貝類原肌球蛋白致敏性消減技術(shù)研究進展

陳雅純，郭明珠，王利文，桑亞新，孫紀錄

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

貝類是指任何可食用的海洋無脊椎動物，包括甲殼類和軟體動物[1]。甲殼類屬于節(jié)肢動物門，有對蝦、龍蝦和螃蟹等；軟體動物屬于軟體動物門，是除節(jié)肢動物外最大的類群，有雙殼類（蛤蜊、扇貝、貽貝、牡蠣）、腹足類（蝸牛、鮑魚）和頭足類（魷魚、章魚）[2]。近年來，由貝類引起的過敏事件占所有食物過敏病例的90%以上，影響高達10.3%的總?cè)丝?，?gòu)成世界范圍內(nèi)日益嚴重的公共衛(wèi)生問題[3-5]。據(jù)統(tǒng)計[6]，在亞洲貝類過敏癥的患病率普遍較高，兒童食物過敏人群中，甲殼類產(chǎn)品引發(fā)的過敏反應(yīng)占39%，魚類占13.2%；而在成人中，甲殼類和軟體類水產(chǎn)品的過敏反應(yīng)引發(fā)率分別為33.8%、18.9%。我國是貝類生產(chǎn)和消費大國，近年來由食用貝類引發(fā)的食物過敏問題日益增多，貝類過敏不同于牛奶、雞蛋等好發(fā)于嬰幼兒的致敏食物，由貝類引起的食物過敏好發(fā)于成人，易引起皮膚紅腫、鼻炎、哮喘等癥狀[7]。這種過敏不會獲得自然耐受性[8]，通常會持續(xù)終生。由此可見，貝類引發(fā)的食物過敏是需重視的食品安全問題。

目前，貝類已有多種蛋白被鑒定為食物致敏原。其中，最主要致敏原為原肌球蛋白，其他致敏原有精氨酸激酶、肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白、肌球蛋白輕鏈以及新型致敏原磷酸丙糖異構(gòu)酶、細絲蛋白C等[9]。對于貝類過敏患者來說，避免進食相關(guān)的致敏原是預(yù)防過敏最安全有效的措施，但這使患者不能隨心享受各種食品，同時有可能導(dǎo)致營養(yǎng)成分失衡[10]。因此，消減貝類主要致敏原致敏性技術(shù)對過敏人群和食品工業(yè)至關(guān)重要。本文詳細介紹了貝類主要致敏物質(zhì)原肌球蛋白，重點整理了原肌球蛋白致敏性消減技術(shù)，并提出未來解決貝類致敏原的需求和挑戰(zhàn)，為深入研究貝類原肌球蛋白、開發(fā)低致敏或脫敏產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)，以便最大限度地開發(fā)貝類的營養(yǎng)價值，最大限度地減少過敏的不利影響。

1 原肌球蛋白概況

原肌球蛋白（tropomyosin，TM）是貝類的主要致敏蛋白，廣泛存在于甲殼類水產(chǎn)品和蛤蜊、貽貝等軟體動物的肌肉或非肌肉組織中。TM是由兩個相同的α-螺旋結(jié)構(gòu)相互交織形成的超螺旋結(jié)構(gòu)，包括7個肌動蛋白結(jié)合位點，主要功能是促進肌鈣蛋白和肌動蛋白在橫紋肌細胞中的相互作用，調(diào)節(jié)肌肉組織收縮[11]。TM是一種酸性糖蛋白質(zhì)，含有276個～284個氨基酸殘基，相對分子量為34 kDa～38 kDa，耐高溫且軟體動物的TM具有抗消化性[12]。目前，多種貝類TM已被分離鑒定出來，其中包括凡納濱對蝦（Litopenaeus Vannamei）[13]、褐美對蝦（Penaeus aztecus）[14]和太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）[15]等，分離出的致敏原TM分別命名為 Lit v 1、Pen a 1、Pen m 1、Pen b 1 和 Cra g 1 等。TM 之間的氨基酸序列同源性很高，在軟體動物中不同種類軟體動物之間TM的同源性為70%～80%，與甲殼類TM的同源性為63%～64%，以至于很多對軟體動物過敏人群在攝入甲殼類動物時也會發(fā)生過敏反應(yīng)[16-17]。貝類引起的過敏反應(yīng)屬于特異性IgE抗體介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)，過敏反應(yīng)機理如圖1所示。

圖1 貝類過敏反應(yīng)機理Fig.1 Mechanism of allergic reaction in shellfish

近年來，國內(nèi)外研究學(xué)者不斷改進TM純化方法，減少了復(fù)雜、耗時的層析過程。傅玲琳等[18]用硫酸銨沉淀、結(jié)合等電點、加熱的方法純化了南美白對蝦TM，經(jīng)測定其質(zhì)量濃度最高可達 43 μg/μL；Xu 等[19]研究了一種硫酸銨與等電沉淀相結(jié)合的非熱技術(shù)來提取純化魚、蝦和蛤蜊中的TM；Chinnappan等[20]利用硫酸銨沉淀法從黑虎對蝦和牡蠣中提取純化TM。

2 原肌球蛋白致敏性的消減技術(shù)

由于貝類食品過敏事件的影響，研究人員一直在尋找新的食品加工技術(shù)來消減食品的致敏性，以便貝類食品經(jīng)過適當加工可以為過敏人群所食用。目前，用于消減TM致敏性的技術(shù)主要分為物理、化學(xué)、發(fā)酵和組合消減法。物理法，如熱處理、高靜水壓、超聲波和輻照，是研究和使用最廣泛地消除TM的食品加工方法，具有無殘留、風味損失和質(zhì)地變化小、成本相對較低的優(yōu)點[21]；化學(xué)法，如美拉德反應(yīng)或酶法，是通過化學(xué)手段影響TM分子中的氨基、羧基、巰基和酰胺鍵等基團，改變蛋白的靜電荷、疏水基團及其空間結(jié)構(gòu)，從而影響其致敏性[10]；乳酸菌發(fā)酵法，隨著近幾年食品生物技術(shù)的發(fā)展，也越來越多地用于貝類致敏蛋白的消減；組合消減法結(jié)合多種食品加工方法，有協(xié)同或強化效果，能有效降低致敏性[22]。各種技術(shù)方法實行的關(guān)鍵因素、優(yōu)點和缺點見表1。

表1 原肌球蛋白致敏性消減技術(shù)比較Table 1 Comparison of allergenic subtraction technologies of tropomyosin

2.1 物理法

2.1.1 熱處理

熱處理是一種常見的食品加工方法，操作簡單且成本低，但TM具有熱穩(wěn)定性，傳統(tǒng)的熱處理很難降低它的致敏性，并且加熱可能產(chǎn)生新的抗原表位或使掩藏的表位暴露，使致敏性增加。如Fang等[23]通過煮沸和焙烤的方式加熱處理牡蠣主要致敏原Cra g 1（TM），結(jié)果表明加熱后的Cra g 1比對照樣品產(chǎn)生更高的IgE反應(yīng)活性，這可能是由于加熱導(dǎo)致蛋白聚合物的形成。

然而，新的熱處理方法在某些情況下是有效的，例如電介質(zhì)加熱。電介質(zhì)加熱是電磁波加熱電介質(zhì)材料的過程。根據(jù)頻率的不同，介質(zhì)加熱可分為射頻加熱（10 MHz～50 MHz）和微波加熱（＞100 MHz）。目前，只有微波被廣泛研究用于消減TM的致敏性，因為它具有更高的效率和更強的蛋白質(zhì)變性潛力[24]。利用微波加熱處理蝦蟹可降解致敏原TM，使致敏性輕微降低，但效果有限并不適合實際應(yīng)用[25]。

因此，由于TM的熱穩(wěn)定性，采用單一的熱處理對過敏原的消減效果一般，且會影響其原有的營養(yǎng)與風味價值[26]，熱處理聯(lián)合其他消減技術(shù)可能更適合于TM的消減。熱處理使用的溫度比較極端，會破壞蛋白質(zhì)并引發(fā)不良變化，導(dǎo)致食品營養(yǎng)損失和風味變差，所以不推薦熱處理作為消除貝類過敏原的首選方法。

2.1.2 高靜水壓

高靜水壓（high hyperbaric pressure，HHP）是一種新型的非熱脫敏技術(shù)，對貝類感官和營養(yǎng)特性的影響最小。HHP與逐漸散熱的熱處理不同，不考慮食品材料的尺寸和形狀，100 MPa～1 000 MPa的壓力以均勻的方式快速分布在整個食品中[27]。HHP只影響非共價鍵（如離子鍵、氫鍵和疏水鍵）。由于TM的一級結(jié)構(gòu)是通過共價鍵連接的氨基酸序列，它們受高壓的影響極??；而二級結(jié)構(gòu)是通過分子內(nèi)或分子間氫鍵形成α-螺旋或β-折疊的多肽鏈組成，其中氫鍵和鹽橋的斷裂會受到HHP處理的影響；HHP也極大地影響TM的三級和四級結(jié)構(gòu)，因為它們是由非共價鍵維持的[28]。TM的破壞程度取決于所施加壓力的大小[29]，采用低壓處理時，一級結(jié)構(gòu)會發(fā)生可逆性展開，二級結(jié)構(gòu)中由氫鍵引起的壓縮會導(dǎo)致蛋白構(gòu)象變化，三級結(jié)構(gòu)和其他分子間相互作用的變化發(fā)生在200 MPa，四級結(jié)構(gòu)在150 MPa～200 MPa的壓力水平下會發(fā)生變化，將壓力進一步增加到500 MPa時蛋白質(zhì)展開形成生物大分子特有的無序結(jié)構(gòu)。

HHP能有效降低原肌球蛋白的致敏性。Jin等[30]利用HHP技術(shù)研究了新鮮魷魚TM的結(jié)構(gòu)和致敏性變化，當壓力從200 MPa增加到600 MPa時，TM中的α-螺旋逐漸減少，在600 MPa時約有53%的α-螺旋轉(zhuǎn)化為β-折疊和無規(guī)則卷曲，根據(jù)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗得出，400 MPa和600 MPa要比200 MPa降低致敏性的效果好，并且提高了魷魚TM的消化率。李正龍[31]考察了超高壓對鰻魚原肌球蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示在 200 MPa～400 MPa壓力下，β-折疊轉(zhuǎn)化為 β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲，在500 MPa和600 MPa下，α-螺旋展開轉(zhuǎn)化為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，隨著壓力強度的增加，鰻魚TM表面疏水性不斷增加，巰基含量不斷降低，這表明較高的壓力可以更顯著地改變TM結(jié)構(gòu)。由此可見，HHP通過破壞蛋白質(zhì)的弱鍵改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性或失活，使TM致敏性消減，同時對食品品質(zhì)損失較小，因而，HHP是有潛力和發(fā)展前途的致敏性消減技術(shù)[32]。

2.1.3 超聲波

超聲波被定義為使用頻率大于20 kHz的聲波，根據(jù)超聲強度的不同分為高強度（低頻）超聲（＞10 W）和低強度（高頻）超聲（＜1 W）[33]，其中常用于食品加工的是高強度超聲（high intensity ultrasound，HIU）[34]。HIU是依靠介質(zhì)傳播的彈性機械波，介質(zhì)中的粒子在超聲波傳遞過程中產(chǎn)生劇烈機械振動，引起介質(zhì)間的空化和機械作用[35]，產(chǎn)生局部高壓和高溫，破壞非共價鍵，二級結(jié)構(gòu)發(fā)生無序變化，導(dǎo)致致敏蛋白發(fā)生構(gòu)象變化，進而影響致敏性。與其他物理改性技術(shù)相比，HIU能大幅度提高處理質(zhì)量、速度和效率，還有成本低、操作簡單、污染小等優(yōu)點。

HIU在消減TM致敏性的方面有著令人滿意的效果。HIU依靠處理時間來影響整個蝦提取物和原肌球蛋白的致敏性。Dong等[36]評估HIU處理對蝦樣品的理化和致敏特性的影響，發(fā)現(xiàn)致敏性隨著時間的增加而降低，并且在20 min時表現(xiàn)出最佳的降敏效果，TM減少了76%，20 min后觀察到更多的碎片、條帶和孔洞，這表明HIU對TM降解有顯著影響。Zhang等[37]探究了HIU功率的影響，15 min的條件下，功率由100 W到800 W，α-螺旋含量降低，β-折疊、β-轉(zhuǎn)彎和無規(guī)則卷曲含量增加，較強的HIU可破壞TM結(jié)構(gòu)，增強TM的胃腸道消化率，使TM和消化產(chǎn)物的致敏性降低到較低水平。PANIWNYK等[38]研究了HIU對蝦TM與IgE結(jié)合能力的影響，分別在0℃和50℃下用HIU（30 Hz，800 W）處理1.5 h，發(fā)現(xiàn)在50℃下蝦的致敏性顯著低于0℃處理和未處理的蝦，這說明超聲溫度對TM消減效果也有一定影響。因而，超聲處理的效果與功率強度、時間和控制溫度緊密相關(guān)，也有許多研究證明[39]，超聲結(jié)合酶解、加熱或美拉德反應(yīng)脫敏效果更好。

2.1.4 輻照

輻照（irradiation）是利用電離放射性輻射源60Co、137Cs產(chǎn)生的γ-射線或電子加速器產(chǎn)生的電子束對食品進行電離輻射的過程[40]。輻照會產(chǎn)生自由基，自由基容易引起蛋白質(zhì)斷裂和聚集，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)改變，破壞TM與IgE的結(jié)合表位[41]，從而使TM的致敏性降低。一般來說，中等劑量（1 kGy～10 kGy）常用于對易腐食品（如水果和蔬菜）進行巴氏殺菌，當輻照劑量高達10 kGy時，可以有效破壞過敏原的抗體結(jié)合表位。Muanghorn等[42]用60Co處理羅氏沼蝦，發(fā)現(xiàn)在10 kGy和15 kGy下，TM條帶密度明顯降低。Liu等[43]采用10 kGy劑量的電子束輻照處理蝦，結(jié)果顯示蝦TM與IgE結(jié)合能力減少約20%。Mei等[44]研究了劑量為1 kGy～9 kGy的電子束輻照對蟹肉中IgG結(jié)合能力和TM結(jié)構(gòu)的影響，隨著劑量的增加，α-螺旋含量降低，巰基含量降低，表面疏水性顯著增加。輻照能有效改變TM的二、三級結(jié)構(gòu)，受TM熱穩(wěn)定性的影響不大，安全性好，其中電子束輻射不需要使用放射性元素，比γ-射線更安全，更容易被消費者接受，目前還未有輻照處理食品產(chǎn)生有害物質(zhì)的報道，但過高劑量的輻照會使氨基酸殘基氧化、斷裂，改變生物大分子的功能完整性[45]。

2.2 化學(xué)法

2.2.1 美拉德反應(yīng)

美拉德反應(yīng)是指蛋白中的氨基（主要來自含ε-氨基的賴氨酸）與羰基（主要來自還原糖）發(fā)生的非酶促化學(xué)反應(yīng)[46]。美拉德反應(yīng)通過引入還原糖使目的蛋白增加糖鏈，進而修飾TM上與IgE結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸表位[47]。國內(nèi)外許多研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)對TM致敏性的消減程度主要取決于所用還原糖的種類和環(huán)境條件。采用果糖和木糖與對蝦TM發(fā)生美拉德反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)TM的致敏性并沒有降低[48]，而以葡萄糖為底物會顯著降低TM的致敏性。Zhang等[49]發(fā)現(xiàn)TM與葡萄糖在37℃經(jīng)糖化反應(yīng)18 h后，α-螺旋含量大幅下降，賴氨酸的含量降低了55%，TM結(jié)構(gòu)的改變使其致敏性顯著降低。Fu等[50]利用核糖、低聚半乳糖和低聚殼聚糖與TM進行美拉德反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)TM被糖基化后其致敏性均顯著降低，致敏性最高可降低60%。藺海鑫等[51]利用核糖與菲律賓蛤仔TM反應(yīng)12 h，產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力下降76.2%，α-螺旋含量下降了71.7%，蛋白表面疏水性增加了192%，有效賴氨酸含量降低了45.5%，試驗發(fā)現(xiàn)4 h的反應(yīng)時間就能改變菲律賓蛤仔TM的結(jié)構(gòu)，使其致敏性降低。此外，美拉德反應(yīng)過程中可能會形成新的致敏化合物或新的過敏原。Nakamura等[52]發(fā)現(xiàn)扇貝TM被葡萄糖、果糖或麥芽糖糖基化后，其與IgE抗體的結(jié)合能力增強。因此，美拉德反應(yīng)可以有效消除貝類TM，但需要選擇合適的還原糖和反應(yīng)條件（如時間、溫度）來增強其消減效果。

2.2.2 酶法

酶法是消減過敏原致敏性中應(yīng)用最為廣泛的方法。首先，蛋白酶可以將TM水解成多肽或氨基酸等小分子物質(zhì)，從而破壞其線性表位和空間結(jié)構(gòu)，降低TM致敏性[53]。Mejrhit等[54]研究發(fā)現(xiàn)TM在人工胃液中極其不穩(wěn)定，在胃蛋白酶水解作用下，IgE的結(jié)合能力下降。同時，王學(xué)麗等[55]模擬了TM的胃腸消化，采用質(zhì)譜技術(shù)分析消化產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)胃腸消化2 h后，仍存少許不被破壞的抗原表位，但胃蛋白酶破壞了TM大部分的抗原表位，有效地影響TM的致敏性。Lasekan[56]用堿性蛋白酶和植物蛋白酶處理蝦樣后發(fā)現(xiàn)只有堿性蛋白酶顯著降低了TM的IgE免疫活性。其次，TM在酶的作用下發(fā)生分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)反應(yīng)，促使TM交聯(lián)聚合，從而使抗原表位隱藏在內(nèi)部，致敏性也隨之改變[57]。Liu等[58]將辣根過氧化物酶與蟹TM交聯(lián)，發(fā)現(xiàn)交聯(lián)產(chǎn)物可改善小鼠的致敏癥狀，顯著降低其體內(nèi)的特異性IgE水平，這是因為酶可通過影響TM的結(jié)構(gòu)，改變抗原的遞呈方式，誘導(dǎo)致敏小鼠產(chǎn)生對TM的口服耐受性。當轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與酪氨酸酶聯(lián)合使用時，也可顯著降低蝦TM的致敏性[59]。酶法具有高效和環(huán)保性，但也有很強的特異性，與所選酶的種類、溫度和pH值有關(guān)，單一使用酶法大多會產(chǎn)生苦味肽，對貝類食品風味產(chǎn)生影響，組合其他技術(shù)使用效果更佳。

2.3 發(fā)酵法

乳酸菌是人體腸道中必不可少的一種有利于身體健康的益生菌，研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵可以解離蛋白物質(zhì)，破壞致敏蛋白的結(jié)構(gòu)和線性表位，導(dǎo)致致敏性隨之改變。王夢夢等[60]在37℃條件下對小龍蝦進行發(fā)酵加工處理，結(jié)果表明TM含量和免疫活性均降低。傅玲琳等[61]通過體外實驗研究5種乳酸菌對小鼠致敏性的影響差異，發(fā)現(xiàn)其中芽孢乳酸菌09.712對小鼠的抗過敏能力最強。肖葉等[62]探究了乳酸菌（植物乳桿菌）對過敏原TM免疫活性的影響，結(jié)果表明不同提取物水解TM48 h后，植物乳桿菌各成分提取物都會較大程度改變TM的二級結(jié)構(gòu)并破壞其致敏表位，其中菌體對TM致敏性的消減率最高（76.9%），此外，研究發(fā)現(xiàn)氨基可能是植物乳桿菌消減TM致敏性的一個重要作用位點。經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)[63]，乳酸菌還可以改善腸道菌群狀態(tài)，調(diào)節(jié)炎癥因子的釋放，增強機體對外來致敏食物的免疫力，進而改善機體的過敏癥狀。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)法相比，發(fā)酵法在降低致敏性的同時，還能改善水產(chǎn)品的營養(yǎng)風味。因此，對于貝類食物過敏癥患者來說，食用發(fā)酵食品是一種較好的選擇。

2.4 組合消減法

單一的先進加工技術(shù)雖然是直接消除貝類食品致敏性的方法，但是多種方法的組合可以彌補單一加工技術(shù)處理的不足，使消減效果得到強化。此外，組合消減法還需要盡可能地實現(xiàn)防止食品質(zhì)地、營養(yǎng)、風味遭到破壞和保障食品質(zhì)量安全的目標。表2整理了近幾年有關(guān)TM的組合消減研究。

表2 組合消減法對貝類TM影響的研究Table 2 Study on the effect of combinatorial subtraction on shellfish TM

3 展望

隨著由誤食貝類引發(fā)的食物過敏問題日益增多，人們對過敏性疾病越來越重視，有關(guān)貝類主要過敏原TM的研究也越來越深入，但仍存在許多的問題，還需針對不同問題做進一步研究。

首先，目前針對貝類致敏原的研究主要集中在甲殼類和致敏原TM上，其他致敏原也有較高致敏性，應(yīng)加強對軟體動物及次要致敏原的研究；其次，消減貝類主要過敏原TM處在研究階段，由于設(shè)備條件的影響以及技術(shù)對食品品質(zhì)的影響，未曾實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，故試驗研究應(yīng)向產(chǎn)業(yè)發(fā)展靠攏；同時，許多研究都是建立在對已分離純化的TM直接消減的基礎(chǔ)上，并沒有考慮整體組織中的其他因素是否對消減TM致敏性有影響，故采用整體原料消減其致敏性的研究很有必要；最后，探究多種加工方法組合消減貝類TM致敏性，最大程度降低或者消除食物致敏性并最大限度保留貝類的風味和營養(yǎng)品質(zhì)，以便未來越來越多的消費者可以將貝類作為一種容易獲得的、更健康的和可持續(xù)的營養(yǎng)來源享用。