào)控miR-133b來抑制TRAF3的表達(dá)，從而減弱由腦缺血引起的神經(jīng)元損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用［40］。此外，在局灶性腦缺血再灌注的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腦組織中circTLK1的水平顯著增加，circTLK1作為 內(nèi)源性miR-335-3p的ceRNA能夠抑制miR-335-3p活性，導(dǎo)致TIPARP表達(dá)增加，隨后加重神經(jīng)元損傷，而敲除circTLK1后，能夠顯著降低梗死體積，減少神經(jīng)元損傷，改善受損神經(jīng)功能［41］，表明circTLK1的調(diào)控對AIS的神經(jīng)元損傷發(fā)揮關(guān)鍵作用。Qiu等［42］發(fā)現(xiàn)circDLGAP4可作為miR-503-3p海綿，過表達(dá)circDLGAP4可提高神經(jīng)元生長調(diào)節(jié)因子1的表達(dá)，從而減輕腦缺血期間的神經(jīng)元損傷，為腦缺血提供一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。

綜上，敲低或過表達(dá)circRNAs可調(diào)節(jié)與miRNAs的結(jié)合位點(diǎn)，由此干預(yù)下游相關(guān)蛋白的表達(dá)，能夠修復(fù)細(xì)胞功能，改善神經(jīng)元損傷，減輕神經(jīng)功能缺陷。此外，除充當(dāng)ceRNA外，circRNA還具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控及RNA結(jié)合蛋白的作用［43-44］，今后可在circRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控及RNA結(jié)合蛋白的功能上探討對AIS發(fā)生發(fā)展的機(jī)制影響。

2 circRNA對AIS臨床診斷及預(yù)后的意義

circRNAs的熒光定量PCR和高通量測序的快速發(fā)展對探索易于獲得和快速測量的具有AIS診斷潛力的生物標(biāo)志物具有重要意義。Peng等［45］發(fā)現(xiàn)，AIS患者外周血單核細(xì)胞中circHECTD1表達(dá)水平高于正常人，此外，受試者工作特征（ROC）曲線顯示，circHECTD1表達(dá)可用于區(qū)分AIS患者與健康人，曲線 下 面 積（AUC）為0.814；在AIS患 者 中，circHECTD1的表達(dá)與NIHSS評分、CRP和炎性細(xì)胞因子呈正相關(guān)，揭示了circHECTD1作為AIS診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力。Zhu等［46］研究170例AIS患者和170例健康人外周血單核細(xì)胞和血清中的circDLGAP4和miR-143，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，AIS患者外周血單核細(xì)胞和血清circDLGAP4表達(dá)下調(diào)，而circDLGAP4的表達(dá)與miR-143呈負(fù)相關(guān)，ROC曲線分析顯示，circDLGAP4表達(dá)的AUC為0.816，對于評估AIS風(fēng)險(xiǎn)具有較好的價(jià)值;相關(guān)分析表明，AIS患者的circ DLGAP4表達(dá)與NIHSS評分和CRP水平呈負(fù)相關(guān)；此外，circDLGAP4水平也與血清中TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-8和IL-22的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明circDLGAP4可作為診斷AIS的新生物標(biāo)志物。

Zuo等［47］發(fā) 現(xiàn)，AIS患 者 與 健 康 人 比 較circFUNDC1、circPDS5B、circCDC14A的表達(dá)水平升高，circPDS5B在淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞中增加，而circCDC14A僅在粒細(xì)胞中升高，3個(gè)circRNAs聯(lián)合診斷AIS的AUC為0.875，特異度為0.910，敏感度為0.715，且3個(gè)circRNAs的表達(dá)水平均與梗死體積呈正相關(guān)，表明3種circRNAs的聯(lián)合可作為診斷和預(yù)測AIS的生物標(biāo)志物。

3 總結(jié)與展望

circRNA作為ceRNA能夠調(diào)控AIS的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、血腦屏障及神經(jīng)保護(hù)等生物學(xué)功能，且circRNA與AIS的梗死面積、炎癥反應(yīng)以及功能障礙程度密切相關(guān)，有望為防治該疾病的新藥篩選、設(shè)計(jì)或基因治療提供新的途徑和思路。盡管目前ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作用于AIS的研究較多，但仍存在問題：首先，AIS的機(jī)制較為復(fù)雜，且非編碼RNA作用的靶點(diǎn)有多個(gè)，存在多個(gè)通路之間相互串?dāng)_問題；其次，目前關(guān)于circRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控均為AIS的細(xì)胞和動物的研究，缺乏臨床樣本研究，仍需進(jìn)行臨床研究，探討circRNA介導(dǎo)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在AIS的診斷及預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值。